Il virus e la diagnosi di laboratorio

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1 Il virus e la diagnosi di laboratorio Maria Rosaria Capobianchi Antonino Di Caro Concetta Castilletti Laboratorio di Virologia WHO Collaborating Center for clinical care, diagnosis, response and training on Highly Infectious Diseases

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3 Il virus Particella virale pleiomorfa, allungato, dotata di involucro, dimensioni: 80nm x ,000nm long

4 Famiglia filoviridae; il genere ebolavirus comprende 5 specie (Tai Forest, Bundibugyo, Sudan, Reston, Zaire) Reston non è patogeno per l uomo, anche si sono verificate infezioni Genoma: singola catena di RNA, lineare, non-segmentata, polarità negativa, dimensioni: 18,959 bp. Capacità codificante: 7 proteine

5 Le proteine codificate dal genoma virale, studiate in un sistema replicon NP: proteina NP strutturale di 83.3 Kd L: RNA-polimerasi RNA dipendente GP: glicoproteina GP (2 forme: trans-membrana e secretoria) VP40: proteina di matrice per la sua carica positiva facilita la gemmazione VP30: proteina fosforilata con funzione di attivazione e modulazione della trascrizione (incapsidamento RNA) VP35: proteina coinvolta in eventi trascrizionali; inibisce l attivazione del sistema IFN contribuendo alla patogenicità dei filovirus VP24: proteina associata alla matrice; la funzione rimane ambigua

6 Ebola: patogenesi.1 Il virus, veicolato dalle secrezioni infette, penetra per via mucosale o percutanea Il virus si diffonde attraverso il torrente circolatorio e si replica attivamente in: macrofagi/monociti cellule dendritiche cellule endoteliali Principali organi bersaglio: fegato, rene, milza, ovaio, testicoli ed organi linfatici Le lesioni principali sembrano essere a carico dell endotelio vascolare, con conseguente aumento della permeabilità vasale Feldmann, Lancet 2011

7 Ebola: patogenesi.2 Le informazioni sulla patogenesi derivano principalmente da studi su modelli animali (non human primates). I meccanismi patogenetici principali si esplicano su due versanti: Inibizione del sistema immunitario, che impedisce l attivazione di una risposta immune protettiva efficace Danno del sistema vascolare, con conseguente perdita di sangue (emorragie) ed ipotensione, seguite da shock e morte

8 Ebola: immmunopatogenesi Gli elementi essenziali della immunopatogenesi si estrinsecano in due direzioni opposte: Negli stadi iniziali dell infezione, il virus, grazie ad alcune proteine codificate dal suo genoma, blocca la risposta immune; questo determina una massiccia replicazione virale e un ritardo nella produzione degli anticorpi e nell attivazione di altri meccanismi antivirali La risposta immune inizia quando la replicazione virale è fuori controllo; ne risulta una iper-attivazione immunitaria, che da una parte non è più efficace nel contenere la replicazione del virus, e dall altra innesca effetti dannosi per l organismo (ad esempio tempesta citochinica)

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10 I segni conclamati

11 La diagnostica di laboratorio Outline Diagnostica di base Diagnostica differenziale Diagnostica specifica per Ebola

12 FAQ 1. Possono essere eseguiti test diagnostici nei laboratori locali (urgenza, microbiologia, virologia, ecc.) prima di avere il risultato del test per Ebola? SI: se si adottano le adeguate misure di protezione. Il rischio per i laboratoristi è molto basso in caso di bassa probabilità di MVE, e basso in caso di elevata probabilità.

13 La circolare del Ministero della Salute /10/2014 dispone che per gli esami ematochimici ed i test per le diagnosi differenziali, nei casi sospetti/probabili di MVE, sia individuato un laboratorio di riferimento che, in base alla valutazione del rischio, effettuata dalla struttura di malattie infettive di riferimento regionale, definisca le procedure per il trasporto ed il processo dei campioni E opportuno che il personale sanitario, in tutte le fasi del percorso assistenziale, anche in presenza di un caso sospetto a basso rischio, rispetti scrupolosamente le precauzioni standard per la prevenzione delle infezioni, operando in modo tale da evitare assolutamente qualsiasi contatto diretto con liquidi biologici dei pazienti

