CAPITOLO 2 PROBLEMI AGGIUNTIVI CON SOLUZIONE

Transcript

1 CAPITOLO 2 1. Che cosa indica, probabilmente, la modalità di trasmissione verticale in un pedigree? R. Carattere raro dominante 2. Calcolate la probabilità che sia prodotto un genotipo recessivo omozigote per il seguente incrocio: AaBbccddEeFf AaBbCcddEeFf R. ¼ ¼ ½ 1 ¼ ¼ = 1/ Calcolate la probabilità di avere o tutti genotipi dominanti o tutti genotipi recessivi per gli alleli A, B, E, e F nel seguente incrocio: AaBbccddEeFf AaBbCcddEeFf R. ( ¾ ¾ ¾ ¾ ) + ( ¼ ¼ ¼ ¼ ) = 81/ /256 = 82/256 = 41/ Quali sono i quattro argomenti generali che sono derivati dal lavoro di Mendel? R. La variabilità, in quanto espressa in forme alternative di un carattere, è vasta in natura. Una variabilità osservabile è essenziale per seguire l eredità dei caratteri. La variabilità non è distribuita solo a caso ma è ereditata secondo il dogma genetico che ogni simile genera un suo simile. Le leggi di Mendel si applicano a tutti gli organismi che si riproducono sessualmente. Quali sono i possibili genotipi delle persone 1, 2, 3 e 4? 5. Persona 1 R. Aa 6. Persona 2 R. Aa 7. Persona 3 R. Aa 8. Persona 4 R. aa 9. Sotto è riportato un pedigree di una malattia genetica umana, nel quale gli individui affetti sono indicati con il simbolo pieno. Applica le leggi della probabilità e calcola la probabilità che la prole generata da un matrimonio tra cugini a) 2 x 3 avrà la malattia.

2 R. Il carattere è un carattere recessivo: ¼. 10. Stai parlando con tuo padre dei tuoi parenti, ed egli è d accordo con te che c è una malattia a tarda - insorgenza che sembra ricorrere nella sua famiglia. Cosa potresti fare per determinare la tua probabilità di avere questa malattia a tarda insorgenza? R. Creare un pedigree del tuo albero genealogico per la malattia a tarda insorgenza, andando indietro di almeno tre, se non tante generazioni quante possibili. Sulla base del tuo pedigree, avrai bisogno di determinare se il carattere sia recessivo o dominante, autosomale o legato all X. Usa la regola del prodotto per calcolare la probabilità di avere ereditato il carattere. Tieni a mente che gli individui non sufficientemente anziani da mostrare il carattere dovrebbero essere indicati come non noti sul tuo pedigree e la tua probabilità di ereditare la malattia dipenderebbe dal fatto che quel dato individuo abbia il carattere.

3 CAPITOLO 3 Il colore del pelo, in alcune specie di coniglio, è governato da alleli multipli. La gerarchia, con riferimento alla dominanza per questi alleli, è come segue: Colorato (c + ), Cincillà, (c ch ), Himalayano (c h ) e Albino (c). Fornire i fenotipi e i rapporti risultanti dai seguenti incroci. 1.. c + c c h c h R. 1 colorato: 1Himalayano 21. c + c + c h c ch R. Tutti colorati 2. c + c c h c R. 2 colorati: 1 himalayano: 1 albino 3. c c c h c ch R. 1 himalayano: 1 cincillà 4. c + c h c h c ch R. 2 colorati: 1 himalayano: 1 cincillà 5. c + c ch c h c ch R. 2 colorati: 2 cincillà 6. c c c+c ch R. 2 colorati: 2 cincillà 7. In un determinato tipo di piante, il verde scuro è determinato dal gene dominante G e il verde chiaro è determinato dal gene recessivo g. L eterozigote mostra il 75% di penetranza e apparirà fenotipicamente verde scuro. Se l incrocio parentale è GG x gg; quali fenotipi potrebbero essere osservati in una popolazione di 400 piante F 2? R. 250 verde scuro; 150 verde chiaro 8. Un uomo con gruppo sanguigno A, il cui padre era gruppo sanguigno 0, ha sposato una donna di gruppo sanguigno B, la cui madre era di gruppo sanguigno 0. Quali sono i possibili gruppi sanguigni della loro prole? R. Sono possibili i gruppi sanguigni A, B, AB, e Quali fenotipi e genotipi ti aspetteresti dal seguente incrocio? I B i rh + rh + I A i rh + rh - R. I B I A rh + rh - AB positivo I B I A rh + rh + AB positivo I B irh + rh - B positivo I B irh + rh + B positivo IAirh + rh - A positivo IAirh + rh + A positivo ii rh + rh - O positivo ii rh + rh + O positivo

4 10. Sei un giudice in una causa civile in cui un giovane uomo sta tentando di provare che è il figlio illegittimo di un uomo molto ricco morto di recente. Egli desidera essere incluso nella distribuzione delle sue ricchezze. Dopo avere considerato tutte le testimonianze relative al concepimento di questa persona, la prova chiave sembra venire da due fatti principali. L uomo facoltoso e la madre del giovane sono entrambi sordi, il giovane no. Quindi l avvocato di famiglia suggerisce che l uomo facoltoso non sia il padre. La madre, l uomo facoltoso e il giovane hanno tutti gruppo sanguigno 0, MM, Rh-, a livello fenotipico, ma il processo per individuare il genotipo indica che quest ultimo è, in realtà, di gruppo sanguigno I A I A hh. Come interpreti la prova presentata e come ciò influenza la tua decisione in questo caso legale? R. Il fatto che il giovane possa sentire non è una prova a sfavore che egli sia il figlio dell uomo ricco. Due individui sordi possono, tramite complementazione, generare prole in grado di udire, se la mutazione che portano è su geni differenti (l udito è un carattere poligenico). La prova del gruppo sanguigno è decisamente a favore del fatto che l uomo benestante non sia il padre del giovane. Sebbene entrambi i genitori putativi e il figlio in questione abbiano gruppo sanguigno 0, l uomo facoltoso è geneticamente di gruppo A e fenotipicamente di gruppo 0, dovuto all omozigosità recessiva dell allele h, che determina il fenotipo Bombay; la proteina alla quale lo zucchero A si attacca viene persa, rendendo quindi l uomo ricco fenotipicamente di gruppo 0. Ogni suo figlio dovrebbe avere, con elevata probabilità, l antigene-a perché l allele h è molto raro negli uomini, rendendo la prole omozigote recessiva estremamente improbabile, eccetto che nei matrimoni tra consanguinei. 11. Nel grano, sono necessari 3 geni dominanti per produrre il colore bruno del chicco. Il genotipo B D R produce un fenotipo colorato. L individuo omozigote recessivo per un gene non è colorato. Indicate il genotipo e il fenotipo della progenie derivante dall incrocio BbDdRR BbDdRR R. Fenotipo: 9 Colorati; 7 non colorati Rapporto dei genotipi 1 BBDDRR 2 BbDDRR 2 BBDdRR 4 BbDdRR 1 bbddrr 2 bbddrr 1 BBddRR 2 bbddrr 1 bbddrr 12. Quali fenotipi e genotipi vi aspettate dal seguente incrocio? I B i rh + rh + I A i rh + rh - R. I B I A rh + rh - I B I A rh + rh + I B irh + rh - I B irh + rh + IAirh + rh - IAirh + rh + ii rh + rh - ii rh + rh + AB positivo AB positivo B positivo B positivo A positivo A positivo O positivo O positivo I geni A e B sono richiesti per l espressione del colore. Se A o B sono assenti ( a o b ) il risultato è assenza di colorazione. Indicate i genotipi e i fenotipi per ogni F 1 e F 2 riportate sotto.

