Corso di insegnamento di Biochimica e Biotecnologie degli Alimenti. Tecniche elettroforetiche. Lezione n. XXIV

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1 Corso di insegnamento di Biochimica e Biotecnologie degli Alimenti Tecniche elettroforetiche Lezione n. XXIV

2 L ELETTROFORESI E la separazione di molecole cariche in soluzione Principio Si basa sulla migrazione differenziale in un campo elettrico in base al rapporto carica/massa ed alla forma. Molte molecole biologiche (amminoacidi, peptidi, proteine, DNA, RNA) hanno gruppi ionizzabili e pertanto ad un determinato ph esistono in soluzione come specie cariche elettricamente, cationi (+) e anioni (-) che, sotto l azione di un campo elettrico migrano al catodo o all anodo.

3 APPARECCHIATURA ALIMENTATORE L'alimentatore fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi applicati alla cella elettroforetica. I cationi migrano verso il catodo (-) e gli anioni verso l'anodo (+) a una velocità che dipende dall'equilibrio tra la forza di spinta del campo elettrico e le forze frenanti (frizionali ed elettrostatiche) esistenti tra ioni e mezzo circostante. La corrente è mantenuta lungo il circuito dall'elettrolisi che ha luogo agli elettrodi, entrambi i quali pescano in capaci recipienti contenenti il tampone. Durante l'elettrolisi, al catodo si producono ioni ossidrile e idrogeno, mentre all'anodo si producono ioni idrogeno e ossigeno. al catodo (-): 2e - + 2H 2 O 2OH - + H 2 all'anodo (+): H 2 O 2H + + ½ O 2 + 2e -

4 CELLE ELETTROFORETICHE GEL ORIZZONTALE GEL VERTICALE

5 Corsa elettroforetica Bisogna mantenere il contatto elettrico tra il gel e il tampone nella camera. Questo nell'elettroforesi orizzontale può essere fatto con ponti costituiti da carta da filtro o garza (a meno che il supporto del campione non sia già la carta). In alternativa, in un sistema verticale, si immerge direttamente il gel nel tampone in modo da permettere direttamente il passaggio di corrente attraverso il gel.

6 I fattori in gioco 1. Il tampone 2. Il campione 3. La concentrazione 4. Il ph

7 Il tampone Il tampone determina e stabilizza il ph del mezzo, mantenendo costante lo stato di ionizzazione delle molecole da separare. I tamponi di uso comune sono il formiato, l'acetato, il citrato, il barbitone, il fosfato, il Tris, l'edta, la piridina. Il tampone non deve legarsi ai composti da separare, perché ne altererebbe la velocità di migrazione.

8 Il campione m= k c/m La velocità di migrazione aumenta all'aumentare della carica netta del campione. La velocità di migrazione diminuisce all'aumentare del peso molecolare e questo perché aumentano le forze frizionali ed elettrostatiche rispetto al mezzo circostante. Molecole di dimensioni simili ma di forma diversa (ad esempio proteine fibrose e proteine globulari) mostrano differenti caratteristiche di migrazione a causa del diverso effetto delle forze frizionali ed elettrostatiche.

9 La concentrazione del tampone All'aumentare della forza ionica del tampone la quota di corrente trasportata dal tampone aumenta mentre diminuisce la quota di corrente trasportata dal campione che abbassa, così, la sua velocità di migrazione. Viceversa a bassa forza ionica la quota di corrente trasportata dal tampone diminuisce e aumenta la quota di corrente trasportata dal campione che incrementa, così, la sua velocità dì migrazione. Perciò la scelta della forza ionica dovrà, in sostanza, rappresentare un compromesso tra questi due estremi: essa è normalmente corrispondente a quella di tamponi tra 0,05 e 0,10 M.

10 Il ph La dissociazione degli acidi organici aumenta all'aumentare del ph, mentre il contrario accade per le basi organiche. Per composti come gli amminoacidi, che hanno proprietà sia acide sia basiche (anfoliti) si avranno entrambi gli effetti del ph: Pertanto, sia la direzione sia la velocità di migrazione degli anfoliti dipendono dal ph.