14 Limitare i prelievi al minimo indispensabile Valutazione del rischio I campioni dei pazienti che rientrano nella definizione di caso sospetto di malattia da virus Ebola (MVE) dovrebbero essere trattati utilizzando un strategia di stratificazione dei rischi, che tenga conto di esistenza ed entità del link epidemiologico provenienza da zone dove l epidemia ha un alta diffusione aver frequentato strutture ospedaliere aver avuto contatti diretti con persone infette gravità della sintomatologia eventuale mancato miglioramento dei sintomi a seguito dei trattamenti terapeutici persistenza della febbre nonostante il trattamento antimalarico in pazienti con parassitemia Un buon documento di riferimento per la stratificazione dei rischi è stato prodotto da PHE, ed è consultabile al sito

15 Prelievi Valutazione del rischio Improbabile che si tratti di MVE Bassa probabilità che si tratti di MVE Alta probabilità che si tratti di MVE MVE confermata Avvisare il laboratorio locale del rischio assegnato, per consentire l adozione di adeguate misure di biosicurezza Inviare i campioni al laboratorio locale in contenitori primari chiusi, ermetici, non in vetro, racchiusi in un secondo contenitore infrangibile, a sua volta contenuto in un terzo contenitore rigido, rispettando la regola del triplo imballo

16 Indagini chimico cliniche.1 Emocromo elettroliti transaminasi PCR coagulazione ecc. La circolare del Ministero della Salute /10/2014 dispone che i laboratori per l effettuazione dei test ematochimici (oltre che per la diagnosi differenziale e per la diagnosi di MVE) siano appositamente individuati.

17 Indagini chimico cliniche.2 Le indagini chimico-cliniche possono essere eseguite in loco, nei laboratori appositamente individuati, privilegiando POCT (Point of Care Testing) o sistemi chiusi che consentano ad es. di forare la provetta e di centrifugarla, ove necessario, in modo automatico. Tali sistemi, se utilizzati con la piena osservanza delle precauzioni standard, offrono un elevato livello di biosicurezza le precauzioni di biosicurezza attuate in ogni laboratorio, in ottemperanza del D. Lgs. 81/08, sono sufficienti a controllare il rischio di qualsiasi agente infettivo, incluso il virus Ebola

18 Indagini chimico cliniche.3 La struttura di malattie infettive di riferimento dovrà definire, d intesa con il laboratorio di riferimento, un protocollo che preveda corrette modalità di richiesta dei test e flussi informativi specifici È necessario che tale laboratorio venga avvisato in anticipo dell invio di un campione proveniente da un caso di MVE È altresì opportuno che le direzione dei laboratori condividano con gli ospedali individuati per il ricovero dei casi sospetti, la valutazione del rischio per adottare i percorsi e le procedure più appropriate per il trasporto ed il processo dei campioni I campioni biologici devono essere confezionati e conferiti al laboratorio di riferimento nel rispetto delle Raccomandazioni per la sicurezza del trasporto di materiali infettivi e di campioni diagnostici (Circolare Ministeriale n. 3 del 3 maggio 2003)

19 Indagini chimico cliniche.4 In laboratorio Se necessaria, la centrifugazione dei campioni va eseguita in centrifughe che posseggano cestelli chiusi. I cestelli vanno aperti preferenzialmente sotto cappa biohazard di classe II (BSC II) L apertura delle provette deve essere eseguita sotto cappa BSC II, evitando la formazione di aerosol In caso di necessità di procedure che generano aerosol, l operatore deve adottare le precauzioni standard, da contatto e droplets

20 Indagini chimico cliniche.4 In laboratorio L analisi dei campioni dovrebbe essere seguita dalla disinfezione dello strumento secondo le procedure suggerite dalla ditta produttrice Gli scarichi degli strumenti analitici, dedicati o meno, devono essere trattati e smaltiti come rifiuti a rischio infettivo, secondo le procedure aziendali, tenuto conto che andrebbero privilegiati sistemi che producano una ridotta quantità di rifiuti speciali; I campioni residui dovranno essere smaltiti come rifiuti a rischio infettivo, secondo le procedure aziendali

21 La diagnostica di laboratorio Outline Diagnostica di base Diagnostica differenziale Diagnostica specifica per Ebola

22 Perché la diagnosi differenziale La sintomatologia iniziale è molto aspecifica, ed è comune a molte altre condizioni patologiche. La comparsa dei sintomi emorragici è in genere tardiva, e talvolta può essere non apprezzata, perché si può trattare di emorragie interne. La lista delle principali eziologie infettive da considerare nella diagnosi differenziale include le patologie più comuni nei paesi dove è in corso l epidemia africana