5 F1 F2 Genitori Genotipo Fenotipo Genotipo Fenotipo 48. AAbb aabb 49. aabb aabb 50. AAbb aabb 13. AAbb aabb (R. F =Aabb/non colorato; F 2 = 1AAbb:2Aabb:1aabb/tutti non colorati) 14. aabb aabb (R. F 1 =aabb/non Colorato; F 2 = 1aaBB:2aaBb:1aabb/tutti colorati) 15. AAbb aabb (R. F 1 =AaBb Colorati; F 2 =9 Colorati; 7 non colorati) Genotipo Fenotipo F 1 =AaBb Colorato F 2 =1AABB Colorato 2AABb Colorato 2AaBB Colorato 4AaBb Colorato 1aaBB Non Colorato 1AAbb Non colorato 2aaBb Non Colorato 2Aabb Non Colorato 1aabb Non Colorato Le cinque madri riportate in tabella (a, b, c,d,e) con il proprio fenotipo, generano un figlio ciascuna il cui fenotipo è descritto tramite il gruppo sanguigno (A,B,0), gli antigeni M o N, e il fattore Rh. Per ogni figlio individua il padre tra i cinque genotipi maschili riportati. (ii =gruppo sanguigno tipo 0) [rr = rh - e R = rh + ] Fenotipo materno Fenotipo dei figli

6 (a) A M R O M R (b) B N r O N r (c) O M r A MN R (d) A N R AB MN R (e) AB MNr A MN r Genotipo dei possibili padri 1. I A i MN rr 2. I B i MN RR 3. iinnrr 4. iimmrr 5. I A I A MNRR 16. Figlio (a) = Padre (R. 1 o 4) 17.Figlio (b) = Padre (R. 1 o 3) 18.Figlio (c) = Padre (R. 5) 19. Figlio (d) = Padre (R.2) 20. Figlio (e) = Padre (R.1 o 3 o 4)

7 CAPITOLO In Drosophila, ali vestigiali (vg) è un allele mutante recessivo autosomale, e corpo giallo (y) è un allele mutante recessivo legato all X. Gli alleli selvatici vg + e y + controllano, rispettivamente, ali normali e corpo colore marrone scuro. Se una femmina omozigote corpo giallo, ali vestigiali, è incrociata con un maschio normale e le mosche della progenie F 1 sono incrociate tra loro, quali saranno i fenotipi e i rapporti della F 1 e della F 2? Soluzione F 1 femmine: tutte corpo marrone, ali normali maschi: tutti corpo giallo, ali normali F 2 femmine e maschi: corpo marrone, ali normali 3/8 corpo marrone, ali vestigiali 1/8 corpo giallo, ali normali 3/8 corpo giallo, ali vestigiali 1/8 12. In Drosophila, occhi bianchi (w) e corpo giallo (y) sono entrambe mutazioni recessive legate all X. Gli alleli selvatici, w + e y +, controllano, rispettivamente, occhi rossi e colore del corpo scuro. Se una femmina omozigote corpo giallo, occhi rossi, è incrociata con un maschio corpo scuro, occhi bianchi, e le mosche della progenie F 1 sono incrociate tra loro, quali saranno i fenotipi e i rapporti della F 1 e della F 2? Soluzione F 1 femmine: tutte corpo scuro, occhi rossi maschi: tutti corpo giallo, occhi rossi F 2 femmine: corpo giallo, occhi rossi 1/2 corpo scuro, occhi rossi 1/2 maschi: corpo giallo, occhi rossi 1/2 corpo scuro, occhi bianchi 1/2 13. Supponi di avere scoperto una nuova mutazione nei topi che ha causato spina dorsale curva. Hai notato che questa mutazione era visibile solo nelle femmine. Quando femmine spina dorsale curva venivano incrociate con maschi normali, la progenie era sempre ottenuta nel rapporto: 1/3 femmine spina dorsale curva, 1/3 femmine normali, 1/3 maschi normali. Spiega le basi genetiche di questo rapporto. Soluzione Il gene è legato all X; l allele spina dorsale curva è dominante sull allele normale in eterozigosi, ma causa letalità in maschi emizigoti. 14. In incroci di femmine di Drosophila occhi bianchi con maschi occhi rossi, Bridges recuperò figlie occhi bianchi e figli occhi rossi con un rapporto di circa uno ogni 2000 discendenti. (Molti dei discendenti erano maschi occhi bianchi e femmine occhi rossi). Egli ipotizzò che questa progenie eccezionale risultasse dalla non disgiunzione dei cromosomi X alla meiosi femminile. Perché egli sospettò che la non disgiunzione stesse avvenendo nella madre? Quali tipi di progenie potrebbero derivare da non disgiunzione nel padre?

8 Soluzione femmine occhi rossi XXY e maschi occhi bianchi XO, quindi la non disgiunzione maschile non spiega le eccezioni osservate. 15. In incroci di femmine di Drosophila occhi bianchi con maschi occhi rossi, Bridges recuperò figlie occhi bianchi e figli occhi rossi con un rapporto di circa uno ogni 2000 discendenti. (Molti dei discendenti erano maschi occhi bianchi e femmine occhi rossi). Egli ipotizzò che questa progenie eccezionale risultasse dalla non disgiunzione dei cromosomi X alla meiosi femminile. Qual è il cariotipo atteso dei maschi eccezionali occhi rossi? Fornisci due modi per verificare questo cariotipo predetto. Soluzione XO, verifiche-1) esaminare i nuclei per il cromosoma Y, 2) testare la fertilità dei maschi.

