LA FISSAZIONE E LA PROCESSAZIONE DEI CAMPIONI ISTOLOGICI CON SOSTANZE A BASE ALCOLICA: POSSIBILI VANTAGGI E PROSPETTIVE FUTURE.

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1 LA FISSAZIONE E LA PROCESSAZIONE DEI CAMPIONI ISTOLOGICI CON SOSTANZE A BASE ALCOLICA: POSSIBILI VANTAGGI E PROSPETTIVE FUTURE. Dott.ssa Marchi Barbara Biologa sanitaria

2 COMBINAZIONE TRA LA BIOLOGIA MOLECOLARE E L ANATOMIA PATOLOGICA Diagnostica Target therapy Studi retrospettivi Bio-banche di tessuto

3 FORMALINA al 10% = 4% di formaldeide in soluzione acquosa PONTI METILENICI FISSAZIONE ADDITIVA Lisina (Lys, k)

4 FORMALDEIDE - Smascheramento antigenico - Falsi negativi e falsi positivi in immunoistochimica Smascheramento troppo aggressivo. Smascheramento poco efficace. Emoto et al., 2005 Presenza di gruppi aldeidici liberi.

5 INTERAZIONI CON GLI ACIDI NUCLEICI (Metz et al., 2004)

6 FORMALDEIDE Falsi negativi e falsi positivi in immunoistochimica Parziale degradazione del DNA Introduzione di mutazioni artificiali durante l amplificazione del DNA Modesta degradazione dell RNA e difficoltà di estrazione Cancerogeno (IARC, 2004)

7 FISSATIVO A BASE ALCOLICA Etanolo o metanolo al 72% Usato in giusta concentrazione e con PEG opportuni reagenti additivi può essere impiegato come fissativo Polialcoli Buona conservazione di acidi nucleici Non cancerogeno Fissativo coagulante ma non additivo

8 FORMALINA..INOLTRE BASE ALCOLICA FISSAZIONE Lo xilene è un altro reagente altamente PROCESSAZIONE tossico e soprattutto neurotossico e sospetto cancerogeno. Metodo Sperimentazione Sostituti dello xilene tradizionalepoco tossici possono esserescala impiegatietanolo nelle>90% fasi di Disidratazione disidratazione crescente e chiarificazione dei (Ottix Shaper) degli alcoli campioni istologici con buoni risultati? Chiarificazionel usoxilene Alchile C5-C 12 È possibile combinato con fissativi (>40%), etanolo a base alcolica? (<25%) ed alcoli alifatici (Ottix Plus)

9 SPERIMENTAZIONE Carcinoma alla mammella Fondamentale lo screening dei pazienti che iperesprimono HER2 per il trattamento con il farmaco antitumorale Herceptin. Allo stato attuale ci sono numerose problematiche che interessano l immunoistochimica

10 FASI DELLA PREPARAZIONE Prelievo Fissazione Disidratazione Inclusione Taglio Colorazione Formalina Fissativo a base alcolica Alcoli crescenti e xilene Sostituti a base alcolica dello xilene

11 Preparato fissato in Preparato fissato e formalina con alcoli e xilene processato con reagenti a base alcolica Mammella

12 RECETTORI HER HER2 (c-erb) HER1 (EGFR) Herceptin HER3 HER4 Membrana cellulare Cascata Di Segnali Iper-espresso nel % tumori alla mammella FATTORE PROGNOSTICO E PREDITTIVO Nel 98% dei casi l i per-espressione è associata all amplificazione genica

13 COLORAZIONE IMMUNOISTOCHIMICA DI HER-2 70% 60% 50% Soluzioni a base alcolica Formalina 40% Casi 30% 20% 10% 0% Iper-espressione

14 3+ Preparato fissato in formalina e processato con alcoli e xilene 3+ Preparato fissato e processato con reagenti a base alcolica Diapositiva 32

15 2+ Preparato fissato in formalina e processato con alcoli e xilene 1+ Preparato fissato e processato con reagenti a base alcolica

16 COLORAZIONE IMMUNOISTOCHIMICA DI HER-2 20% 18% 16% 14% 12% overespressione della preoteina Amplificazione genica Casi 10% 8% 6% 4% 2% 0% fissazione a base alcolica fissazione con formalina Dati

17 0 / 1+ Preparato fissato in formalina e processato con alcoli e xilene 2+ Preparato fissato e processato con reagenti a base alcolica

18 COLON Sperimentazione di tali reagenti nel tessuto del colon-retto Si sono ottenuti buoni risultati L immunoistochimica sull EGFR è risultata maggiormente sensibile e specifica

19 Preparato fissato in formalina con alcoli e xilene Preparato fissato e processato con reagenti a base alcolica

20 RECETTORI HER HER2 (c-erb) HER1 (EGFR) HER3 Membrana cellulare Iper-espresso nel 80% dei tumori al colon FATTORI PROGNOSTICI E PREDITTIVI HER4

21 Preparato fissato in formalina e processato con alcoli e xilene Preparato fissato e processato con reagenti a base alcolica

22 Riassumendo.. Fissazione a base alcolica Coartazione dei tessuti ed artefatti nella colorazione e-e. Smascheramento antigenico blando e non indispensabile. Riduzione di falsi positivi e negativi in immunoistochimica. Fissazione con formalina Buona qualità dei preparati istologici. Smascheramento antigenico indispensabile. Falsi positivi e negativi confermati da analisi biomolecolari. Qualità di RNA e DNA estratto da preparati istologici diversamente fissati e processati?