23 Diagnostica differenziale Malaria Dengue Febbre tifoide Shigellosi Colera Leptospirosi Peste Rickettsiosi Febbre ricorrente Borreliosi da pidocchi Meningiti e sepsi Epatiti Altre febbri emorragiche virali La circolare del Ministero della Salute /10/2014 dispone che i laboratori per l effettuazione dei test per la diagnosi differenziale (oltre che i test ematochimici e quelli per la diagnosi di MVE) siano appositamente individuati

24 FAQ 2. Il test di malaria può essere eseguito in loco? Si, se si adottano adeguate precauzioni Privilegiare il test rapido (POCT) le positività vanno confermate con i test convenzionali In pronto soccorso l operatore è protetto dai dispositivi di protezione e dalle procedure In laboratorio il POCT va eseguito a livello BSL2, sotto cappa BSC II, proteggendo gli occhi e le mucose da eventuali spruzzi. L operatore deve essere protetto da guanti e camice impermeabile Nel caso non sia possibile l utilizzo della cappa BSC II, l operatore dovrà indossare visiera o occhiali a tenuta e mascherina chirurgica idrorepellente In caso di impossibilità di eseguire il test in loco, o in caso di elevata probabilità di MVE, la ricerca del parassita malarico può essere eseguita nel laboratorio di riferimento regionale o nazionale

25 La diagnostica di laboratorio Outline Diagnostica di base Diagnostica differenziale Diagnostica specifica per Ebola

26 Il virus ebola, come gli altri filovirus, è un virus di gruppo di rischio 4 Alta contagiosità Elevata mortalità Assenza di terapia specifica Assenza di vaccini La diagnostica per virus di gruppo di rischio 4 non è assimilabile ad analoghe procedure per microrganismi di gruppo inferiore, in quanto presenta requisiti strutturali, professionali ed organizzativi peculiari

27 La circolare del Ministero della Salute /10/2014 indica i seguenti criteri di laboratorio, almeno uno dei quali è necessario per la conferma di un caso di MVE CRITERIO DI LABORATORIO: La positività ad uno dei seguenti: Individuazione di acido nucleico del virus Ebola in un campione clinico e conferma mediante sequenziamento o un secondo test su una diversa regione del genoma; Isolamento del virus Ebola da un campione clinico; Evidenza di sieroconversione

28 Difficoltà del laboratorio Necessità, specie in assenza di un sospetto clinico ben indirizzato, di una diagnosi differenziale ad ampio spettro Scarsità di materiali di riferimento per lo sviluppo e la validazione dei metodi diagnostici specifici per MVE Scarsità/assenza di kit commercialmente disponibili, sufficientemente validati Necessità di test accessori per la conferma dei risultati dei test iniziali, dovuti allo scarso potere predittivo positivo in situazioni di bassissima prevalenza, come quella attuale al di fuori delle zone epidemiche Necessità di partecipare a network internazionali per poter accedere a: metodi, materiali/agenti, EQA, assistenza/conferme dei risultati Necessità di sviluppare, spesso in fretta, metodi nuovi e, in assenza di standard di riferimento, di sviluppare metodi di conferma Necessità di laboratori ad alto biocontenimento

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30 Considerazioni sui livelli di biosicurezza La ricerca dell acido nucleico virale viene effettuata con metodi molecolari I tamponi di lisi utilizzati per l estrazione degli acidi nucleici (es. AVL) inattivano l infettività virale L aggiunta del tampone di lisi al campione clinico deve essere effettuata ad un livello di biosicurezza commisurato alla valutazione del rischio; è raccomandato come livello minimo il BSL3 Le fasi di estrazione ed amplificazione possono essere eseguite in condizioni di biosicurezza 2 (BSL2) L isolamento del virus va effettuato in laboratorio a livello di biosicurezza 4 Allo stesso livello deve essere effettuata la manipolazione e la conservazione di tutti i campioni positivi La sieroconversione viene valutata mediante metodi non commerciali, il cui allestimento richiede la disponibilità di colture virali, e quindi di laboratorio a livello di biosicurezza 4