11 MATERIALI DI SUPPORTO L'elettroforesi può essere condotta in soluzione libera, senza supporto, nel qual caso si osserva una resistenza frizionale molto piccola tra ioni e soluzione e quindi un'elevata velocità di migrazione, (= elettroforesi a flusso continuo) oppure con un supporto inerte e omogeneo (= elettroforesi a fronte mobile). Quando l'elettroforesi è condotta su un supporto, i componenti del campione migrano come bande o "zone" distinte che, al termine della corsa, possono essere rivelate mediante opportune tecniche analitiche. Questo metodo prende, quindi, anche il nome di elettroforesi zonale. I supporti comunemente usati per l'elettroforesi sono: Cellulosa Acetato di cellulosa Silice (gel) Amido (gel) Agarosio (gel) Poliacrilamide (gel) Sephadex (gel) I gel si preparano subito prima dell'uso partendo da solidi in polvere quali amido, agar, acrilamide.

12 GEL DI POLIACRILAMMIDE Vengono preparati al momento dell'uso facendo copolimerizzare monomeri di acrilamide con un agente in grado di stabilire legami crociati, solitamente N,N'-metilenbisacrilamide, in presenza di un catalizzatore e di un iniziatore. L'iniziatore è persolfato d'ammonio; Il catalizzatore è una base adatta, N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED) A M M O N I U M P E R S U L P H A T E Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato, che porta alla produzione di radicali liberi ( S 2 O e - 2SO 4 2- ) che, a contatto con l'acrilamide reagiscono. Si formano così lunghe catene di acrilammide una soluzione di queste catene, sebbene viscosa, non forma però un gel.

13 La formazione del gel si ha con l'ottenimento di legami crociati tra le catene Questo si fa portando avanti la polimerizzazione in presenza di N,N'- metilenbisacrilamide (può essere pensato come due molecole di acrilamide accoppiate testa a testa alle loro estremità non reattive Aumentando la concentrazione del catalizzatore, aumenta la velocità di polimerizzazione del gel. E' necessario degasare preliminarmente le soluzioni impiegate, poiché l'ossigeno molecolare inibisce la polimerizzazione chimica.

14 La porosità del gel dipende dalla concentrazione di acrilamide e bisacrilamide. I gel possono essere definiti in termini di percentuale di acrilamide presente e quelli normalmente usati contengono dal 3 al 30% di acrilamide, a cui corrispondono rispettivamente porosità di 2 e 0,5 nm. In generale, un gel al 30% viene impiegato per separare composti di peso molecolare intorno a 10 4 dalton, mentre un gel al 3% viene usato per separare composti di peso molecolare intorno a 10 6 dalton. Effetto setaccio in un gel uniforme Vantaggi dell impiego di gel 1. elasticità 2. buona conducibilità dovuta ad un elevato contenuto di tampone 3. diametro dei pori estremamente variabile e riproducibile 4. miscelando opportunamente due soluzioni a diversa percentuale di T si possono ottenere gel a porosità crescente per una migliore risoluzione in un intervallo di pesi molecolari scelti. 5. potere adsorbente quasi nullo 6. ottima la colorazione

15 GEL DISCONTINUI "upper gel" o "stacking gel" - «lower gel" o "running gel L upper gel (gel di impaccamento) ha il compito di concentrare il campione di proteine in una sottile banda, prima che entri nel gel di separazione. Permettere che le proteine del campione comincino la corsa effettiva nel running gel in bande molto compatte aumentandola risoluzione della tecnica. percentuale più bassa di acrilamide pori di dimensioni molto grandi

16 Elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecilsolfato SDS-PAGE Sample buffer SDS si lega alle proteine e le denatura (la carica nativa della proteina è mascherata dalle molecole di SDS cariche negativamente) 2-mercaptoetanolo/ DTT riducono i ponti disolfurici glicerolo al 10-15% aumenta la densità della soluzione blu di bromofenolo agevola l'osservazione dei campioni caricati permette di seguirne la migrazione elettroforetica La velocità di migrazione diminuisce all aumentare della massa I complessi SDS-proteina, carichi negativamente, si muovono tutti con la stessa mobilità, la separazione avviene in base agli effetti del setaccio molecolare dovuti alle dimensini dei pori del gel v E q f V d q f

17 x Marcatori di Mr e calcolo della massa delle proteine y R f = x/y La Mr di una proteina può essere determinata confrontando la sua mobilità con quella di una serie di proteine aventi Mr nota (standard), che vengono separate sullo stesso gel. Si riporta in grafico la distanza percorsa da ciascuna delle proteine standard, in funzione del logaritmo in base 10 del suo Mr, costruendo una curva di calibrazione. Si misura quindi la distanza di migrazione della proteina avente Mr incognita e per interpolazione si ottiene il valore di Mr cercato

18 Rivelazione -Si sfrutta l'assorbimento e o la fluorescenza nell'ultravioletto. -Per un'analisi nel visibile si ricorre a una colorazione preventiva. Coomassie Blue ( ng) Silver Nitrate (1-2 ng) -Per gli enzimi è possibile sfruttare l attività per ottenere prodotti colorati insolubili. -Se invece il composto è radioattivo si procederà con l'autoradiografia.