9 CAPITOLO unità di mappa è la distanza di mappa massima misurabile tra due geni in un saggio a due punti, tuttavia alcuni cromosomi umani sono oltre le 200 unità di mappa in lunghezza. Spiega questa discrepanza. R. I saggi a due punti non calcolano i doppi crossover, ciò perché 50 unità di mappa è il massimo che può essere misurato. Ma a 200 unità di mappa il cromosoma ha una media di quattro crossover per meiosi. Nei piselli, il carattere fiori alti (T) è dominante su fiori bassi (t), il carattere fiori rossi (R) è dominante su fiori bianchi (r), e foglie larghe (W) è dominante su foglie strette (w). Una pianta alta, rossa, foglie larghe, è incrociata con una pianta bassa, bianca e foglie strette, e la progenie è la seguente: Alta rossa foglia larga 381 Alta bianca foglia larga 122 bassa rossa foglia larga 118 Bassa bianca foglia larga Quale è il genotipo del genitore alto, rosso, foglie larghe? R. TtRrWW. 3. Stabilisci le relazioni di linkage R. T/t e R/r sono associati e distano 24 unità di mappa. L associazione di W/w è sconosciuta. 4. Un ceppo di Neurospora con il genotipo MN è incrociato con un ceppo che è mn. Metà della progenie è MN e metà mn. Spiega questi risultati. R. I geni M e N sono completamente associati, così non sono prodotti ricombinanti. 5. Desideri verificare l ipotesi che i geni C e D non siano associati. Quali sono i valori attesi per ogni classe, assumendo che i geni non siano associati? R. 250 per ognuno. 6. Calcola C 2 per verificare l ipotesi che i geni Ce D non siano associati. R. X 2 = Determina i gradi di libertà e calcola il valore di p. R. df = 3; p < Illustra che cosa significa valore p. C è meno di 1 probabilità su 100 che le deviazioni dall atteso siano maggiori di quelle che potrebbero essere state generate dal caso, o, più semplicemente, c è meno di 1 probabilità su 100 che i geni Ce D siano associati. 9. Quale avrebbe potuto essere il risultato di questo test se fossero stati contati solo 100 figli e fossero state osservate le stesse proporzioni? R. X 2 avrebbe dovuto essere tra 1,0 e 2,0, così p sarebbe stata più grande di 0,5; non saremmo stati in grado di escludere l ipotesi che non ci sia associazione. Supponi che l intervallo di mappa per un particolare cromosoma umano sia: a-1-b-1-c-1-d-1-e-1-f, in cui i numeri indicano le distanze di mappa.

10 10. In un uomo eterozigote per tutti i 6 geni, quale percentuale del suo sperma dovrebbe essere ricombinante nell intervallo a-f? R. 5%

11 CAPITOLO 6 1. Un evento di ricombinazione illegittima può avvenire tra i cromosomi umani X e Y. Da questo evento si potrebbe generare uno spermatozoo con il cromosoma Y mancante di SRY ( la regione di determinazione del sesso). Che tipo di individuo potrebbe generare la fecondazione di un uovo da parte di questo particolare spermatozoo? Indicate sia il genotipo che il fenotipo. (R. Un individuo XY che si sviluppa come femmina.) 2. Un DNA circolare di 5.0 kb viene tagliato con l enzima di restrizione EcoRI, il quale è in grado di tagliare il DNA a doppio filamento. I frammenti derivanti dal taglio sono rispettivamente di 3.0 kb e 2.0 kb. Quando lo stesso frammento di DNA di 5 kb viene tagliato con HindIII, l enzima effettua un solo taglio. Descrivete brevemente come potreste determinare se il sito di HindIII si trova nel frammento EcoRI di 3 kb o nel frammento EcoRI di 2 kb. ( Assumete che il sito di HindIII si trova a meno di 500 bp da ogni sito EcoRI) (R. Una doppia digestione con EcoRI e HindIII potrebbe indicare quale frammento EcoRI viene inoltre tagliato con HindIII.) 3. Griffith scoprì che la forma liscia (S) di S. pneumonite possedeva una capsula polisaccaridica mentre la forma rugosa (R) ne era sprovvista. Solo la forma S risultava essere virulenta. Descrivete brevemente come Griffith dimostrò la trasformazione usando batteri R vivi e batteri S morti. (R. S HK non causa infezione. R live non causa infezione. S HK +R live = infezione; i batteri R vengono trasformati con i batteri S.) 4. Quando Meselson e Sthal effettuarono l esperimento che dimostrò la natura semiconservativa del processo di replicazione, utilizzarono E.Coli e due isotopi dell azoto ( 15 N e 14 N). Spiegate brevemente quale sarebbe stato il risultato se la replicazione del DNA fosse stata conservativa. (R. A seguito della centrifugazione, la prima generazione di replicazione avrebbe dovuto produrre 2 bande, una per 15 N e una 14 N (no ibrido). La seconda generazione avrebbe dovuto produrre ancora lo stesso pattern senza rilevare il pattern ibrido.) 5. Siete dei ricercatori di una nuova company biotecnologica. Vi è stato chiesto di escogitare un piano per produrre la proteina X, la quale ha un importante effetto nel trattamento del cancro umano, attraverso l uso di batteri. La proteina X non è una proteina batterica nativa. Descrivete brevemente la vostra strategia. (R. Una strategia potrebbe essere la seguente: clonate il gene X in un appropriato plasmide attraverso l uso di enzimi di restrizione e ligasi. Introducete poi il plasmide dentro un ospite batterico cosicché la cellula produrrà la proteina X (la quantità prodotta è quella non tossica per l ospite.) 6. Progettate un esperimento per vagliare, attraverso evidenze fisiche, l ipotesi che durante la ricombinazione le molecole di DNA si rompono e si riuniscono. (R. Batteriofagi precedentemente cresciuti con isotopi pesanti o leggeri dell azoto o del carbonio e successivamente centrifugati in gradiente di CsCl, possono essere usati per seguire la rottura della molecola a seguito dell infezione dei batteri e la conseguente ricombinazione. La presenza nei fagi ricombinanti di una banda a densità intermedia tra il del DNA fagico di controllo pesante e leggero, indica l avvenuta rottura e riunione.) 7. I virus possono avere RNA, ssdna, o dsdna come molecola dell eredità. Progettate un esperimento che vi permetta di determinare il sistema di trasmissione di un virus sconosciuto. (R. Infettate dei batteri in crescita con il virus in presenza di uracile radioattivo. Se il virus contiene

12 RNA il materiale genetico isolato sarà radioattivo. Per determinare se il DNA è a doppio filamento o un singolo strand effettuate una digestione con enzimi di restrizione.)

