ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN FORMALINA E INCLUSI IN PARAFFINA (FFPE)

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1 ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN FORMALINA E INCLUSI IN PARAFFINA (FFPE) SALVATORE GIRLANDO LABORATORIO PATOLOGIA MOLECOLARE ANATOMIA PATOLOGICA TRENTO

2 Estrazione acidi nucleici Estrazione DNA primo passo nelle applicazioni di biologia molecolare Metodi si basano sul tipo di acido nucleico che si vuole estrarre (DNA/RNA) Materiale di partenza ad esempio sangue o tessuti o altro materiale Risultato desiderato (quantità, purezza) Applicazione prevista post-estrazione ad esempio tipo di indagine molecolare

3 Estrazione acidi nucleici DNA molecola molto lunga soggetta a frammentazioni Difficile estrarlo in forma intatta Frammenti di kilobasi (kb) sono ottimi per effettuare tutte le indagini di biologia molecolare Da materiale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) il DNA si presenta molto degradato ed è consigliabile amplificare al massimo frammenti di 300 bp

4 Estrazione degli acidi nucleici Può essere estratto da qualsiasi tessuto o cellula nucleata Da materiale fresco e/o congelato Da materiale fissato in formalina e incluso in paraffina Altro (sangue, plasma, capelli, frammenti di tessuti, ecc.)

5 Estrazione degli acidi nucleici (DNA/RNA) da campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE): fasi 1. Taglio 8-10 fette da biopsie, 2-3 da pezzo operatorio dello spessore di 10 µm 2. Sparaffinatura/digestione O.N. con tampone di lisi più proteinasi K 3. Purificazione dell acido nucleico (più metodi) 4. Precipitazione DNA 5. Valutazione quantitativa 6. Conservazione

6 1. Taglio delle fette di tessuto Da pezzo operatorio: 3-4 fette spesse 10 µm in provetta o su vetrino Da biopsia: 7-8 fette sempre dello stesso spessore (10µm ) Altri metodi prevedono lo scraping, direttamente da vetrino, di cellule o fette di tessuto precedentemente colorate e utilizzati per diagnosi cito o istologiche

7 Fase 2. Processo di Sparaffinatura Aggiungere 1 ml di xilene e mescolare per 10 minuti Centrifugare a rpm per 5 minuti Eliminare il surnatante facendo attenzione al pellet Si ripete una seconda volta il passaggio

8 2. Processo di sparaffinatura Aggiungere 1 ml di Etanolo Assoluto Mescolare per 5 min Centrifugare a rpm per 2 min Eliminare l Etanolo assoluto facendo attenzione a non toccare il pellet Fare asciugare i campioni e aggiungere il tampone di lisi (TRIS-HCl 50 mm ph 8.3) e proteinasi K (20 mg/ml)

9 3. Purificazione acidi nucleici Metodo fenolo/cloroformio (miscela fenolo:cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1) Metodo del salting out (precipitazione delle molecole proteiche) Kits commerciali (molto in uso), maggiore velocità di estrazione

10 Purificazione Fenolo/Cloroformio Inattivazione della proteinasi K ad alta temperatura Purificazione con miscela fenolo: cloroformio: isoamil alcool (25:24:1) Separa una componete organica inferiore contenete lipidi, proteine e estratti cellulari Fase acquosa superiore contenente gli acidi nucleici Fase intermedia proteine denaturate e in parte dissolte dal fenolo

11 Precipitazione DNA - Aggiunta etanolo assoluto (1 ml) e tampone ad alta forza ionica (50 µl) (Na acetato 3 M ph 5.2) - Precipitazione DNA (formazione gomitolo) - Centrifugazione a velocità alta ( rpm) - Lavaggio pellet con etanolo 70 %(1 ml) per rimuovere sali in eccesso - Evaporazione etanolo (potente inibitore enzimatico), per almeno 15 min a provetta aperta - Il DNA precipitato e asciutto può essere conservato a -20 C. Risospensione DNA precipitato - Il DNA viene risospeso in H 2 O o nel tampone previsto dalla metodica. - Può essere conservato a +4 C per qualche settimana o a - 80 C per molti anni (evitare i congelamenti e scongelamenti ripetuti che danneggiano il DNA) 11

12 Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione del DNA in etanolo assoluto e in presenza di Sali ad alte concentrazioni ( mm) per eliminare i residui di Fenolo e cloroformio Eliminazione surnatante e successivo lavaggio con EtOH 70% per eliminare i cationi Centrifugazione ed eliminazione dell ETOH 70% Risospendere il pellet con buffer TE o con H 2 O

13 Purificazione con metodica salting-out Dopo inattivazione della proteinasi K mediante alta temperatura vengono aggiunte 200µl di ammonio acetato (sale) 4 M favorendo la precipitazione delle proteine Campioni vengono vortexati velocità per 3 min. e centrifugati ad alta Trasferimento del surnatante in altra provetta e aggiunta di isopropanolo (600 ul)

14 Purificazione con metodica salting-out Centrifugazione ad alta velocità per 5 min. Pellet lavato con ETOH 70% e centrifugazione sempre ad alta velocità per 1 min Eliminazione del surnatante DNA sciolto in 50 µl di TE o H2O

15 Estrazione con kit commerciale (Qiagen) QIAmp DNA mini kit QIAmp DNA FFPE kit (specifico per tessuti paraffinati) Accorciamento dei tempi di estrazione Minore resa in termini di concentrazione di DNA (solo se si usa sistema automatizzato)

16 Purificazione DNA da tessuti FFPE Lasciare asciugare il pellet facendo attenzione a non seccarlo Risospendere in 180 µl di buffer ATL contenente detergenti più 20 µl di proteinasi k Incubare a 56 C per almeno 3 ore o fino a che il pellet non sia completamente digerito Procedere con la fase di purificazione

17 Purificazione DNA da tessuti FFPE Aggiungere 200 µl di buffer AL contenente agenti caotropici e incubare per 10 min a 70 C; Aggiungere 200 µl di ETOH ass. Trasferire il tutto in una colonnina con una base di silice, centrifugare Fare lavaggi con due passaggi con buffer AW1 e AW2 per lavare il DNA legati alla membrana Eluire con µl di buffer AE o H 2 O

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27 MACRODISSEZIONE Blocchetto paraffina Ematossilina/eosina Fetta in bianco

28 MICRODISSEZIONE Biopsia bronchiale colorazione EE Dopo microdissezione

29 MICRODISSEZIONE Agoaspirato polmonare citologico Dopo microdissezione

30 BAL > 50 tumor cells Esperienza di Modena

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