19 ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE 2D-PAGE

20 2D-PAGE Estrazione Prima Dimensione Seconda Dimensione Analisi di immagine Escissione

21 I DIMENSIONE ISOELETTROFOCALIZZAZIONE (IEF) in condizioni denaturanti (Urea, Detergenti non ionici, agenti riducenti) su supporti di gel di poliacrilammide contenenti un gradiente di ph: separazione in base al punto isoelettrico + - 7,2 8,8 3,9 3,9 7,2 8,8 5,3 3,9 7,2 ph 3 ph 10 3,9 3,9,9 5,3 7,2 7,2 8,8 7,2 8,8

22 II DIMENSIONE SDS-PAGE: separazione in base al peso molecolare I dimensione ph 3 ph 10 T1 T2 T II dimensione +

23 . Esempio di elettroforesi bidimensionale ad elevata risoluzione E. coli 2-D map Lisato totale I dimensione: strip 18cm ph 3-10 NL II dimensione: gel di poliacrilammide con gradiente 9 16 %T colorato con Nitrato d argento.

24 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Procedura ideale: Solubilizzazione completa, denaturazione e riduzione di TUTTE le proteine del campione. Metodi Lisi (cellule, tessuti, organi ) sonicatore, omogeneizzatore, mortaio, pressa, ecc. Solubilizzazione e denaturazione detergenti (non-ionici, zwitterionici) Agenti caotropici (denaturanti) Riduzione Agenti riducenti Se necessario Rimozione di sostanze interferenti Pre-frazionamento (step di purificazione)

25 UREA L urea è l agente denaturante più utilizzato, in casi specifici con problemi di solubilizzazione si può utilizzare la tiourea. Normalmente si utilizza urea 8M, ma anche miscele di tiourea 2M e urea 5-8M. DETERGENTI I detergenti vengono aggiunti per rompere interazioni idrofobiche e incrementare la solubilità proteica. I detergenti devono essere non ionici o zwitterionici. Di solito il CHAPS AGENTI RIDUCENTI Necessari per rompere i ponti disolfurici S-S e mantenere in forma ridotta le proteina. Si utilizzano o ditiotreitolo (DTT) o tributil-fosfina (TBP). ANFOLITI Per ogni range di ph una miscela di anfoliti carrier che aumentano la solubilità del campione e generano una conduttività più uniforme attraverso il gradiente di ph durante l IEF

26 Prima dimensione: IEF Il punto Isoelettrico di una proteina Le proteine sono molecole anfipatiche dotate di gruppi acidi e basici. ph<pi ph=pi ph>pi Ogni proteina ha un particolare punto isoelettrico. La carica netta della proteina dipende dal ph dell ambiente in cui essa si trova. Quando il ph è uguale al pi della proteina, la carica netta diventa ZERO.

27 IEF: principi della separazione ph basso: Le proteine vengono protonate Carica positiva Anodo Anodo IPG strip Campo elettrico Proteine acide ph alto: Le proteine vengono deprotonate carica negativa Le proteine cariche migrano all interno del gradiente di ph Catodo Quando le proteine raggiungono il valore di ph corrispondente al proprio pi, la loro carica netta diviene zero ed esse focalizzano come bande discrete Catodo Proteine basiche

28 GRADIENTI di ph IMMOBILIZZATI Il gradiente di ph: viene creato con set di tamponi derivati dall acrilammide. è copolimerizzazto entro le fibre della matrice di poliacrilammide CH 2 CH C N R R= -COOH oppure N(CH3)2 O H IMMOBILINE La copolimerizzazione di questi monomeri con diverso pka in diversa concentrazione permette di creare dei gradienti preformati di ph all'interno del gel. Una volta integrate nel gel, le immobiline conferiscono una capacità tamponante controllata e una bassa conduttività all'interno del gradiente

29 VANTAGGI del gradiente immobilizzato possibilità di reperire in commercio gel preformati minimizza variazioni dovute alla preparazione dei gel; i gel vengono preparati su una pellicola di plastica che ne facilita l utilizzo; i gradienti di ph sono stabili nel tempo e non subiscono alterazioni dovute alla presenza del campione stesso I gradienti sono praticamente continui e possono essere costruiti secondo diverse esigenze: lineari/non lineari; ampi (ad esempio ph 3-10)/molto ristretti ( ph 4-5)