13 CAPITOLO 7 1. I genetisti hanno scoperto mutazioni riguardanti la vista che causano un cono blu monocromatico. Che cos è e come agiscono tali mutazioni? (R. Il cono blu monocromatico è una malattia genetica associata all X che colpisce la funzione dei coni del rosso e del verde, causando daltonismo per il rosso e verde. Sono state identificate sette diverse delezioni che causano questa malattia.) 2. In che modo il DNA può essere alterato rispettivamente da idrolisi, radiazioni, luce UV e ossidazione? (R. L idrolisi di basi A o G sul DNA comporta una depurinazione, il filamento di DNA si presenta come uno scheletro continuo di zucchero ma con basi aspecifiche nei siti di depurinazione. I raggi X rompono lo scheletro di zucchero mentre la luce UV induce dimeri di timida. I radicali liberi dell ossigeno ossidano le basi trasformandole in analoghi che non formano legami idrogeno corretti nel doppio filamento di DNA. Durante la replicazione, la riparazione del mismatch comporta un cambiamento di base che causa mutazione.) 3. Che tipo di mutazione avviene nella malattia genetica Xeroderma pigmentosa e quali sono le conseguenze? (R. Gli individui affetti da Xeroterma pigmentosa presentano una mutazione nell escissione riparativa, i pazienti affetti da questa malattia sono privi di un attività enzimatica necessaria per riconoscere e rimuovere i dimeri di timina.) 4. Cosa sono gli hot spot? R. Gli hot spot sono siti all interno di un gene che mutano più frequentemente rispetto ad altri siti. 5. Quali sono le due ipotesi analizzate nel test di fluttuazione di Luria-Delbruck? (R. Ipotesi 1: le resistenza è una risposta fisiologica Ipotesi 2: la resistenza aumenta in seguito a mutazioni casuali) 6. Quale tecnica utilizzereste per verificare l ipotesi che esistono batteri resistenti a più antibiotici in una popolazione eterogenea? (R. La tecnica di replicazione in piastra. Ogni piastra, contenente l antibiotico da testare, indicherà la resistenza all antibiotico di singoli batteri all interno di una popolazione.) 7. Una sostanza chimica X è stata appena analizzata con il test di Ames. Sono stati testati un totale di 5000 batteri a concentrazioni di M, 1 M, 0.1M e 1M e, per ognuna delle quali, sono cresciute rispettivamente 4, 1, 0 e 200 colonie. Nella piastra di controllo su terreno minimo con aggiunta di istidina sono state rilevate 5000 colonie mentre nel solo terreno minimo solo due colonie. Interpretate questi dati. (R. La piastra di controllo con istidina contiene 5000 colonie che indicano il numero totale dei batteri presenti nel campione. La piastra di controllo priva di istidina contiene 2 colonie, questo indica che il tasso naturale di reversione all istidina è 2/5000. Solo l alta concentrazione 1M della sostanza X causa reversione all istidina e il tasso di reversione, significativamente più alto rispetto al controllo, indica che la sostanza chimica X è mutagena solo ad alte concentrazioni.) 8. Un negozio di animali riceve diverse spedizioni di furetti albini. Avete scelto due maschi e due femmine; una coppia generata dalla stessa figliata e l altra da due figliate diverse. Alla nascita dei

14 vostri furetti, una generazione presenta una normale pigmentazione. Indicate quale generazione è albina e quale pigmentata e spiegate il perché. (R. La coppia derivante dalla stessa figliata dovrebbe avere una progenie albina ( dovrebbero portare una mutazione nello stesso gene) mentre, la coppia con madre e padre senza legami di parentela, potrebbero avere una progenie pigmentata se ognuno dei due genitori porta una mutazione in geni diversi coinvolti nella pigmentazione. Ciascuna delle mutazioni dei due furetti albini non imparentati complementa con altre deficienze genetiche producendo prole pigmentata.)

15 CAPITOLO 8 1. Descrivete le differenze tra mutazioni neomorfe, ipomorfe e ipermorfe. R. Una mutazione ipomorfa produce una quantità minore di proteina o una proteina con attività ridotta. Una mutazione ipermorfa produce una quantità di proteina maggiore rispetto alla quantità wild type, oppure la stessa quantità ma con maggiore attività. Una mutazione neomorfa produce un nuovo fenotipo. 2. Che cos è una mutazione nulla? R. Una mutazione nulla abolisce la funzione di una proteina. 3. Immaginate di essere degli studenti che lavorano per un capo ad una ricerca top secret. Vi è stato chiesto di completare degli esperimenti di traduzione in vitro usando una cultura cellulare segreta con lo scopo di determinarne il codice genetico poiché credete che queste cellule derivino da una forma di vita extraterrestre. Dato che avete determinato che i nucleotidi del DNA sono uguali a quelli terrestri ma le cellule contengono soltanto10 aminoacidi, descrivete come potreste determinare il codice genetico delle cellule extraterrestri. R. L analisi delle mutazioni indotte da intercalanti determina la grandezza del codone. Il codice poi potrebbe essere decifrato attraverso l uso di corte molecole sintetiche di RNA in un sistema di traduzione in vitro. L unione di un singolo aminoacido radioattivo ad un trna permetterebbe di testare questo aminoacido separatamente. Il trna con l aminoacido radiomarcato, più un codone singolo potrebbe essere miscelato con un lisato contenente ribosomi. La miscela poi potrebbe essere purificata per filtrazione poichè il complesso ribosoma+trna, essendo troppo grande, non riesce a passare attraverso il filtro. Una volta che sul filtro è presente radioattività, questo indica che il codone testato codifica per l aminoacido radiomarcato in questione. Per determinare il codice genetico completo dovete testare tutti e dieci gli aminoacidi per tutte le combinazioni di codoni. 4. Che cosa sono le mutazioni silenti, di senso e non senso? Comparandole con un controllo wild-type, quale effetto potrebbero avere queste mutazioni sull analisi Northern e Western? R. Le mutazioni silenti sono mutazioni geniche che non hanno conseguenze a livello di fenotipo. Le mutazioni di senso cambiano il codone in maniera che esso codificherà per un aminoacido diverso, le mutazioni non senso convertono un codone codificante in un codone di stop o vice versa. La grandezza delle bande del Northern blot non dovrebbe cambiare ( il cambiamento in codone di stop non cambia la grandezza dell RNA). È improbabile un cambiamento nell intensità a meno che la regione codificante abbia qualche effetto sconosciuto sulla regolazione. In un Western blot, mutazioni silenti e di senso non dovrebbero causare nessun cambiamento nella grandezza della banda, tuttavia, è probabile che una mutazione non senso diminuisca o aumenti la grandezza di una proteina. 5. Ipoteticamente parlando, una particolare proteina chiamata GOTEAM è formata da 1000 amino acidi ed è nota la sua implicazione nel fenotipo avid football fan (tifoso fanatico). Nel genotipo di alcuni individui è stata trovata una delezione di 2 nucleotidi vicino all estremità 5' del gene GOTEAM. In altri individui è stata trovata nella stessa regione una delezione di 99 basi. Qual è la lunghezza del gene GOTEAM? Quale mutazione pensate possa essere più deleteria per il fenotipo GOTEAM? R. La regione codificante di GOTEAM è lunga 3000 paia di basi. La delezione di 2 bp dovrebbe essere più deleteria perché comporterà un cambiamento del registro di lettura del gene mentre la delezione di 99 bp, essendo un multiplo di 3, produrrà una proteina mancante di una regione di 33 aminoacidi ma, se tale regione non è essenziale per il funzionamento della proteina, la delezione potrebbe non avere importanza o averne poca. 6. State conducendo uno studio su un insolito organismo procariotico, avete clonato e sequenziato un gene interessante e la proteina che codifica. Sebbene abbiate sequenziato il gene molte volte, il codone d inizio

16 viene sempre letto come GTG invece di ATG. Come interpretereste questo risultato? R. L organismo procariotico dal quale avete clonato il gene ha un sito d inizio alternativo; GTG invece di ATG.

