Metabolismo del DNA. Replicazione del DNA
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- Jacopo Lupo
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1 Metabolismo del DNA Replicazione del DNA
2 Replicazione del DNA Le polimerasi non sono capaci di svolgere il duplex di DNA per separare i due filamenti, ognuno dei quali deve servire da stampo Il DNA e un elica con filamenti antiparalleli, i filamenti hanno polarita opposta Tutte le polimerasi polimerizzano in direzione 5 -> 3 Tutte le polimerasi non possono iniziare le catene, ma allungare degli inneschi di RNA o DNA
3 La sintesi di DNA e preceduta dalla sintesi di un piccolo RNA innesco
4 REQUISITI PER LA REPLICAZIONE DEL DNA Stampo fornisce le informazioni sulla sequenza Iniziatore fornisce un estremità 3 -OH a cui aggiungere il nuovo nucleotide Precursori 5 -dntp Mg++ Enzimi ATP DNA polimerasi, elicasi, nucleasi, ligasi, topoisomerasi Proteine non enzimatiche es. pinze scorrevoli, proteine leganti il filamento singolo
5 MECCANISMO D AZIONE DELLA DNA POLIMERASI Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.
6 MECCANISMO D AZIONE DELLA DNA POLIMERASI Allungamento della catena di DNA Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.
7 Processivita della DNA Polimerasi N. di nucleotidi polimerizzati sequenzialmente (fino a , PolIII). La prima fase di legame al DNA è lenta (1 sec), quelle successiva molto veloci. La processività è dovuta alla capacità di rimanere legata al templato. È aumentata dalla interazione con la sliding clamp. Controlla frameshifts e replication slippage
8 FEDELTÀ DI REPLICAZIONE: La discriminazione tra nucleotidi corretti e sbagliati avviene in base a: -legami idrogeno che determinano un corretto appaiamento -geometria delle coppie di basi Le coppie standard hanno una geometria simile che si adatta al sito catalitico della polimerasi Le coppie sbagliate hanno una geometria che le esclude dal sito attivo Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.
9 FEDELTÀ DI REPLICAZIONE: ATTIVITÀ 3 5 ESONUCLEASICA CORREZIONE DEGLI ERRORI IN FASE DI REPLICAZIONE Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 5 ed.
10 IL processo di replicazione e molto accurato Fedeltà: 1 errore ogni nucleotidi durante la replicazione Correzione delle bozze: 1 errore ogni nucleotidi. Riparazione post-replicativa: 1 errore ogni nucleotidi.
11 LE ATTIVITA DELLE DNA POLIMERASI Attivita di polimerasi, che catalizza l allungamento della catena nucleotidica in direzione 5 3 Attivita di esonucleasi 3 5, che rimuove le basi non appaiate correttamente (correzione di bozze) Attivita di esonucleasi 5 3, che rimuove gli inneschi di RNA durante la sintesi del filamento ritardato, oppure un segmento di DNA durante i processi di riparazione.
12 Nucleases hydrolyze phosphodiester bonds Exonucleases cleave at terminal nucleotides. 5 3 Endonucleases cleave internally and can cut on either side of a phosphate leaving 5 phosphate or 3 phosphate ends depending on the particular endonuclease. e.g., restriction endonucleases e.g., proofreading exonucleases 3 5
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14 DNA POLIMERASI III SUBUNITA β PINZA Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed. STRUTTURA - 2 nuclei : attività polimerasica,attività 3 5 esonucleasica - : (dimero) pinza si lega al primer e al DNA stampo, fa da morsa legandosi al nucleo scorrendo lungo il filamento incrementando la processività della polimerasi -caricatore della pinza utilizza ATP
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16 FASI DELLA REPLICAZIONE DEL DNA inizio allungamento termine
17 LA REPLICAZIONE E BIDIREZIONALE Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.
18 ORIGINE DI REPLICAZIONE IN E.COLI: oric sito unico di inizio 13bp = sequenze per il disavvolgimento del DNA DUE 9 pb Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed
19 INIZIO DELLA REPLICAZIONE A LIVELLO DELLA oric DnaA DnaB elicasi DnaC Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 5ed.
20 COMPLESSO DI PREINIZIO Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed
21 Fase di inizio L inizio e la fase critica per la regolazione della replicazione. La regolazione avviene una sola volta per ciclo cellulare. L idrolisi dell ATP da parte della proteina DnaA conduce al dissolvimento del complesso di inizio: DnaA-ATP (attiva),dnaa-adp (inattiva) Metilazione del DNA (GATC) e nuovo ciclo di replicazione.
