RNA e Trascrizione. Trascrizione nei procarioti

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1 RNA e Trascrizione Trascrizione nei procarioti

2 RNA L espressione dell informazione genetica contenuta nel DNA implica sempre la formazione di RNA L RNA ha il ruolo di intermediario nel convertire in proteina funzionale l informazione genetica Oltre alla funzione informazionale l RNA può avere altre funzioni: catalitica regolativa

3 RNA vs. DNA nucleoside glycosidic bond nucleotide

4 RNA vs. DNA - OH Unstable backbone Stable backbone Base-catalyzed RNA cleavage!

5 Different bases in RNA and DNA RNA only DNA only DNA and RNA

6 Examples of modified bases found in RNA Dihydrouridine Pseudouridine 1-methylguanosine 7-methylguanosine 1-methyladenosine 2-thiocytidine 5-methylcytidine Ribothymine

7 Examples of RNA structural motifs Secondary structures Tertiary structures

8 Secondary structure Tertiary structure

9 RNA polynucleotide chain 2 -OH makes 3, 5 phosphodiester bond unstable DNA polynucleotide chain

10 Replicazione CONFRONTO Trascrizione primer meccanismo chimico direzione di sintesi (5 >3 ) uso di uno stampo / coinvolge l intero cromosoma entrambe le due catene servono da stampo attività di correzione 3 >5 velocità di polimerizzazione nt/sec è selettiva solo una delle due catene serve da stampo molto scarsa 50nt/sec

11 CATENA STAMPO E CATENA CODIFICANTE NEL DNA Le due catene hanno funzioni differenti durante la trascrizione:

12 IN OGNI CROMOSOMA, GENI DIFFERENTI POSSONO USARE CATENE DIFFERENTI COME STAMPO Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed. Esempio: genoma di adenovirus

13 Classes of prokaryotic RNA ribosomal RNA (rrna) 16S (small ribosomal subunit) 23S (large ribosomal subunit) 5S (large ribosomal subunit) transfer RNA (trna) messenger RNA (mrna) There is just one bacterial RNA polymerase

14 PROKARYOTIC RNA POLYMERASE STRUCTURE Subunit Number Role a 2 binds sequences upstream the promoter b (Rifampicin target)1 forms phosphodiester bonds b 1 binds DNA template s 1 recognizes promoter ω 1? a 2 bb ω s a 2 bb ω + s holoenzyme core polymerase sigma factor Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

15 La chimica della sintesi dell RNA Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 5 ed.

16 La sintesi dell RNA avviene in tre fasi 1.L RNA polimerasi cerca i siti di inizio (promotori) cui si lega. La trascrizione e selettiva

17 INTERAZIONE DNA-RNA POLIMERASI di E.coli regione -70 e +30 pb Figure Schematic representation of the major form of E. coli RNA polymerase bound to DNA. By convention, the transcription-initiation site is generally numbered +1. Base pairs extending in the direction of transcription are said to be downstream of the start site; those extending in the opposite direction are upstream. The s 70 subunit binds to specific sequences near the 10 and 35 positions in the promoter. The a subunits lie close to the DNA in the upstream direction. The b and b subunits associate with the start site.

18 PROMOTER STRUCTURE IN PROKARYOTES Promoter 5 PuPuPuPuPuPuPuPu AUG +1 [ ] mrna -30 region TTGACA AACTGT -36 T T G -31 A C A transcription start site T -10 region TATAAT ATATTA Pribnow box A T A A T 5 mrna % % consensus sequences

19 THE FUNCTION OF SIGMA FACTOR the sigma subunit of RNA polymerase is an initiation factor there are several different sigma factors (n=7) in E. coli that are specific for different sets of genes sigma factor functions to ensure that RNA polymerase binds stably to DNA only at promoters sigma destablizes nonspecific binding to non-promoter DNA sigma stabilizes specific binding to promoter DNA this accelerates the search for promoter DNA K a (M -1 ) Any DNA Promoter DNA (nonspecific) (specific) Core 2 X Holo 1 X to promoters vary in strength by ~two orders of magnitude

20 Differenti fattori sigma (σ) specifici per differenti set di geni Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed Il tipo di geni espressi dipende dalla disponibilità delle subunità σ

21 Regolazione della RNA polimerasi La regolazione dell inizio della trascrizione consiste nella regolazione dell interazione della RNA polimerasi con il suo promotore i promotori differiscono in sequenza nucleotidica affinità di legame della RNA polimerasi frequenza di inizio della trascrizione i promotori differiscono molto per la loro efficacia

22 Typical E.coli promoters recognized by an RNA polymerase holoenzyme containing s70 Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed. Strong promoters: close to consensus sequences and spacing Weak promoters: contain multiple substitutions at the -35 and -10 regions

23 La sintesi dell RNA avviene in tre fasi 1.L RNA polimerasi cerca i siti di inizio (promotori) cui si lega. La trascrizione e selettiva 2.L RNA polimerasi svolge un piccolo tratto di DNA a doppia elica : creazione dello stampo

24 Transcription initiation by prokaryotic RNA polymerase Holoenzyme a a s b b sliding and scanning Promoter Closed complex a a s b b Open complex; initiation 5 pppa rntps PPi mrna Core enzyme a b a b Sigma separates from the core once a few phosphodiester bonds are formed s

25 INTERAZIONE RNA POLIMERASI-DNA

26 INIZIO ED ALLUNGAMENTO DELLA TRASCRIZIONE IN E.coli Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

27 Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed Trascrizione

28 Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 5 ed.

29 La sintesi dell RNA avviene in tre fasi 1.L RNA polimerasi cerca i siti di inizio (promotori) cui si lega. La trascrizione e selettiva 2.L RNA polimerasi svolge un piccolo tratto di DNA a doppia elica : creazione dello stampo 3.L RNA polimerasi termina la trascrizione

30 TERMINE DELLA TRASCRIZIONE 1)terminatore intrinseco, ρ indipendente Terminatore intrinseco: Filamento stampo contenente una sequenza palindromica, seguita da una corta sequenza di A L RNA trascritto forma una stabile struttura a forcina L RNA contiene una coda poli-u

31 Terminatore intrinseco

32 Nelson & Cox I principi di Biochimica del Lehninger Zanichelli 6 ed 2) Terminazione ρ dipendente

33 Inibitori della trascrizione in Procarioti Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed La rifampicina inibisce l inizio della trascrizione: inibisce la formazione dei primi legami fosfodiesterici, si lega alle subunità β della RNA polimerasi batterica e blocca il canale attraverso il quale passa l ibrido DNA-RNA

34 Inibitori della trascrizione sia in Procarioti che Eucarioti Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.