17 CAPITOLO 9 1. Quale enzima è usato per generare DNA dai trascritti di RNA, per le genoteche a cdna? R. trascrittasi inversa o DNA polimerasi RNA dipendente 2. L enzima di restrizione EcoRI taglia un frammento lineare di 19kb di DNA in frammenti di 1, 3, 6 e 9kb. Quanti siti EcoRI ci sono nel frammento di 19kb di DNA? R Una genoteca genomica per un organismo con un genoma aploide di bp contiene frammenti di circa 20 kb. Quanti cloni rappresentano un singolo equivalente genomico? R La sequenza amminoacidica parziale di una proteina è met-cys-tyr-trp-gln. Scrivi la sequenza della sonda di DNA che si ibriderebbe al filamento stampo del gene per questa proteina (se più di una base è possibile ad una data posizione, usa / per indicare una miscela di basi). R. 5' ATG TGT/C TAT/C TGG CAA/G 3' 5. Vorresti produrre una grande quantità di una proteina per un gene che hai proprio recentemente clonato dal DNA genomico. Come lo faresti? R. Isola l mrna, fai una trascrizione inversa e crea una genoteca a cdna usando un vettore di espressione. Marca la genoteca con il tuo clone genomico e usa il vettore di espressione per produrre la tua proteina in grandi quantità per la purificazione e per studi ulteriori. Tieni a mente che il vettore di espressione necessita di essere compatibile con l organismo in cui hai bisogno di produrre la tua proteina. In molti casi, i procarioti non possono fare in maniera appropriata proteine eucariotiche, che possono richiedere la produzione in un sistema più costoso ma più adatto.

18 CAPITOLO Che cosa è la FISH e, nell analisi del cariotipo tramite FISH, quale stadio della mitosi è richiesto per mappare un gene? R. Ibridazione in situ fluorescente. La mappatura può essere realizzata solo quando gli interi cromosomi sono visibili: durante la metafase. 2. Che cosa si intende per strategia di sequenziamento per shotgun gerarchici? R. La strategia di sequenziamento per shotgun gerarchici venne usata dal Progetto Genoma Umano, finanziato pubblicamente, per produrre una bozza del genoma umano. Questo approccio a passaggi multipli coinvolge la realizzazione di una genoteca BAC, una mappa di cloni che si sovrappongono in minima parte per ogni cromosoma, l analisi di sequenza di piccoli frammenti clonati dei BAC, e l assemblaggio della sequenza per ogni singolo cromosoma. La Celera impiegò una strategia per shotgun dell intero genoma piuttosto che di un singolo cromosoma, la quale non richiedeva la costruzione di una mappa fisica.

19 CAPITOLO Qual è una stima della distanza di mappa tra le tre coppie di geni collegati? R. A D = 25.3 cm, A E = 10.6 cm, D E = 35.9 cm 2. Quale caratteristica potrebbe distinguere negli spermatozoi il gene legato all Y usando marcatori ASO su un amplificato di PCR? R. L allele in ½ degli spermatozoi 3. Quale caratteristica potrebbe distinguere negli spermatozoi il gene legato all X usando marcatori ASO su un amplificato di PCR? R. L allele in ½ degli spermatozoi I loci dei caratteri quantitativi possono esser esaminati usando linee pure di genitori e misurando un particolare carattere. Se il contributo dell allele a questo fenotipo è equo, allora il numero dei loci può essere individuato. La lunghezza delle setole in Drosophila si comporta come un carattere quantitativo. Se uno dei genitori ha setole di 30 nm e l altro di 10 nm, allora la progenie F1 avrà setole di 20 nm. Se gli individui della F1 vengono incrociati per produrre la generazione F2, si osservano le seguenti classi di individui. Numero della progenie F2 Lunghezza delle setole Quanti diversi genotipi dovreste trovare tra gli individui con setole di10 nm? R.1 5. Quanti diversi genotipi dovreste trovare tra gli individui con setole di 30 nm? R Quanti diversi genotipi dovresti trovare tra gli individui con setole di 15 o 25 nm? R Quanti loci sono coinvolti in questo carattere? R Se si volesse trovare un marcatore fisico legato al gene che determina la lunghezza delle setole, quali individui potrebbero essere i più adatti? R. 10 nm o 30 nm

20 CAPITOLO Esaminando delle cellule al microscopio, noti che ci sono due corpi di Barr presenti in ogni cellula. Qual è molto probabilmente il genotipo delle cellule? R. XXX 2. Sei in ferie in una regione tropicale distante e scopri ciò che sembra essere una anomala colonia batterica ma che potrebbe anche essere una massa di piccoli organismi eucariotici. Pensi che puoi avere scoperto una nuova specie e quindi porti via l animale in una borsa di plastica sistemata nel ghiaccio del tuo refrigeratore. Certamente, la tua nuova forma di vita sarà morta al momento del tuo arrivo in laboratorio, ma i resti potranno dirti molto. Basandoti sulla struttura del DNA, come potresti dire se la tua scoperta è eucariotica o procariotica? R. Sono possibili molte risposte ed includono il digerire il DNA con la DNasi e determinare se siano prodotti multipli regolari di circa 200bp (a causa della protezione esercitata dalla struttura del nucleosoma eucariotico). Le proteine associate al DNA potrebbero essere isolate e le differenze potrebbero indicare se il nuovo organismo fosse procariotico o eucariotico. 3. La manipolazione dei Cromosomi Artificiali di Lievito (YAC) può essere usata per verificare le ipotesi circa la struttura cromosomale eucariotica. Che cosa è uno YAC e come lo utilizzeresti per verificare le ipotesi che c è una lunghezza minima richiesta per una corretta funzione cromosomale? R. Uno YAC è un plasmide batterico con un centromero di lievito, origini di replicazione, sequenze telomeriche e, generalmente, inserito un gene come marker selezionabile. Variando le lunghezze del DNA, potrebbe essere inserito in un plasmide e testato per la normale funzione cromosomale. In questo modo, è stato determinato che un minimo di circa 100,000 bp è necessario per la normale funzione cromosomale.