30 Gradiente lineare e non lineare

31 Usando gradienti di ph stretti (1 unità) la risoluzione aumenta e i gel possono anche tollerare carichi proteici maggiori

32 Innovazione!! Immobilized ph Gradient strip = IPG strip Sottili strisce di gel di poliacrilamide al 5% T polimerizzato su un supporto di plastica Utilizzano gradienti di ph immobilizzati Acquistate in commercio oppure prodotte direttamente in laboratorio Disponibili in differenti lunghezze e range di ph (7, 11, 13, e 18 e 24 cm) Disidratate Devono essere reidratate prima dell IEF

33 Volumi calcolati di liquido da applicare per la reidratazione occorre rispettare i limiti di volume e quantità di proteina caratteristici del tipo di strip che si sta utilizzando Volumi maggiori entrata prefereneziale di molecole a basso peso molecolare (prima acqua poi altri ioni e per ultime proteine ad alto PM). Volumi minori il gel non si rigonfia alle opportune dimensioni. Le dimensioni dei pori della matrice non sono controllati e pari a quello che dovrebbero essere Questo porta ad una difficolta nell analizzare proteine ad alto PM.

34 REDRATAZIONE DELLE STRIP Le IPG strips sono reidratate over night nel Immobiline DryStrip Reswelling Tray La soluzione di reidratazione è applicata alle scanalature del supporto In ciascuna scanalatura viene posta una strip Ogni strip viene coperta con il IPG Cover Fluid (olio di paraffina) per minimizzare l evaporazione e la cristallizzazione dell urea e per evitare il contatto con la CO2 che se adsorbita dal gel può provocare un acidificazione della matrice con conseguente errata lettura dei punti isoelettrici Immobiline DryStrip reswelling tray

35 Rehydration loading CARICAMENTO DEL CAMPIONE Il campione viene diluito nella soluzione di reidratazione (tutti i campioni devono essere normalizzati: stessa quantità di campione) e pre-adsorbito sulle strip durante la loro reidratazione. Cup loading Il gel viene reidratato seguendo una procedura analoga a quella utilizzata per il caricamento a reidratazione, con la sola differenza che non c è campione proteico durante tale fase. Al termine della reidratazione, il gel viene collocato capovolto (gel verso l alto) in un apposita vaschetta. Sul gel, in una determinata posizione (a seconda che sia un caricamento anodico o catodico) viene collocata un apposito applicatore dentro il quale viene caricato il campione. La corsa di isoelettrofocalizzazione in questo caso viene effettuata sempre a testa in sù.

36 Cup loading Ettan IPGphor Manifold

37 Rehydration loading strip holder Ettan IPGPhor (Amersham Bioscience)

38 Si pipetta il campione in entrambi i pozzetti laterali dello strip holder

39 Isolelettrofocalizzazione Non esiste un protocollo di isolelettrofocalizzazione universale ogni singolo passo deve/può essere ottimizzato in funzione del campione in indagine. regole generali : Il voltaggio può essere aumentato sia in modo lineare (ramping) sia in modo brusco (step and hold) Temperatura: mantenuta attorno ai 20 C: più bassa l urea cristallizza, più alta (>37 C) l urea modifica le proteine. Voltaggi vengono aumentati progressivamente (secondo particolari protocolli) per fare in modo che nelle prime fasi della IEF gli ioni presenti nel campione (ioni presenti nel campione, lysis buffer o controioni dei gruppi acidi o basici del gel) vengano trasportati al di fuori del gel Migrazione in campo elettrico Es.: per le strip da 7 cm ph 3-10 lineare Step 1: 500 V, 0:01 h Step 2: 4000 V, 1:30 h Step 3: 5000 V, 0:45 h 50 ua per strip In totale ~7.1 kvh, 2:16 h Multiphor II Temperatura costante 20 C IPGphor

40 Passaggio dalla I alla II dimensione = = La transizione dalla prima alla seconda dimensione coinvolge l equilibrazione della striscia focalizzata in tampone contenente SDS e la riduzione e alchilazione dei pondi disolfurici mediante l uso di DDT (ditiotreitolo) e IAM (iodoacetamide) per bloccare in modo covalente i gruppi SH delle proteine, prevenendo la formazione di ponti disolfurici durante la seconda dimensione. S-S TBP or DTT - DTE H 2 O H + S-S TBP + H O - 2 H + S - - S TBP =O I NH 2 O SH S HI NH 2 O

