Manipolazione in vitro, colture cellulari, rigenerazione e clonazione.

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1 Manipolazione in vitro, colture cellulari, rigenerazione e clonazione.

2 Totipotenza: capacità propria di cellule differenziate di mantenere la piena potenzialità genetica e di esprimerla in determinate condizioni, in modo da ottenere la rigenerazione di un nuovo individuo. E spesso genotipo- ed espianto-dipendente. Internode section of Parrot feather. This internode section has been cultured for 5 days on media containing plant growth regulators. Note the new shoots developing - this is called organogenesis.

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4 Per mettere a crescere in vitro dei tessuti vegetali si procede con una serie di passaggi: -Scelta e prelievo dell espianto (porzione di tessuto) -Sterilizzazione superficiale con candeggina -Messa a dimora in terreno di crescita sterile

5 La crescita in vitro richiede la presenza di sostanze nutritive minerali.

6 La crescita in vitro intesa come divisione e proliferazione richiede anche la presenza di composti che stimolano il ciclo cellulare e il de-differenziamento: auxine e citochinine (NON CITOCHINE!!)

7 Organogenesi in vitro: sviluppo, separato nel tempo, di distinti organi vegetativi partendo da un espianto somatico. Dipende dall applicazione di ormoni (auxine e citochinine) e dalla abilità del tessuto a rispondere agli ormoni con un programma di sviluppo. Divisibile in tre fasi in base al bilancio ormonale necessario: 1- acquisizione della competenza alla rigenerazione di organi (abilità, de-differenziamento); 2- le cellule competenti vengono stimolate verso un programma di sviluppo determinato per un organo specifico in base all ormone aggiunto; 3- la morfogenesi prosegue in modo autonomo e indipendentemente dagli ormoni aggiunti.

8 1- acquisizione della competenza alla rigenerazione di organi (abilità, de-differenziamento); Messa a dimora dell espianto, aggiunta di ormoni (auxine e citochinine) ad una concentrazione tale da stimolare la divisione mitotica e la crescita indifferenziata formazione del callo Il parametro importante è il rapporto tra le concentrazioni dei due ormoni, di solito non devono avere la stessa concentrazione.

9 2- le cellule competenti vengono stimolate verso un programma di sviluppo determinato per un organo specifico in base all ormone aggiunto; L induzione alla rigenerazione degli organi avviene modificando il rapporto tra le concentrazioni dei due ormoni: sbilanciandolo verso le citochinine ( aux.) sviluppo parte aerea sbilanciandolo verso le auxine ( citoc.) sviluppo radici

10 3- la morfogenesi prosegue in modo autonomo e indipendentemente dagli ormoni aggiunti. Una volta ottenuta la piantina rigenerata non è più necessario aggiungere gli ormoni, la pianta cresce autonomamente. Quando è sufficientemente cresciuta, la piantina può essere trasferita in terra indistinguibile dalla pianta madre

11 Applicazioni: micropropagazione, clonazione vegetale, piante transgeniche, materiale pathogen-free. Problemi: laboriosità, sterilità, variazione somaclonale, mosaicismo o chimerismo, fragilità degli organismi rigenerati, abituazione.

12 Embriogenesi somatica: sviluppo di embrioni partendo da cellule somatiche, senza fecondazione e sviluppo dello zigote. Embriogenesi Nell embrione degli animali si definiscono già tutti gli organi e tessuti dell individuo adulto, nelle piante si ha invece lo sviluppo di un abbozzo di pianta (l asse embrionale e i due cotiledoni) che solo in un secondo tempo e durante tutta la vita della pianta genererà tutti gli organi grazie all attività dei meristemi. Già nell asse embrionale si definiscono però: - la simmetria radiale dei tessuti negli organi - l asse di sviluppo verticale apice-base - i meristemi primari attivi dopo la germinazione.

13 Lo sviluppo dell embrione dopo la fecondazione di un ovulo nella pianta madre segue una serie di fasi ben precise diverse nelle varie piante, ma ben caratterizzate in Arabidopsis. Globo/sfera Cuore Torpedine Stadio cotiledonare

14 Durante le tre fasi principali si osserva che: la definizione dell asse di simmetria apice-base avviene già alla prima divisione mitotica dello zigote (cellula apicale e basale), già nello stadio a cuore si evidenziano tre porzioni: apicale cotiledoni e meristema centrale ipocotile basale radici

15 Embriogenesi somatica: nel callo in crescita una sottopopolazione degli aggregati (masse proembriogeniche, PEM) mostra la capacità di dare origine ad embrioni somatici, che si sviluppano in modo analogo a quelli zigotici. Tale capacità si manifesta al momento della rimozione degli ormoni dal terreno. A.PEM formation in immature zygotic embryos B. Same photo showing a close up of PEMs (10X). C. PEMs forming at the base of immature whole seeds D. Same photo showing close up of PEMs (10X). E. PEM formation in split seeds F. Close up of PEMs shown in D (10X).

16 Heart-shaped somatic embryo of rose Somatic embryos of cassave; different stages

17 Gli ormoni sono necessari per indurre lo sviluppo del callo e per indurre tale potenzialità embriogenetica. Induzione: in presenza continua di ormoni le PEM producono tutti i prodotti genici necessari per la fase globulare ma anche prodotti che ne inibiscono il successivo sviluppo coltura cellulare con potenzialità embriogenetica. Rimuovendo gli ormoni si interrompe la sintesi degli inibitori l embriogenesi prosegue da sola Il completamento del programma è garantito dalla sintesi endogena dell ormone. Non si hanno le fasi successive di dormienza.

18 Applicazioni embriogenesi somatica: - moltiplicazione vegetativa, - semi artificiali o disidratazione indotta da ABA, Vantaggi: - no chimerismo perché derivano probabilmente da singole cellule. Artificial seed Somatic embryo Artificial endosperm

19 Protoplasti Manipolazione cellule vegetali singole, ottenute per degradazione della parete vegetale ad opera di enzimi idrolitici (cellulasi, emicellulasi e pectinasi, di origine fungina).