21 CAPITOLO Che cosa è uno pseudo-linkage? R. Uno pseudo-linkage è caratteristico di un eterozigote per una traslocazione reciproca, in cui i geni localizzati vicino al punto di rottura della traslocazione si comportano come se fossero associati anche se sono derivati da cromosomi non omologhi. 2. Qual è la differenza tra duplicazioni in tandem e non in tandem? R. Le duplicazioni in tandem sono ripetizioni di una regione poste una di seguito all altra. Le duplicazioni non in tandem sono due o più copie di una regione che non sono adiacenti ma possono trovarsi lontane, sullo stesso cromosoma o su cromosomi diversi. 3. Attualmente sappiamo che diversi organismi hanno un elevato grado di sintenia a livello genomico. Desideri verificare l ipotesi che topi di laboratorio e uomo condividano similarità genomiche. Quali test dovresti compiere e, dato che ora sappiamo che i genomi di topo e umano sono altamente sintenici, quali risultati ti dovresti aspettare? R. L analisi del cariotipo può essere utilizzata per verificare l ipotesi di similarità genomiche, comunque solo animali che hanno alta omologia mostreranno dei pattern di bandeggio simili. Quindi, la FISH (ibridazione in situ fluorescente) sarebbe una tecnica molto utile per determinare la sintenia. I genomi di topo e di uomo sono simili in quei circa 170 frammenti somiglianti, con lunghezza media di approssimativamente 18 Mb sono semplicemente riarrangiati (questo non è visibile in un cariotipo). 4. Stai mappando i caratteri nel tuo organismo preferito ma a te sconosciuto, il tuo organismo modello di laboratorio contiene una rara delezione. Come saranno influenzati i tuoi risultati di mappaggio? R. La distanza di mappa sembrerà più piccola della reale distanza fisica nell organismo selvatico. 5. Hai scoperto un fenotipo alterato e clonato il gene responsabile. Comunque, il gene che hai clonato sembra avere una sequenza anomala. Allo scopo di determinare la localizzazione cromosomica del tuo nuovo gene, hai allestito una FISH, usando solo la sequenza atipica, su diversi animali. Con tua sorpresa, i risultati della FISH suggeriscono che ogni animale contiene il gene su un differente cromosoma. Come interpreteresti i tuoi risultati? R. La sequenza anomala è un trasposone e il tuo nuovo fenotipo è stato generato dalla distruzione del suo gene ad opera del trasposone. 6. Sei un maestro giardiniere e la tua pianta preferita di pomodoro è molto sensibile a un pesticida chiamato DEADBUG. Vuoi rendere la tua pianta speciale di pomodoro resistente al pesticida che spruzzi sugli altri cespugli nel tuo giardino. Usando tecniche microbiologiche, fornisci dettagli completi e sufficienti di come lo faresti (includi lo stato di ploidia). R. I granelli di polline aploide sono trattati a freddo e piastrati su piastre di agar. Gli embrioni risultanti sono trattati con un ormone in coltura liquida ed eventualmente cresciuti come una pianta monoploide. La pianta è trattata con un mutageno per indurre mutazioni che possono risultare in insensibilità al pesticida. Le cellule somatiche sono rimosse dalle piante trattate e piastrate su agar contenente DEADBUG. Solo cellule resistenti a DEADBUG cresceranno. L embrione è di nuovo trattato con un ormone e cresciuto in una pianta resistente monoploide. Il trattamento con colchicina permetterà la duplicazione dei cromosomi senza la separazione che ha luogo in una normale pianta diploide.

22 CAPITOLO Un lisato di un trasducente generalizzato P1 da un ceppo selvatico è usato per infettare un ceppo ricevente leu - thr - ara -. Quando i trasduttanti ara + sono selezionati, il 47% degli ara + porta anche leu +, e il 2% dei trasduttanti ara + porta anche thr +. Quando i trasduttanti leu + sono selezionati, il 50% porta anche ara +, ma nessuno porta anche thr +. Qual è l ordine dei tre geni? R. L ordine è leu ara thr (ara è più vicino a leu che a thr). I geni leu e thr non erano cotrasdotti ma ara e thr erano cotrasdotti a bassa frequenza, perciò essi devono essere più vicini tra loro di leu e thr. 2. Descrivi come effettueresti uno screening per cellule Arg - derivate da una coltura selvatica di E. coli. R. Per aumentare la frequenza di mutazione, prima esponi una coltura selvatica ad un mutageno. Quindi piastra le cellule mutagenizzate su terreno minimo contenente arginina. Dopo che le colonie sono cresciute, fai una replica della piastra su terreno minimo privo di arginina. Nota la posizione delle cellule che crescono sul primo set di piastre, ma non sul secondo. Quelli sono i mutanti Arg Attraverso l uso di differenti ceppi Hfr (H, 1, 2, e 3), che hanno il fattore F inserito nel cromosoma in punti diversi e in differenti direzioni, gli esperimenti di coniugazione interrotta possono fornire l ordine dei geni nel genoma di E.coli. L ordine lineare di trasferimento dei marcatori è mostrato sotto per quattro ceppi Hfr. Usando questi dati, costruisci una mappa fisica del cromosoma di E. coli. HfrH thi gly his gal pur lac Hfr1 pro lac pur gal his gly Hfr2 lac pur gal his gly thi Hfr3 gal his gly thi thr pro R. Il cromosoma di E. coli è circolare, e l ordine dei marcatori è: thi gly his gal pur lac pro thr. 4. In un incrocio Hfr X F, azi r entra come primo marcatore, ma l ordine degli altri marcatori è sconosciuto. Se Hfr è selvatico e F è auxotrofico per ogni marcatore nell esperimento, qual è l ordine dei marcatori in un incrocio dove sono selezionati i ricombinanti azi r se il 61% sono lac +, il 27% sono gal +, l 89% sono ton r, e l 1% sono trp +? R. L ordine dei marcatori usati in questo esperimento è: azi r, ton r, lac +, gal +, trp Viene effettuato un incrocio tra un ceppo Hfr che è met + arg + gly + e un ceppo F - che è met - arg - gly -. Esperimenti di coniugazione interrotta mostrano che gly + entra nel ricevente per ultimo, così i ricombinanti gly + sono selezionati su terreno minimo integrato con metionina e arginina. Questi ricombinanti sono quindi testati per la presenza degli alleli met + e arg +. Per ogni genotipo sono trovati i seguenti numeri di colonie: gly + met + arg gly + met + arg - 11 gly + met - arg + 0 gly + met - arg 49 a. Perché la glicina (gly) era omessa dal terreno di selezione? b. Qual è l ordine dei geni? c. Quali sono le distanze di mappa in unità di ricombinazione? R. a. La glicina era omessa allo scopo di permettere la selezione dei ricombinanti gly +, perché gly è l ultimo marcatore a entrare nel ricevente in questo esperimento di mappatura. Ciò assicura che tutti

