Profilo di espressione genica nelle sindromi mielodisplastiche

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1 Profilo di espressione genica nelle sindromi mielodisplastiche Andrea Pellagatti LRF Molecular Haematology Unit John Radcliffe Hospital Oxford

2 Sindromi mielodisplastiche (MDS) - Gruppo eterogeneo di disordini clonali della cellula staminale ematopoietica - Midollo osseo ipercellulare, citopenia periferica, ematopoiesi inefficace, frequente evoluzione in leucemia mieloide acuta - Terapia di supporto (trasfusioni di sangue) ) e e la cura standard

3 MDS - scopi degli studi basati su profilo di espressione genica Profilo di espressione genica (GEP): uso di microarrays per misurare il livello di espressione di migliaia di geni in un signolo esperimento - Identificazione di geni differenzialmente espressi - Identificazione di pathways deregolati - Identificazione di nuovi marcatori diagnostici e prognostici,, e di bersagli terapeutici - Miglior comprensione della patofisiologia delle MDS

4 GEP in MDS le MDS sono molto eterogenee e includono pazienti con vari sottotipi e cariotipi e necessario studiare un ampio numero di pazienti per ottenere conclusioni solide sulla deregolazione dell espressione espressione genica

5 GEP nelle MDS primi studi Miyazato et al, Blood 2001: Hofmann et al, Blood 2002: Ueda et al, BJH 2003: Chen et al, Blood 2004: Sternberg et al, Blood 2005: 5 MDS 19 MDS 16 MDS 10 MDS 14 MDS

6 GEP su larga scala nelle MDS Pellagatti et al, Blood pazienti MDS e 11 controlli 183 pazienti MDS e 17 controlli cellule CD34+ separate da midollo osseo Campioni ibridizzati su Affymetrix GeneChip Human Plus 2.0 arrays (47,000 trascritti, 39,000 geni)

7 Affymetrix Microarrays 2x Biotin RT IVT Biotin Biotin Hybridize Scan Biotin Biotin CD34+ RNA totale cdna crna Affymetrix microarray Immagine

8 Analisi dei dati immagini dei microarrays acquisite e quantificate con GeneChip Operating Software (GCOS) normalizzazione e analisi dei dati con GeneSpring 7.3 software analisi dei pathways deregolati con Ingenuity Pathway Analysis software

9 Geni up-regolati 35 geni con ratio paziente / controlli > 2.0 in almeno 92 / 183 pazienti Affy ID Gene Localizzazione No. di pazienti con up-regolazione (>2-fold, N=183) _s_at IMP-3 7p _at IFIT1 10q25-q _x_at HBA2 16p _s_at DLK1 14q _x_at HBG1 ; HBG2 11p _at PTHR2 2q _s_at IFITM1 11p _at IFI44L 1p _at IFIT3 10q _x_at HBB 11p frequente up-regolazione nelle MDS di geni stimolati dall interferone (ISGs) analisi dei pathways: il pathway di trasduzione del segnale dell interferone e risultato quello piu significativamente deregolato (p= )

10 Livello di espressione di geni stimolati dall interferone (ISGs) i profili di espressione genica dei pazienti con MDS hanno caratteristiche comuni a quelli di cellule CD34+ normali stimolate con interferone gamma Zeng et al (Blood 2006) 22 ISGs up-regolati in cellule CD34+ normali stimolate con interferone gamma; 15 di questi 22 ISGs sono risultati up- regolati nel nostro gruppo di pazienti con MDS ISGs tra cui IFITM1 mediano gli effetti di inibizione della crescita derivanti dall interferone gamma l up-regolazione degli ISGs potrebbe essere alla base di alcune caratteristiche ematologiche delle MDS, quali le citopenie periferiche

11 Geni down-regolati 139 geni con ratio paziente / controlli < 0.5 in almeno 92 / 183 pazienti Affy ID Gene Localizzazion e No. di pazienti con down- regolazione (>2-fold, N=183) _s_at ARPP21 3p _at AKAP12/gravin 6q24-q _at P4HA2 5q _at P2RY14 3q21-q _at OR7A5 19p _s_at CD24 6q _at SH2D4B 10q _s_at LEF1 4q23-q _s_at CD79B 17q _at VPREB1 22q gravin e down-regolata in vari tipi di tumore tra cui prostata, mammella, oltre che MDS, AML, CML