31 In base a queste premesse, la circolare del Ministero della Salute /10/2014 dispone che la ricerca degli acidi nucleici virali venga eseguita in laboratori identificati dalle regioni, dotati almeno di livello di biosicurezza 3 I laboratori abilitati alla manipolazione degli agenti di gruppo di rischio 4 possono effettuare i test che necessitano la coltura del virus e conservare i campioni biologici positivi I laboratori di riferimento identificati dalle regioni e comunicati al Ministero della Salute saranno inseriti in un processo di qualificazione con la collaborazione del centro di riferimento nazionale per la diagnosi di Febbri Emorragiche Virali, presso l Istituto Nazionale per le Malattie Infettive L.Spallanzani. In attesa della conclusione di tale processo di qualificazione, i campioni per la diagnosi eziologica di MVE devono essere inviati contemporaneamente anche all INMI L. Spallanzani

32 Quindi Per la diagnosi virologica di Ebola, bisogna inviare i campioni al laboratorio regionale di riferimento o, ove questo non fosse stato identificato, al Laboratorio Nazionale di Riferimento dell INMI L. Spallanzani Contemporaneamente all invio del campione al laboratorio regionale di riferimento per la diagnosi di MVE, un campione dovrà essere inviato anche al Laboratorio Nazionale di Riferimento dell INMI L. Spallanzani

33 Capacità diagnostiche per Ebola al centro di riferimento Nazionale individuato dal Ministero Ricerca diretta del virus mediante metodi molecolari basata su un test iniziale di screening e vari test successivi di conferma Caratterizzazione molecolare mediante sequenziamento ed analisi filogenetica Ricerca diretta del virus mediante metodi colturali Ricerca diretta del virus mediante microscopia elettronica Ricerca degli anticorpi mediante Immunofluorescenza indiretta (IgM e IgG) Ricerca di anticorpi mediante test di neutralizzazione Misura della risposta cellulare virus-specifica Diagnosi differenziale verso le principali eziologie alternative, nonché verso altre cause di sindromi emorragiche, incluse Lassa, Dengue, Alkhurma, febbre gialla, ecc.

34 Nel corso degli anni sono stati allestiti numerosi metodi molecolari, basati su PCR classica o in real time, capaci di riconoscere il virus Ebola ed eventualmente di differenziarlo dagli altri filovirus Tali metodi devono essere continuamente aggiornati per riconoscere eventuali nuove varianti virali, e vengono cross-validati attraverso circuiti di controlli di qualità gestiti all interno di network di laboratori che hanno familiarità ed esperienza sulla diagnostica dei virus di gruppo di rischio 4

35 Metodi molecolari commerciali Recentemente si sono resi disponibili alcuni kit commerciali che rilevano l RNA virale Alcuni kit sono in grado di differenziare Ebola dagli altri filovirus Alcuni kit sono specifici per le diverse specie di virus Ebola (5 specie, di cui una non patogena per l uomo), o per Marburg Le performance analitiche e cliniche di questi kit non sono ancora descritte in letteratura. Filovirus Altona Real Star Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0; Ebola Genekam Ebola (Common) PCR kit, (Zaire) PCR kit, (Reston) PCR kit, (Zaire) PCR kit, (Sudan) PCR kit Liferiver (Vacunek) (EBOV) Real Time RT-PCR kit Lipsdiag LIPSGENE SEBOV Kit (Sudan) / ZEBOV Kit (Zaire) Sacace Ebola Zaire Real Time PCR kit Genesig Ebola Real Time PCR kit, Path-EBOV (Zaire) / Path-SUDV (Sudan) Tib Molbiol Ebola (Zaire) Real Time PCR kit Marburg Liferiver (Vacunek) (MBV) Real Time RT-PCR kit Genekam Marburg PCR kit

36 Towner, J Virol 2004 Cinetica dell RNA virale L esperienza accumulata negli anni ( l andamento riportato nella figura è relativo all epidemia di Ebola del 2000 in Uganda sostenuta dalla specie Sudan) ha indicato che l RNA virale è presente ad alti titoli fino a 10 giorni dopo inizio dei sintomi Questo suggerisce che la sensibilità dei test non è un problema rilevante Non bisogna dimenticare che in situazione di bassa prevalenza, anche in caso di specificità elevata del test impiegato, il potere predittivo positivo può essere basso, per cui è necessario ricorrere a test accessori di conferma

37 Definizione di caso confermato Individuazione di acido nucleico del virus Ebola in un campione clinico e conferma mediante sequenziamento o un secondo test su una diversa regione del genoma

38 Flusso di lavoro adottato per la diagnosi molecolare di MVE nel Laboratorio di riferimento Nazionale Rilevazione di una sequenza genica di EBOLA con RT-PCR Real-Time Conferma dei positivi con un metodo basato su una regione target diversa Esecuzione di una PCR classica Caratterizzazione mediante sequenziamento della regione amplificata con PCR classica La sequenza ottenuta viene confrontata con le sequenze disponibili nelle banche dati accessibili via Web 38

39 Tempi di risposta Dall arrivo dei campioni al laboratorio di virologia dello Spallanzani, attivo h24 Test rapido malaria 1 ora Real Time PCR Filovirus (Ebola) 4-6 ore A meno di imprevisti.