41 Step di Equilibrio Tampone di Equilibrio (Tris-HCl 50 mm ph 8.4) mantiene il ph della strip nel range appropriato per l elettroforesi. Urea (6 M) Riduce gli effetti dell elettroendosmosi aumentando la viscosità del tampone. L elettroendosmosi (EEO) è dovuta alla presenza di cariche negative fissate sulla IPG strip. EEO causa un flusso di acqua che ostacola la migrazione delle proteine e può interferire con il trasferimento delle stesse dalla strip al gel della seconda dimensione Glycerol (30 %) Riduce gli effetti dell elettroendosmosi e facilita il trasferimento delle proteine dalla strip al gel per la seconda dimensione. SDS (2 %) Denatura le proteine e le carica negativamente. Step 1: Ditiotreitolo (DTT) (2 %) 15 minuti Riduce i ponti disolfuro preservando lo stato denaturato delle proteine. Step 2: Iodoacetammide (IAA) (2.5 %) 10 minuti Alchila i gruppi tiolici delle proteine prevenendo la riossidazione dei ponti disolfuro durante l elettroforesi. Blu di Bromofenolo (BFB) (tracce) Colorante consente di seguire l andamento della migrazione.

42 II Dimensione: SDS-PAGE Principi della separazione SDS-PAGE classica 2D-PAGE L SDS riveste le proteine La miscela di proteine viene caricata sul gel e fatta migrare in campo elettrico Separazione delle proteine in base al peso molecolare Gel di poliacrilammide Direzione della migrazione Visualizzazione delle bande Proteiche mediante colorazione Lo stacking gel è costituito dalla IPG strip. La IPG strip viene fissata con Agarosio 0.5% STEP DI EQUILIBRIO (tra la I e la II dim) Riduzione/Alchilazione in una soluzione contenente SDS

43 II Dimensione: SDS-PAGE Trasferimento della strip equilibrata sul gel SDS-PAGE ETTAN Daltsix MINI PROTEAN

44 . Esempio di elettroforesi bidimensionale ad elevata risoluzione E. coli 2-D map Lisato totale I dimensione: strip 18cm ph 3-10 NL II dimensione: gel di poliacrilammide con gradiente 9 16 %T colorato con Nitrato d argento.

45 VISUALIZZAZIONE Una volta separato il campione in elettroforesi si procede alla colorazione del gel La scelta della colorazione dipenderà soprattutto dalla quantità di proteine caricate. Le colorazioni non devono interferire con i processi successivi sensibilità Nitrato di Argento fino a 0,1 ng Commassie Brilliant Blue (CBB) Colloidale G-250: circa 5 10 ng) Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 : circa ng coloranti fluorescenti SYPRO Ruby (Molecular Pobes) o il Deep Purple (GE Ealthcare

46 Grazie al suo elevato potere risolutivo, l'elettroforesi bidimensionale è una tecnica che permette la separazione contemporanea, su di un unico gel, sia dei prodotti genici primari sia delle modificazioni successive eventualmente presenti. Utilizzando l'elettroforesi 2D, dove ogni macchia proteica ha una posizione univoca determinata dal peso molecolare e dal punto isoelettrico, si può studiare come al variare delle condizioni sperimentali, cambi qualitativamente (presenza/assenza) e/o quantitativamente (intensità) l'espressione di gruppi o singole proteine, così come possono essere studiate le modificazioni posttraduzionali (fosforilazioni, glicosilazioni, ossidazioni, etc.) che coinvolgono singoli componenti o gruppi di proteine. Una proteina che esiste in forma mono-, bi-, e trifosforilata può apparire come una singola banda su un gel in SDS monodimensionale (La presenza di uno o due gruppi fosfato in più non ha un effetto significativo sulla massa molecolare relativa totale della proteina) ma può generare più bande su un gel bidimensionale (la piccola differenza di carica introdotta su ogni molecola può essere invece rilevata dall IEF)

47 APPLICAZIONI Confrontare tessuti normali con tessuti malati e/o trattati Analizzare l effetto del trattamento, con farmaci o tossine, sulle cellule Osservare i cambiamenti della componente proteica della cellula a stadi diversi dello sviluppo del tessuto Osservare la risposta a stimoli extracellulari Confrontare ceppi batterici patogenici e non patogenici Confrontare i profili proteici del siero di individui sani con quelli malati (es. Alzheimer, tumori) per identificare proteine, prodotte nel siero dei pazienti, che possano essere utilizzate come indicatori diagnostici per le malattie Evidenziare l eventuale presenza di glicosilazioni, fosforilazioni o processamenti proteici