12 MDS - progressione modello di trasformazione leucemica progressione step-wise RA RAEB I RAEB II AML mancanza di marcatori molecolari associati a prognosi e progressione della malattia

13 Clustering gerarchico RA-RAEB2 55 pazienti con RA vs 43 pazienti con RAEB2 (P-value<0.01) 1,225 geni differenzialmente espressi e significativi la maggior parte dei casi con RAEB2 mostra un profilo di espressione simile RA RAEB2

14 RA vs RAEB2 geni differenzialmente espressi piu significativi Gene P-value Ratio media MDS RA Ratio media MDS RAEB2 Localizzazione LEF x q23-q25 CASC x q14 RBBP x q11.2 RFC x q12.3-q13 CDC x q21.3 LEF1 e importante per la granulopoiesi dei neutrofili,, ed e e down-regolato o assente in pazienti con neutropenia congenita CASC5 e e un gene candidato per la suscettibilita al cancro RBBP8 e coinvolto nel controllo dei checkpoint del ciclo cellulare dopo induzione di danno al DNA alla transizione G2/M

15 RAEB2 e e associato con bassi livelli di LEF LEF1 RA RAEB2

16 Down-regolazione di LEF1 e e associata con l evoluzione della malattia nelle MDS LEF1 e e il gene differenzialmente espresso piu significativo tra casi di MDS iniziale e avanzata marcata down-regolazione di LEF1 (>10-fold) in 27 su 32 pazienti con MDS avanzata e solo in 6 su 35 pazienti con MDS iniziale livelli di espressione di LEF1 molto bassi (>10-fold) sono significativamente associati con neutropenia nelle MDS bassa espressione di LEF1 potrebbe contribuire al difetto maturativo delle cellule progenitrici mieloidi e alla neutropenia nelle MDS Pellagatti et al, 2009

17 Down-regolazione di LEF1 a livello proteico (collaborazione con T. Marafioti) a) midollo osseo normale b) MDS iniziale c) MDS avanzata la colorazione immunoistochimica per CD34/LEF1 potrebbe essere un marcatore per MDS avanzate

18 Pathways deregolati in RA e RAEB2 Sottotipo MDS Pathway deregolati RA RAEB2 Apoptosis signalling Chemokine signalling Glycolysis DNA damage response Cell cycle: G2/M DNA damage checkpoint regulation Pyrimidine metabolism

19 41 del(5q) vs 5 del(7q)/-7 vs 5 trisomia 8 (P-value<0.05) 582 Geni differenzialmente espressi significativi Clustering gerarchico del(5q) vs -7/del(7q) vs +8 i diversi gruppi cariotipici formano clusters distinti del(5q) -7 / del(7q) +8

20 Pathways deregolati e ontologia genica nelle MDS con -7/7q-, +8, 5q- Gruppo cariotipico -7/7q- 5q- +8 Ontologia genica Cell death Protein synthesis Cellular assembly and organization Cell-mediated immune response Inflammatory response Cell death Cellular growth and proliferation Cell death Pathways Deregolati Wnt/β-catenin signalling Actin Cytoskeleton signalling Cell cycle: G1/S checkpoint regulation T-cell receptor signalling Natural killer cell signalling Mitochondrial dysfunction SAPK/JNK signalling PI3K/AKT signalling in accordo con lo studio di Chen et al, Blood 2004: due MDS con monosomia 7 e tre MDS con trisomia 8

21 Identificazione di GEP distinti nelle MDS usando GEP e e possibile identificare profili di espressione distinti, che implicano specifici pathways patogenici, nei vari gruppi cariotipici delle MDS i pathways deregolati identificati potrebbero rappresentare nuovi bersagli farmacologici

22 GEP nella sindrome 5q- la sindrome 5q- e e un sottotipo distinto di MDS, con una del(5q) come unica anomalia cromosomica GEP puo essere utile per far luce sulla patofisiologia e i meccanismi della malattia - geni deregolati in associazione con aploinsufficienza del gene RPS14 - deregolazione del pathway di p53 in associazione con stress ribosomale

