Immunologia e Immunologia Diagnostica ANTICORPI: STRUTTURA E FUNZIONE

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1 Immunologia e Immunologia Diagnostica ANTICORPI: STRUTTURA E FUNZIONE

2 Le due vie dell immunità adattativa Microbi extracellulari: immunità umorale! Anticorpi Microbi fagocitati e intracellulari: immunità cellulare

3 Caratteristiche dell immunità adattativa

4 Anticorpi: Specificità, Diversità, Espansione Specificità: 1 linfocita B (clone) 1 recettore 1 antigene Diversità: ogni recettore è diverso dagli altri (>109) Espansione clonale: ogni antigene seleziona un clone e lo moltiplica

5 Anticorpi: proprietà generali Proteine plasmatiche della frazione gammaglobuline. Anticorpi = Immunoglobuline (Ig) Molecole specializzate per riconoscere un antigene. Uniche cellule produttrici: linfociti B. Due varianti biologiche: - Anticorpi di membrana (recettore linfociti B) - Anticorpi solubili (secrezione plasmacellule differenziate) Anticorpi solubili : plasma, secrezioni mucosali e fluidi tissutali.

6 Struttura degli Anticorpi Tutti gli anticorpi hanno la stessa struttura molecolare, ma grande variabilità nella regione che lega l antigene. Struttura simmetrica: - 2 catene polipeptidiche leggere (catene L) - 2 catene polipeptidiche pesanti (catene H)

7 Struttura degli Anticorpi Le catene H e L sono costituite da una serie di domini proteici ripetuti: il dominio immunoglobulinico (Ig), circa 110 aminoacidi. Le catene H e L sono caratterizzate da: - Regioni variabili (legame antigene) - Regioni costanti (funzioni effettrici)

8 Struttura degli Anticorpi Le catene H e L sono legate tra di loro in maniera covalente da ponti disolfuro. Anche le due catene H sono legate da ponti disolfuro: Nelle IgG si trovano vicino la regione cerniera, importante per la flessibilità dell anticorpo.

9 Il sito di legame per l antigene È formato dalla disposizione tridimensionale delle regione variabili di una catena H e di una catena L. Ogni monomero anticorpale possiede 2 siti di legame: 2 x (V H -V L )

10 Denominazione delle regioni funzionali Il trattamento degli anticorpi IgG con enzimi proteolitici genera frammenti con caratteristiche distinte, che danno il nome alle diverse regioni dell immunoglobulina. Papaina: - Frammento monovalente con il sito di legame per l antigene (Fragment antigen binding) = Fab - Frammento cristallizabile = Fc Pepsina: - Frammento bivalente con il sito di legame per l antigene = F(ab ) 2

11 Denominazione delle regioni funzionali

12 Caratteristiche delle regioni variabili La variabilità nelle sequenze aminoacidiche delle Ig si concentra nelle regioni ipervariabili e determina la specificità dei diversi anticorpi. Regioni ipervariabili ( 10 aa): - 3 segmenti della regione V H - 3 segmenti della regione V L Regioni ipervariabili = Regioni che determinano la complementarità (CDR): - CDR1, CDR2 e CDR3 (catena H) - CDR1, CDR2 e CDR3 (catena L)

13 Caratteristiche delle regioni variabili Le 6 regioni ipervariabili si associano in una struttura tridimensionale che forma il sito di legame per l Ag. L impalcatura dell Ig resta sempre la stessa. La grande diversificazione delle sequenze CDR cambia la specificità di ogni anticorpo.

14 Importanza delle regioni ipervariabili La capacità di legare l Ag dipende principalmente dalle regioni CDR. Gli aminoacidi che variano più frequentemente sono quelli che entrano in contatto con la molecola bersaglio.

15 Importanza delle regioni ipervariabili Diversità delle regioni ipervariabili = Diversità del sito di legame per l antigene = Diversità anticorpale

16 Caratteristiche delle regioni costanti Ogni molecola anticorpale contiene due tipi di regioni costanti (C): - Regioni C H catene pesanti - Regioni C L catene leggere Le regioni C H determinano: - la classe anticorpale (isotipo) - la funzione effettrice dell anticorpo - la flessibilità dell anticorpo (regione cerniera) - la forma di secrezione o di membrana

17 Forme secrete e di membrana La regione aminoacidica dell ultima regione C H determina se l anticorpo è solubile o legato alla membrana citoplasmatica. A seconda dell isotipo, le forme secrete possono essere monomeriche o formare complessi multimerici. I complessi multimerici sono legati alla catena J, una proteina che stabilizza e trasporta il complesso (epiteli).

18 Le classi anticorpali Le immunoglobuline umane sono classificate in 5 isotipi: - IgA, IgD, IgE, IgG e IgM Alcune classi sono ulteriormente suddivise in sottoclassi: - IgA IgA1 e IgA2 - IgG IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 Per ogni isotipo/sottotipo: tutte le regioni costanti delle catene H hanno la stessa sequenza aminoacidica. La sequenza aminoacidica è invece diversa nei vari isotipi/ sottotipi.

