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1 LA TECNOLOGIA DEI MICROARRAYS 1

2 8 anni dopo: 4162 riferimenti bibliografici sui microarrays I microarrays misurano il livello di espressione degli mrna trascritti dai geni del sistema biologico di interesse 2

3 USI ED APPLICAZIONI DEI MICROARRAYS MARCATURA DIRETTA DEI cdna 3

4 Come funziona la fluorescenza Misurazione della fluorescenza 4

5 I fluorocromi più utilizzati nell ibridazione dei microarrays Limiti di sensibilità dei diversi metodi di marcatura dei cdna target 5

6 COME FUNZIONANO I MICROARRAYS COME FUNZIONANO I MICROARRAYS 6

7 COME FUNZIONANO I MICROARRAYS ANALISI DEI MICROARRAYS DOPO IBRIDAZIONE 7

8 ANALISI DEI MICROARRAYS DOPO IBRIDAZIONE Key Steps nell applicazione di microarray Design sperimentale Esperimenti di Microarray Ad esempio, identificazione dei markers del carcinoma mammario Raccogliere dati tramite microarray in tessuto normale ed in tessuti affetti da tumore Image Processing Normalizzazione dei dati Analisi dei dati 8

9 Microarray Gene Chips Esistono due tipi di microarrays: full-length cdna chips (ad esempio, chips creati in laboratori attrezzati partendo da library di cloni) oligo chips (ad esempio Gene Chips Affymetrix) Microarray Gene Chips 9

10 Ibridazione specifica tra due molecole di DNA Ibridazione specifica tra due molecole di DNA 10

11 L intensità della fluorescenza emessa dalle molecole ibridizzate alle sonde riflette l abbondanza delle molecole di mrna nel sistema biologico che si sta analizzando. Esempio: L intensità dello spot corrispondente al gene A è pari a 100 Unità nel tessuto normale L intensità dello spot corrispondente al gene A è pari a 50 unità nel tessuto canceroso Conclusione: Il livello di espressione del gene A nel tessuto normale è significativamente più elevato che nel tessuto canceroso. Identificazione dei geni espressi a livelli differenti nei due sistemi biologici in esame: Vi sono diversi fattori non biologici che possono influenzare I valori di intensità su un microarray, come ad esempio il background. I livelli di espressione genica sono spesso di natura stocastica, e quindi possono variare anche in condizioni molto simili Per rilevare in maniera accurata quali geni sono espressi a livelli diversi, sono necessarie misure multiple nelle stesse condizioni Esempio: GENE A {10, 20, 15, 25, 15} versus {18, 27, 15, 10, 15} GENE B {100, 120, 134, 90, 105} versus {40, 27, 32, 38, 41} Sono espressi in maniera differente nei due tessuti? 11

12 Identificazione dei geni espressi a livelli differenti nei due sistemi biologici in esame: Esistono diversi metodi matematici per determinae se un gene è espresso in maniera differente in diverse condizioni. Il più semplice è calcolare la media dei valori risultanti da diversi esperimenti ripetuti e poi calcolare il rapporto tra essi ed ottenere il fold-change. Il metodo più preciso, anche se più complesso, consiste nel calcolare non solo la media dei valori, ma anche la deviazione standard nel contesto di processi stocastici (T-test). Identificazione dei geni espressi a livelli differenti nei due sistemi biologici in esame: Esempio: GENE A {10, 20, 15, 25, 15} versus {18, 27, 15, 10, 15} Media ± s.d. : 17 ± 5,7 versus 17 ± 6,8 GENE B {100, 120, 134, 90, 105} versus {40, 27, 32, 38, 41} Media ± s.d. : 109 ± 17,3 versus 35,6 ± 5,9 Fold-change: 109 / 35,6 = 3 Il gene B è 3 volte più espresso in un sistema biologico rispetto all altro. La differenza di espressione è significativa. 12

13 GeneChip Affymetrix 13

14 GeneChip Affymetrix Nei GeneChip Affymetrix viene utilizzato crna marcato con biotina. E quindi necessario utilizzare due diversi chips per i due campioni di RNA da confrontare ed è necessaria una elevata quantità di RNA da marcare. 14

15 Nei GeneChip Affymetrix la sintesi delle sonde oligonucleotidiche avviene direttamente sul vetrino tramite FOTOLITOGRAFIA e CHIMICA COMBINATORIALE PROTOCOLLO DI AMPLIFICAZIONE DELL mrna SECONDO IL METODO DI J. EBERWINE PER OTTENERNE UNA QUANTITA SUFFICIENTE PER LA MARCATURA E LA SUCCESSIVA IBRIDAZIONE DI MICROARRAYS 15

16 RELATIVE CHANGES IN GENE ONTOLOGY CATEGORIES IN CAROTIDS HARVESTED 48 h AFTER ARTERIOTOMY GENE NUMBER UPREGULATION DOWNREGULATION 5 0 PROTEIN TURNOVER PROLIFERATION MARKERS DNA REPAIR Minimum fold-change: 1.5 p value < 0.01 e < STRESS DNA TRANSCRIPTION STRUCTURAL FILAMENTS ANTIGENS INFLAMMATION HORMONAL VESCICULAR TRANSPORT APOPTOSIS CYCLINS SIGNAL TRANSMISSION VALIDAZIONE DEI RISULTATI OTTENUTI TRAMITE MICROARRAYS I risultati significativi ottenuti tramite microarrays vanno convalidati tramite altre tecniche. La più utilizzata è la Reverse Transcription - Real Time PCR. Poiché le due tecniche hanno una diversa sensibilità, i valori di fold-change ottenuti possono essere diversi, ma, affinchè il dato sia confermato, il trend ottenuto tramite microarrays e Real Time PCR deve essere lo stesso. 16

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