40 A proposito di imprevisti Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria Necessità di bonificare la superficie esterna Difficoltà a recuperare il campione residuo disponibile Le informazioni sull etichetta sono incongruenti con quelle della scheda Necessità di contattare chi ha inviato il campione per escludere scambi di provette Il campione contiene inibitori o sostanze che interferiscono con il saggio Necessità di ricominciare dall estrazione Altre circostanze impreviste (es. Scheda all interno della confezione)

41 Anticorpi Benché fra i criteri di laboratorio sia indicata la evidenza di sieroconversione, la ricerca degli anticorpi in genere ha valore di documentazione retrospettiva Le IgM compaiono dopo 3 giorni e sono fugaci (< 3 settimane) Le IgG persistono a lungo e sembrano essere protettive I grafici mostrano l andamento della risposta anticorpale osservata nell epidemia di Ebola nella Repubblica Democratica del Congo del 1995 IgM IgG Ksiazek, JID 1999

42 Immunofluorescenza indiretta Cellule non infette Cellule infette con virus Ebola Non esistono metodi commerciali per la ricerca di anticorpi specifici per il virus Ebola Nel laboratorio di riferimento nazionale viene eseguita l immunofluorescenza indiretta, utilizzando vetrini allestiti in house, con cellule infette mescolate con opportune quantità di cellule non infette Questa preparazione richiede la coltivazione del virus, e quindi viene effettuata in BSL4 Controllo negativo Campione IgM-positivo Campione IgG-positivo 42

43 Risposta cellulare specifica Per la risposta cellulare vengono eseguite colture di PBMC esposti al virus; la rilevazione delle sottopopolazioni linfocitarie attivate viene eseguita mediante rilevazione citofluorimetrica delle citochine intracitoplasmatiche.

44 Identificazione del virus Isolamento virale in colture di tessuto (BSL4) e successiva caratterizzazione degli isolati con metodi immunologici o molecolari. In casi particolari è previsto anche lo studio morfologico in Microscopia Elettronica, sia sull isolato che sul campione biologico iniziale. 44

45 Coltivazione del virus: BSL4 0< -15 BSL , BSL BSL4

46 POCT Sono descritti alcuni test rapidi, le cui performance non sono definite, o sono deludenti

47 Preparazione dei campioni.1 Il campione di scelta per la ricerca del virus è sangue-edta (no eparina) I campioni vanno mantenuti a +4 C prima dell invio Il trasporto al Laboratorio deve essere effettuato entro il più breve tempo possibile, preferibilmente entro le 24 ore e a temperatura refrigerata Per tempi di consegna più prolungati, concordare con il Laboratorio le modalità di preparazione e conservazione

48 Preparazione dei campioni. 2 I prelievi devono essere accompagnati dalla scheda dati, compilata in tutte le sue parti Su ogni singolo campione deve essere apposta un etichetta riportante a chiare lettere il nome del paziente, la tipologia del campione (sangue, urine, altro) e la data di prelievo. Le informazioni riportate sulle provette devono essere coerenti con quelle inserite nella scheda dati

49 Confezionamento e trasporto dei campioni.1 Il campione va confezionato seguendo il principio del triplo involucro Il trasporto dei campioni al laboratorio va eseguito secondo le raccomandazioni per i campioni a rischio biologico (Circolare Ministeriale n 3/2003 Raccomandazioni per la sicurezza del trasporto di materiali infettivi e di campioni diagnostici ) L invio va concordato con il Laboratorio

50 Confezionamento e trasporto dei campioni.2 Se si utilizza un corriere, la confezione deve essere omologata UN 2814 (categoria A) Se si utilizza il trasporto aziendale su strada la confezione non richiede l omologazione UN Il box frigorifero può rappresentare il contenitore terziario (esterno). I contenitori primari non vanno mai inviati in bustine transbag e senza essere racchiuse in conteniture secondario e terziario x

51 Scheda di raccolta dati per la diagnosi di Laboratorio in caso di sospetta MVE

52 Recapito del richiedente (possibilmente tel. cellulare)

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