19 Immunoglobuline A (IgA) Catene pesanti α (alfa). Forme secrete: monomero, dimero, trimero. Ruolo nell immunità delle mucose: - secrete nel lume intestinale e respiratorio - neutralizzazione di microbi e tossine

20 Immunoglobuline D (IgD) Catene pesanti δ (delta). Nessuna forma secreta. Immunoglobulina di membrana dei linfociti B naïve = Recettore dei linfociti B (BCR) Ruolo nell attivazione dei linfociti B plasmacellule

21 Immunoglobuline E (IgE) Catene pesanti ε (epsilon). Forma secreta: monomero. Ruolo fisiologico: difesa contro gli elminti Ruolo immunopatologico: reazioni di ipersensibilità immediata

22 Immunoglobuline G (IgG) Catene pesanti γ (gamma). Forma secreta: monomero. Isotipo maggiormente abbondante nel siero Molteplici funzioni effettrici

23 Immunoglobuline G (IgG) Ruolo fisiologico: - Neutralizzazione microbi e tossine - Opsonizzazione antigeni - Attivazione classica del complemento - Citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC) - Immunità neonatale (via placenta) Ruolo immunopatologico: - Autoimmunità - Ipersensibilità tipo II e III

24 Immunoglobuline M (IgM) Catene pesanti µ (mu). Due forme alternative: - Ig di membrana dei linfociti B naïve (BCR). - Forma secreta: pentamero.

25 Immunoglobuline M (IgM) Ruolo fisiologico: - Attivazione dei linfociti B plasmacellule - Attivazione classica del complemento Ruolo immunopatologico: - Autoimmunità - Ipersensibilità tipo II e III

26 Sintesi ed espressione degli anticorpi L espressione dei geni per le Ig varia in dipendenza dello stadio di maturazione e attivazione dei linfociti B. 1. Linfocita pre-b: catene pesanti µ + catene leggere surrogate 2. Linfocita B immaturo: IgM complete di membrana 3. Linfocita B maturo: IgM e IgD di membrana 4. Linfocita B attivato: scambio isotipico e basso livello di secrezione 5. Plasmacellula: elevato livello di secrezione anticorpale

27 Sintesi ed espressione degli anticorpi

28 Risposta primaria e secondaria dei linfociti B La risposta primaria è la prima risposta ad un antigene, che attiva i linfociti naïve in grado di riconoscerlo. Gli incontri successivi con lo stesso antigene stimolano le risposte secondarie, mediate dall attivazione dei linfociti della memoria: - più rapide - più intense - più efficaci Ottimizzazione della risposta immunitaria: ogni incontro successivo con il patogeno genera nuove cellule memoria e attiva quelle ancora presenti.

29 Risposta primaria e secondaria dei linfociti B

30 Immunità Attiva e Passiva Esposizione ad un antigene Risposta immunitaria Immunità Attiva Trasferimento di siero (anticorpi) o di cellule (linfociti) da un individuo immune ad uno non immune Immunità Passiva

31 Immunità Attiva: Esempi Fisiologico: tutte le risposte dell immunità adattativa contro patogeni e tossine. Clinico: vaccinazioni contro le malattie infettive.

32 Immunità Passiva: Esempi Fisiologico: trasferimento degli anticorpi materni al feto (IgG via placenta) e al neonato (IgA via latte). Clinico: - Anticorpi anti-tossina (tetano, botulino, etc.) - Anticorpi anti-ofidici (veleno di serpenti) Caratteristiche del principio attivo Frammenti di immunoglobulina purificati Fab o F(ab ) 2 Preparazione plasmatica di origine equina o ovina. Rischio effetti collaterali: reazioni di ipersensibiltà, reazione anafilattica.

33 Anticorpi Monoclonali e Policlonali Ogni cellula B naïve (clone) esprime un recettore per l antigene (BCR) con specificità diversa. Ogni clone attivato differenzia in plasmacellule che secernono un immunoglobulina con la stessa specificità.

34 Anticorpi Monoclonali e Policlonali Ogni recettore/immunoglobulina riconosce un determinante antigenico diverso (epitopo) Ogni antigene possiede numerosi epitopi. 1 clone = 1 epitopo = 1 antigene 1 antigene = n epitopi = n cloni

35 Generazione di Anticorpi Monoclonali Presupposto: i mielomi sono tumori delle plasmacellule e producono anticorpi monoclonali. Conseguenza: immortalizzando i linfociti B specifici per un dato antigene, si possono generare anticorpi monoclonali specifici. Metodo: 1. Creare una fusione cellulare tra linfociti B e linee di mieloma. 2. Selezionare le cellule fuse Ibridomi. 3. Separare i singoli cloni di ibridoma. 4. Analizzare gli anticorpi prodotti da ciascun clone di ibridoma. 5. Individuare il clone/anticorpo di interesse.

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