22 LE CATENE DI DNA A LIVELLO DELLA FORCELLA DI REPLICAZIONE
23 Each replication fork has a leading and a lagging strand leading strand (synthesized continuously) replication fork replication fork lagging strand (synthesized discontinuously) The leading and lagging strand arrows show the direction of DNA chain elongation in a 5 to 3 direction The small DNA pieces on the lagging strand are called Okazaki fragments ( bases in length)
24 LE DUE NUOVE CATENE NON SONO SINTETIZZATE ALLO STESSO MODO Berg et al., BIOCHIMICA 6/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2007
25 SINTESI DEI FRAMMENTI DI OKAZAKI primosoma= DnaB elicasi+primasi Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.
26 COORDINAMENTO DELLA SINTESI DELLA CATENA VELOCE E DELLA CATENA LENTA Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed
27 SINTESI DELLA CATENA VELOCE E DELLA CATENA LENTA Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.
28 IL CARICATORE DELLA PINZA DELLA DNA POLIMERASI Nella conformazione ATP- legato il caricatore interagisce con la pinza e la mantiene aperta L idrolisi dell ATP determina il distacco del caricatore e chiusura della pinza attorno al DNA Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger. 6 ed. Zanichelli
29 ATTIVITA 5 3 esonucleasica DELLA DNA POLIMERASI I traslocazione della interruzione Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.
30 Tappe finale nella sintesi della catena lenta DNA Ligasi
31 DNA LIGASI (1) Enzima + ATP Enzima-AMP + PPi Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.
32 DNA LIGASI (2) Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed. 2) Enzima-AMP + 5 P-DNA Enzima + 5 ADP-DNA 3) 5 ADP-DNA + 3 OH-DNA DNA-P-DNA +AMP
33 La DNA topoisomerasi impedisce l aggrovigliamento durante la replicazione Elicasi e topoisomerasi cambiano la conformazione del DNA per facilitare l attività della DNA polimerasi
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35 TERMINAZIONE DELLA REPLICAZIONE IN E.COLI Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.
36 REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI Nell uomo la velocità di polimerizzazione è circa 50 nt/sec Le origini di replicazione sono attivata a gruppi di 20-80, unità di replicazione Le unità sono attivate a tempi diversi Le origini sono a distanza di 30, ,000 nt Si formano bolle di replicazione Meccanismi capaci di assicurare che ciascuna sequenza venga replicata una sola volta
37 Replicazione del DNA : PROCARIOTI- EUCARIOTI DIMENSIONI DEL GENOMA
38 IL Replicatore Il replicatore ha due siti: - legame alla proteina/e iniziatrice - Zona ricca di AT che si apre facilmente
39 REPLICAZIONE DNA EUCARIOTI FORMAZIONE DEL COMPLESSO PRE- REPLICATIVO (PRE-RC) Associazione del complesso di riconoscimento del replicatore/origine (ORC, analogo alla DnA) Reclutamento di altre proteine Reclutamento dell elicasi (complesso Mcm2-7).
40 Cellule Eucariotiche PROPERTIES OF DNA POLYMERASES DNA polymerases of humans a g d e Location nucl nucl mit nucl nucl Replication yes no yes yes yes Repair no yes no yes yes 3 Functions 5 to 3 polymerase yes yes yes yes yes 3 to 5 exonuclease no no yes yes yes 5 to 3 exonuclease 1 no no no no no Primase yes no no no no Associates with PCNA 2 no no no yes yes Processivity low high Strand synthesis lagging both both both 1 activity present in associated proteins 2 Proliferating Cell Nuclear Antigen sliding clamp 3 involved in transcription-linked DNA repair
41 SOSTITUZIONE DELLA DNA POLIMERASI DURANTE LA REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI La Pol α inizia la replicazione, dopo aver sintetizzato bp viene sostituita dalla Pol δ o ε, che hanno maggiore processività. Queste sono specializzate per il filamento leading e lagging
42 REPLICAZIONE DEL DNA NEGLI EUCARIOTI
43 Inibizione replicazione- farmaci chemioterapia Poiché le cellule tumorali si replicano a velocità maggiore delle cellule sane, gran parte della chemioterapia tende ad avere come bersaglio la replicazione del DNA. Le cellule in corso di divisione sono quindi piu sensibili a questi farmaci rispetto alle cellule quiescenti. Oltre alle cellule tumorali, che sono il bersaglio della chemioterapia, nell organismo esistono anche cellule normali che si replicano rapidamente, ad es. nel tratto intestinale, midollo osseo e follicoli piliferi. La sensibilità delle cellule normali spiega molti degli effetti collaterali che limitano la chemioterapia.