23 i loci che sono mappati nell incrocio siano già entrati in ogni ricombinante che è analizzato. b. Poiché sappiamo che gly entra nella cellula come ultimo marcatore, ci sono solo due possibili ordini da considerare: arg-met-gly e met-arg-gly. Poiché il ricombinante gly + met - arg + non compariva in questo esperimento, possiamo concludere che esso richiedeva un evento di crossover quadruplo, indicando che l ordine dei geni deve essere arg-met-gly. c. Per determinare la distanza di mappa tra due geni, conta il numero di crossover che avvengono tra loro. Gli eventi di ricombinazione tra arg e met risulteranno in un fenotipo Gly + Met + Arg - (ricorda, tutte le cellule erano prima selezionate come ricombinanti gly + ). Quindi, la distanza tra arg e met è 11/480 = 2,3 unità di mappa. Allo stesso modo, la distanza di mappa tra met e gly è 49/480 = 10,2 unità di mappa. 6. Un fago trasducente generalizzato è usato per trasdurre un ceppo ricevente di E. coli a - b - c - d - e - con un donatore a + b + c + d + e +. La coltura ricevente è piastrata su vari terreni indicati nella seconda colonna della tabella, con il risultato mostrato nella terza colonna. (Nota che a - indica una richiesta di A come nutriente, ecc.) Esperimento Composti aggiunti al Presenza (+) o Numero terreno minimo assenza (-) di colonie 1 CDE - 2 BDE + 3 BCE - 4 BCD - 5 ADE - 6 ACE + 7 ACD + 8 ABE - 9 ABD - 10 ABC - a. Per quale fenotipo si sta selezionando in ogni esperimento sopra? b. Quale dei marcatori sopra può essere cotrasdotto? c. Che cosa puoi concludere circa l associazione e l ordine dei cinque geni? R. a. L esperimento1 sta selezionando per i ricombinanti a + b +, il 2 per a + c +, il 3 per a + d +, quindi a + e +, b + c +, b + d +,b + e +, c + d +, c + e +, e d + e + nell esperimento 10. b. I marcatori che possono essere cotrasdotti sono a e c, b e d, e b ed e. c. b, d, ed e sono relativamente vicini l uno all altro, con b nel centro. a e c sono vicini l uno all altro, ma lontani da b, d, ed e.

24 CAPITOLO Uno scienziato studia l incrocio tra cellule di lievito delle colonie grande e cellule di lievito delle colonie petite; dopo la sporulazione, quali tipi di colonie di lievito deriveranno dalle spore prodotte, e in che proporzione? R. 4 grande: 0 petite. 2. Perché un ricercatore potrebbe attaccare un gene codificante una proteina fluorescente verde ad una sequenza di DNA prima di trasformare l mtdna di una cellula? R. Per confermare che la trasformazione sia avvenuta con successo, rilevando fluorescenza nel bersaglio. 3. Gemelli identici derivano da un singolo zigote. Un gemello ha i sintomi della MERFF ma l altro gemello non manifesta disturbi. Spiega come ciò possa avvenire. R. Distribuzione asimmetrica dei mitocondri durante la divisione cellulare iniziale e lo sviluppo. 4. Madre 1 e madre 2 mostrano entrambe un ipotetico fenotipo mitocondriale e nessuno dei due padri è affetto. Entrambe le famiglie hanno quattro figli. I figli della famiglia 1 sono tutti affetti ma solo metà dei figli della famiglia 2 mostra il fenotipo. Interpreta questo risultato rispetto al genotipo delle madri 1 e 2. R. La madre 1 è omoplasmica e la madre 2 è eteroplasmica per l ipotetico fenotipo. 5. Nella biologia evolutiva sono utilizzati calcoli statistici e teorie relative alla velocità di mutazione. Esistono due ipotesi riguardo all evoluzione dell uomo. Una, chiamata teoria della sostituzione, ipotizza che gli uomini siano vissuti contemporaneamente ad altre specie di ominidi e, semplicemente, le abbiano sostituite per esistere oggi. La seconda ipotesi è che l uomo moderno sia un diretto discendente dell uomo di Neanderthal ma che, come risultato di una perdita genetica casuale o di selezione negativa, esistano tra le due specie grandi discrepanze di sequenza. Quale scoperta e quale esperimento sono necessari per verificare queste due ipotesi che si escludono mutuamente? R. La scoperta e l esame dell mtdna di un uomo di Neanderthal Nord Africano. L analisi del DNA mitocondriale dell uomo di Cro-Magnon potrebbe essere, inoltre, di sostegno per l una o l altra ipotesi.

25 CAPITOLO Per ognuno dei seguenti fenotipi indicate se la produzione di una β-galattosidasi normale è costitutiva, induttiva, o assente: (A) I + p + o + Z + Y + A +, (B) I - p + o + Z + Y + A +, (C) I + p + o c Z - Y + A +, (D) I + p + o + Z - Y + A +. R. (A) induttiva, (B) costitutiva, (C) assente, (D) assente 2. Spiegate in che modo la presenza o l assenza dell aminoacido triptofano attenua la trascrizione dei geni dell operone del trp. R. Il trp conduce ad attenuazione dell espressione genica attraverso una prematura terminazione della trascrizione. Ci sono circa 140 basi a monte del primo gene del trp, questa regione di DNA che precede il gene è chiamata sequenza leader. C è un breve registro di lettura aperto nella sequenza leader che contiene 14 codoni, due dei quali codificano per il trp. Quando il triptofano è presente, il ribosoma supera velocemente i codoni del trp e procede verso i codoni finali della sequenza leader, questo comporta la formazione di una struttura a forcina che coinvolge le regioni 3 e 4, causando la terminazione della trascrizione e quindi l attenuazione dell espressione dei geni trp. In assenza di triptofano, il ribosoma si ferma nei pressi dei due codoni del trp nell RNA leader, si forma la struttura a forcina nella ragione 2 e 3 mentre la formazione della forcina nella regione 3-4 è inibita e la trascrizione procede attraverso al sequenza leader fino ai geni strutturali. 3. Quale fenotipo dovrebbe derivare da una mutazione nel gene della proteina CRP e perché? R. Una mutazione nella proteina CRP comporterebbe un fenotipo inducibile a basso livello, dovuto al fatto che il complesso CRP-cAMP non agirebbe più come regolatore positivo che favorisce la polimerasi nell inizio della trascrizione. 4. Più di 20 diverse proteine che legano il DNA nei batteri soni simili al repressore LacI, generati dalla famiglia dei repressori LacI. Perché non tutte legano e reprimono l operatore lac? R. Ogni repressore LacI riconosce differenti sequenze di DNA dell operatore, per questo ogni repressore agisce solo su un gene specifico. 5. Quale fu il vantaggio per Jacob e Monod nella selezione di E. coli attraverso l uso di lattosio che portò alla scoperta del concetto di operone nella regolazione genica? R. Il vantaggio nell uso del lattosio in E.coli risiede nella possibilità di far crescere in coltura un gran numero di cellule batteriche e isolare facilmente mutazioni rare.