23 ESTRAZIONE DEL DNA DNA ESTRATTO DA CAMPIONI FISSATI CON FISSATIVO A BASE ALCOLICA DNA ESTRATTO DA CAMPIONI FISSATI CON FORMALINA

24 AMPLIFICAZIONE DEL DNA FORMALINA FISSATIVO A BASE ALCOLICA bp 308bp 501/ / bp 308bp

25 ESTRAZIONE DELL RNA Fissativo a base Formalina alcolica Congelato in azoto liquido 28s 18s

26 AMPLIFICAZIONE DEL cdna A1 800/ B1 A2 B2 A3 C+ Time CReal B3 Campioni istologici per l estrazione dell RNA (sucessivamente retrotrascritto 615bpa cdna) Ct SNRPD3 Ct VEGFa Fissazione e processazione 1118 in sperimentazione 39,1 37, Congelati in azoto liquido e 501 conservati a C A1 0,5 B1 log A2 B2 38,5 A34 B3 log C+ C- 33, bp Amplificati di circa 150 bp Amplificati di circa 230 bp

27 VANTAGGI Riduzione dei tempi di indagine immunofenotipica e genotipica. Aumento di sensibilità e specificità nell analisi immunoistochimica. Riduzione dei costi di smaltimento e i relativi rischi di tossicità e cancerogenicità per gli addetti alle analisi. Analisi molecolari quantitativamente e qualitativamente migliori. POSSIBILI SVANTAGGI Work in progress Mantenimento dell antigenicità per tempi lunghi. Mantenimento della qualità dei preparati istologici. Possibili contaminazioni batteriche e virali. Inferiore del preparato istologico.

28 Fine

29 Grazie a tutti per l attenzione e la partecipazione.

30 Sonda locus specifica Gene: Her-2 17q11.2-q12 Lunghezza: 190 kb Fluorocromo: SpectrumOrange Cromosoma 17

31 Sonda centromerica CEP 17 Alfa-satellite 17p11.1-q11.1 Lunghezza: 5,4 kb Fluorocromo: SpectrumGreen Cromosoma 17

32 Her-2 NON AMPLIFICATO CEP17 LSI Her-2 2 segnali Her-2 = 1 2 segnali CEP17 Cromosoma 17

33 Her-2 AMPLIFICATO segnali Her-2 => 2 segnali CEP17 conteggio su almeno 60 nuclei neoplastici Diapositiva 14 Cromosoma 17

34 herceptin

35 Herceptin

36 Mammella Diapositiva 11

37

38 Arginina (Arg, R) Lisina (Lys, k) FORMALINA al 10% = 4% di formaldeide in soluzione acquosa

39

40

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43

44 Iper-espressione RECETTORI HER Diapositiva 16

45 CASCATA DI SEGNALI PI3K P P Shc Grb 2 Sos Raf P AKT P Ras MAPKK GSK-3 MAPK RECETTORI HER TRASCRIZIONE GENICA 45

46 RECETTORI HER

47 Basi azotate

48 COLORAZIONE IMMUNOISTOCHIMICA DI HER-2 100% 80% Casi 60% Soluzioni a base alcolica Formalina 40% 20% 0% negativi 0 e 1+ iper-espressione di Her2 2+ e 3+ Diapositiva 13

49 DATI Fissazione in Formalina Amplificato Non amplificato Iperespresso Non iper-espresso Sensibilità= VP/ VP+FN= 0,82 Specificità= VN/VN+FP= 0,86 Fissazione a base alcolica Amplificato Iperespresso Non iper-espresso 5 0 Sensibilità= VP/ VP+FN= 1 Specificità= VN/VN+FP= 1 Non amplificato 0 45 Diapositiva 16

50 IHC/FISH concordance FISH FISH % 24% 89.3% 3% Overall concordance: 82% Mass R et al.: Proc ASCO 2000

51 FISSAZIONE CON FORMALDEIDE ORE PROCESSAZIONE CLASSICA FISSAZIONE ALCOLICA ORE E PROCESSAZIONE CON SOSTITUTI DEGLI ALCOLI CRESCENTI E XILENE

52 FISSAZIONE ALCOLICA ORE E PROCESSAZIONE per 6 ore CON SOSTITUTI DELLO XILENE FISSAZIONE ALCOLICA 24 ORE E PROCESSAZIONE per 6 ore CON SOSTITUTI DELLO XILENE FISSAZIONE ALCOLICA 24 ORE E PROCESSAZIONE per 3 ore CON SOSTITUTI DELLO XILENE

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