44 Inibizione replicazione- farmaci chemioterapia Inibizione della sintesi dei desossiribonucleotidi Ribonucleotidi Desossiribonucleotidi Enzima ribonucleotide reduttasi Idrossiurea= antimetabolita, inibisce la ribonucleotide reduttasi Impiegata nel trattamento del melanoma e della leucemia mieloide cronica
45 Inibizione replicazione- farmaci INIBIZIONE DELLA DNA POLIMERASI DNA POLIMERASI DI VIRUS BERSAGLI DI FARMACI ANTIVIRALI Esempio: Aciclovir inibitore dell Herpes simplex
46 Aciclovir Meccanismo d azione ATTIVAZIONE DEI NUCLEOSIDI ACICLICI TIMIDINA CHINASI VIRALE CHINASI CELLULARE CHINASI CELLULARE
47 MECCANISMO D AZIONE DELL ACICLOVIR MECCANISMO D AZIONE DEI NUCLEOSIDI ACICLICI Esempio ACICLOVIR
48 Inibizione replicazione- farmaci Le topoisomerasi sono il bersaglio molecolare nel trattamento di malattie Agenti antimicrobici Agenti antitumorali Girasi (topoisomerasi II, batterica) Novobiocina: blocca il legame dell ATP alla girasi Acido nalidixico e ciprofloxacina: interferiscono con la rottura e ricongiungimento delle catene. Impiego: infezioni urinarie ed altre (antrace) Inibitori della topoisomerasi I e II umane Agenti antitumorali
49 TELOMERI I telomeri sono delle strutture formate da DNA e proteine presenti alle estremità dei cromosomi lineari. Le sequenze telomeriche sono costituite da migliaia di ripetizioni in tandem della sequenza TTAGGG
50 CROMOSOMI UMANI LINEARI Sono caratterizzati da un filamento 3 protrudente che si ripiega all indietro ed invade la regione a doppia elica dei telomeri formando quello che viene chiamato T-loop.
51 La stabilità del T-LOOP è determinata Dalla LUNGHEZZA DELLE SEQUENZE TELOMERICHE Dalle PROTEINE TELOMERICHE (T-loop) protegge le estremita cromosomiche da nucleasi.
52 CROMOSOMI UMANI LINEARI: ad ogni replicazione sequenze all estremita vengono perdute
53 Telomerasi Le telomerasi sono delle ribonucleoproteine
54 TELOMERASI
55 CROMOSOMI UMANI LINEARI Sono caratterizzati da un filamento 3 protrudente che si ripiega all indietro ed invade la regione a doppia elica dei telomeri formando quello che viene chiamato T-loop.
56 Cellule germinali Cellule embrionali Linfociti Cellule staminali NELL UOMO LA TELOMERASI E ATTIVA La maggior parte delle cellule somatiche differenziate non esprime attività telomerasica e vanno incontro a senescenza duplicativa che è associata con una diminuzione della lunghezza dei telomeri. La mancata espressione della telomerasi limita quindi il numero di volte che queste cellule possano dividersi, prima che la perdita dei telomeri attivi l apoptosi, cioe la morte cellulare programmata
57 Telomeri ed invecchiamento Esistono diversi tessuti in cui la senescenza delle cellule che si replicano ha un ruolo chiave nelle malattie correlate all'età, tra cui: -i fibroblasti del derma nell'invecchiamento della pelle (diminuzione della capacità di cicatrizzazione e predisposizione a ulcere); -le cellule endoteliali nell'invecchiamento vascolare (malattie cardiovascolari); -le cellule epiteliali pigmentate della retina (degenerazione maculare correlata all'età); -gli osteoblasti nell'osso (osteoporosi); -i linfociti nel sangue periferico (predisposizione alle infezioni). Individui affetti da invecchiamento precoce (progeria) presentano telomeri corti
58 Telomerasi e cancro Le cellule tumorali presentano livelli elevati di attività telomerasica, crescono in modo incontrollato e diventano immortali.
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