23 Sindrome 5q- e RPS14 il gene RPS14 ha un ruolo cruciale nella syndrome 5q- RPS14 e e localizzato nella regione minima comune di delezione e i pazienti con sindrome 5q- hanno aploinsufficienza di RPS14 (Boultwood et al, Blood 2002; Boultwood et al, BJH 2007) Studi in vitro hanno dimostrato che RPS14 causa il difetto eritroide nella sindrome 5q- (Ebert et al, Nature 2008) sindrome 5q- : analogia con l anemial Diamond- Blackfan (DBA) pazienti con DBA hanno aploinsufficienza (tramite mutazione) della proteina ribosomale RPS19

24 Aploinsufficienza del gene RPS14 e e associata con deregolazione di geni ribosomali nella sindrome 5q- le cellule CD34+ di pazienti con DBA presentano deregolazione di vari geni con funzione ribosomale e traduzionale usando GEP abbiamo trovato che 55 su 579 geni con funzione ribosomale e traduzionale erano differenzialmente espressi nelle cellule CD34+ di 15 pazienti con la sindrome 5q- rispetto a 18 pazienti con RA a cariotipo normale e 17 controlli sani - RPS23, EIF2A questi dati suggeriscono che la sindrome 5q- e e caratterizzata da un aberrante biogenesi ribosomale Pellagatti et al,, 2008

25 Clustering gerarchico di 55 geni con funzione ribosomale e traduzionale differenzialmente espressi nelle MDS i pazienti con sindrome 5q- risultano separati dai pazienti con RA a cariotipo normale a dai controlli sani unicamente sulla base dell espressione espressione deregolata di questi geni ribosomali

26 Aploinsufficienza di proteine ribosomali e p53 e stato dimostrato che lo stress a livello ribosomale porta all attivazione attivazione del pathway di p53 con conseguente blocco del ciclo cellulare e apoptosi mutazioni nei geni Rps19 e Rps20 nei topi causano una riduzione del numero di eritrociti tramite attivazione di p53 e dei geni regolati da p53; l inibizione di p53 allevia tale fenotipo (McGowan et al, Nat Genet 2008)

27 Geni significativamente up-regolati nella sindrome 5q- Affy ID Gene Localizzazione Ratio P-value _at WIG1 3q26.3-q x _s_at RPS27L 15q x _at TNFRSF10B 8p22-p x _s_at SPAG6 10p x _s_at FDXR 17q24-q x _s_at BAIAP2L1 7q x _at PHLDA3 1q x _at BCL11B 14q x _s_at DENND2D 1p x _x_at FAS 10q x _s_at BAX 19q13.3-q x _s_at COL10A1 6q21-q x 10-3 I geni in rosso sono regolati da p53 8 dei 12 geni piu up-regolati nella sindrome 5q- sono geni regolati da p53

28 Il pathway di p53 e e significativamente deregolato nella sindrome 5q- p=0.024 I geni con una * sono espressi a livelli significativamente piu elevati in pazienti con sindrome 5q-

29 GEP nelle MDS - conclusioni 1. identificazione di geni/pathways comunemente deregolati ad esempio up-regolazione di ISGs e deregolazione del pathway del segnale dell interferone 2. identificazione di geni associati con la progressione della malattia, che potrebbero rappresentare nuovi marcatori molecolari di MDS avanzata - LEF1 3. identificazione di profili di espressione distinti nei gruppi cariotipici piu comuni nelle MDS (5q-, +8, -7/7q-) miglior comprensione dei meccanismi patologici della sindrome 5q- - deregolazione di geni con funzione ribosomale e traduzionale - deregolazione del pathway di p53 4. i geni/pathways deregolati potrebbero rappresentare nuovi bersagli terapeutici

30 Ringraziamenti LRF Unit J. Boultwood J. Perry J. Wainscoat T. Marafioti Collaboratori internazionali M. Cazzola L. Malcovati M. Della Porta E. Hellström-Lindberg M. JäderstenJ A. Giagounidis S. Killick P. Fenaux P. Vyas A. McKenzie