26 CAPITOLO Descrivi due modalità di azione attraverso le quali l interferenza dell RNA può modulare l espressione genica. R. Un perfetto appaiamento ibrido tra il mirna e la sequenza dell mrna bersaglio, si risolve nella mancanza di taglio da parte del RISC. I successivi tentativi dei ribosomi di tradurre l mrna legato al RISC sono bloccati dal complesso RISC e la traduzione è impedita. 2. Descrivi il processo di interferenza dell RNA, iniziando dalla produzione di mirna durante la formazione di complessi mirisc. R. I trascritti primari mirna sono trascritti da introni, o da quadri di lettura aperti privi di ORF, dall RNA polimerasi II. La loro espressione è governata da enhancer cis-agenti ed è tessuto specifica. Il lungo trascritto primario di ribonucleotidi (pri-mirna) riceve un cappuccio GTP al 5 e una coda poli-a al 3. Il trascritto si dispone in strutture ad ansa a forcina che guidano l attivazione di Drosha. Drosha è una RNAse che taglia la struttura ad ansa a forcina alla sua base. Il pre-mirna processato è esportato dal nucleo al citoplasma, dove è ulteriormente processato da un altra RNAsi chiamata Dicer, che taglia l ansa e digerisce ribonuceotidi da entrambe le estremità per produrre un RNA duplex di basi. Il duplex mirna/mirna * risultante è caricato sul RISC, che degrada il filamento senso del mirna*. Il risultante complesso mirisc è ora un agente attivo dell interferenza dell RNA. 3. Stai studiando un gene di topo specifico di una regione del cervello. Hai clonato e sequenziato il gene ma desidereresti identificare le sequenze di DNA che dirigono la specificità della regione. Descrivi una tecnica sperimentale ti permetterebbe di prendere ciò in esame. R. Potresti clonare la regione a monte, il 5 UTR, gli introni e il 3 UTR, individualmente, in costrutti reporter, e creare dei topi trangenici. Il segmento di DNA responsabile per la regolazione dell espressione della regione permetterebbe la trascrizione del gene reporter nella regione del cervello di interesse, mentre la altre sequenze di DNA non la consentirebbero. 4. Descrivi i risultati che ti aspetteresti da un analisi Northern e Western se un ipotetico gene fosse up-regolato a livello trascrizionale in risposta alla presenza di zinco. Come differirebbero i tuoi risultati se lo zinco agisse per ridurre il turn-over proteico? R. In presenza di zinco, l analisi Northern mostrerebbe più mrna (una banda più scura) per il gene rispetto ai controlli senza zinco. L analisi Western rivelerebbe inoltre più proteina in presenza di zinco, se non avvenissero altre variazioni di regolazione. Nell ultimo caso, in cui lo zinco era ritenuto responsabile del turnover proteico, non ci dovrebbe essere differenza nell intensità delle bande tra campione di controllo e trattato con lo zinco sul Northern blot, ma un incremento di proteina rilevata sul Western blot. 5. Hai clonato e sequenziato un nuovo gene di topo e desidereresti sapere se la struttura della cromatina può effettuare la sua trascrizione. Tratti con DNasi e quindi fai un analisi Southern. Nella razza di topo con un ipotetico fenotipo A, rilevi il tuo gene, ma esso non è presente nei campioni trattati con DNasi dalla razza di topo con fenotipo B. Quale sospetti sia la causa? R. La rivelazione del tuo gene su un Southern blot indica che il DNA genomico per il tuo gene era protetto dai nucleosomi dalla digestione della DNasi, e quindi dovrebbe essere inattivo. Al contrario, quando un gene non è rivelato sull analisi Southern a seguito della digestione con DNasi, il gene non è protetto dalla struttura cromatinica e quindi dovrebbe essere attivo in vivo. 6. Il Gene A ha imprinting materno mentre il Gene B ha imprinting paterno. Una Mamma con Geni A e B imprinted e un Papà con un Gene A imprinted hanno una figlia e un figlio. I figli sposano poi

27 individui non imprinted per ambedue i geni. Qual è lo stato di imprinting della figlia e del figlio, rispettivamente? Se ogni matrimonio si risolve nella nascita di una figlia e di un figlio, quale ti aspetti sia lo stato di imprinting del gene A e B per i nipoti? R. La Mamma ha Geni A e B imprinted, ma trasmette solo un Gene A imprinted (a tutti i suoi figli). Il Papà ha un Gene A imprinted, ma, poiché questo è un gene a imprinting materno, non trasmette nessun imprinting ai suoi figli. Quindi, tutti e quattro i figli ereditano un Gene A imprinted e un Gene B non imprinted. I figli della figlia saranno i soli nipoti con imprinting e, conseguentemente, solo sul Gene A. I figli del figlio non sono imprinted per il Gene A o B.

28 CAPITOLO Che cosa si intende per fattore di crescita? R. I fattori di crescita sono molecole che influenzano la proliferazione cellulare. Generalmente i fattori di crescita stimolano la proliferazione associandosi con recettori proteici sulle cellule. 2. Che cosa si intende per glioblastoma multiforme? R. Il glioblastoma è la forma più maligna di tumore al cervello, deriva da mutazioni multiple in geni che regolano la proliferazione delle cellule gliali. 3. Un paziente presenta tumori in vari organi. Avete genotipizzato diversi geni, spesso collegati all insorgenza del cancro, scoprendo che le cellule derivanti da questi diversi tumori presentano lo stesso genotipo per tutti i geni testati. Come interpretereste questi dati? R. I risultati ottenuti suggeriscono che le cellule sono clonali derivanti cioè da una singola cellula. Le cellule tumori presenti nei diversi organi sono geneticamente identici per i geni testati. 4. Vorreste determinare quali geni sono espressi in modo aberrante in certi tipi di cancro. Come misurereste una possibile differenza di trascrizione a livello genomico tra cellule cancerose e cellule normali? R. Una possibile differenza di trascrizione può essere misurata isolando cellule tumorali e normali per un analisi con microarray usando chip contenenti l intero genoma umano. Differenze di espressione sono identificabili attraverso la fluorescenza rossa e verde indicando maggiore o minore espressione nelle cellule tumorali comparate con le normali cellule di controllo. 5. Avete identificato una mutazione nel Gene X che compare insieme a mutazioni in altri tre geni causando un incremento di probabilità per certi tipi di cancro. Sviluppate un saggio per testare i pazienti per il polimorfismo del Gene X. R. E necessario avere informazioni sulla sequenza per determinare differenze nei siti di restrizione tra l allele wt e mutante. Usando un enzima che taglia l uno ma non l altro potete effettuare un analisi Southern su ciascun DNA digerito e verificare la presenza di una o due bande. Oppure potete disegnare dei primers per PCR e rilevare direttamente le bande su un gel elettroforetico. 6. Usando il lievito, desiderate testare l ipotesi che le due nuove mutazioni temperatura-sensibile che avete isolato sono coinvolte in fasi diverse del ciclo cellulare. Indicate un protocollo sperimentale necessario per fare questo. R. Un possibile metodo potrebbe essere quello di testate sia il mutante singolo per l arresto del ciclo cellulare sia il doppio mutante ( esperimento di epistasi) contenente ambedue le mutazioni. Il fenotipo del doppio mutante sarà uguale ad uno dei due mutanti singoli. Questo rappresenterà il gene coinvolto per primo nelle due fasi del ciclo cellulare.