BENZOILECGONINA (Metabolita della Cocaina) urinaria in GC-MS Cod. GC Metodo di conferma GC-MS

Transcript

1 BENZOILECGONINA (Metabolita della Cocaina) urinaria in GC-MS Cod. GC46010 Metodo di conferma GC-MS INTRODUZIONE La Cocaina è un alcaloide con una lunga storia di uso ed abuso. La sua determinazione di screening nei liquidi biologici (soprattutto in urina) viene generalmente effettuata usando tecniche immunometriche con l ausilio di anticorpi monoclonali e successiva marcatura con vari reagenti. Poiché tali tecniche non possono escludere falsi positivi, le positività allo screening devono essere confermate con tecnica alternativa, generalmente con tecnica cromatografia sia Gassosa (GC) che Liquida (LC) entrambe accoppiate con detector specifici e selettivi ( UV, Fluorescenza, MS). Il presente metodo consente di determinare la Benzoilecgonina, il maggiore metabolita della Cocaina, previa estrazione solido-liquido e lettura in GC-MS. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N 011 Benzoilecgonina urinaria in GC/MS Settembre

2 Principio del metodo : CARATTERISTICHE DEL KIT Il presente metodo consente di determinare la Benzoilecgonina, il maggiore metabolita della Cocaina, previa estrazione solido-liquido e lettura in GC-MS. Recupero del Metodo : > 95 % Sensibilità del Metodo : Range dinamico del Metodo : Valore di cut-off Benzoilecgonina: Contenuto della Confezione : circa 25,0 ng/ml circa ng/ml 100 ng/ml Rif. Procedure applicative del procedimento n.99/cu 30 ottobre 2007 Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a 2 8 C. Reagente A Soluzione Condizionamento 1 e Lavaggio 2, 2 x 200 ml Reagente B Soluzione Condizionamento 2, 1 x 200 ml Reagente C Soluzione Tampone, 1 x 200 ml Reagente D Soluzione Lavaggio 1, 1 x 200 ml Reagente E Soluzione Eluente, 1 x 100 ml Reagente F Soluzione Diluente, 1 x 5 ml Reagente H Soluzione Test, 1 x 0,5 ml Reagente P1 Calibratore liofilo urinario - Livello 1, 1 x 5 ml Reagente P2 Calibratore liofilo urinario - Livello 2, 1 x 5 ml Reagente P3 Calibratore liofilo urinario - Livello 3, 1 x 5 ml Reagente P4 Calibratore liofilo urinario - Livello 4, 1 x 5 ml Reagente P5 Calibratore liofilo urinario - Livello 5, 1 x 5 ml Reagente M Soluzione Derivatizzante, 1 x 5 ml (5 ampolle da 1 ml) Colonne di Clean-up, 100 pz Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento GC-MS Computer gestionale Dotazione opzionale : Autocampionatore Modalità di prelievo urinario : Prelevare 10 ml urina Stabile per circa 3 mesi a 20 C 2

3 PROCEDURA PREANALITICA : FASE 1 : In una provetta di vetro con tappo in teflon pipettare : 450 µl di Reagente F Sol. Diluente 50 µl di Reagente H Soluzione Test Al vortex per 20 secondi FASE 2 : Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso elio o azoto. FASE 3 : Riprendere con 50 µl di Reagente M - Soluzione Derivatizzante FASE 4: Porre in stufa a 70 C per 20 minuti Al vortex per 20 secondi Raffreddare a Temperatura ambiente FASE 5 : Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume. NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare 2 µl di questa soluzione in GC per identificare il tempo di ritenzione della Benzoilecgonina che deve essere simile a quello riportato in Fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PROCEDURA ANALITICA : FASE 1 : Condizionamento delle colonne di Clean-up Versare in colonna 1,5 ml di Reagente A Soluzione di Condizionamento 1 e Lavaggio 2 Scartare l eluato Versare in colonna 2 ml di Reagente B Soluzione di Condizionamento 2 Scartare l eluato Release N 011 Benzoilecgonina urinaria in GC/MS Settembre

4 FASE 2 : Preparazione del Campione Verificare che il campione urinario sia a ph compreso tra 5 e 7 Fare una curva di Calibrazione su 5 Livelli: Campione Campione 1000 µl Reagente P1 Calibratore liofilo urinario - Livello 1 Reagente P2 Calibratore liofilo urinario Livello 2 Reagente P3 Calibratore liofilo urinario Livello 3 Reagente P4 Calibratore liofilo urinario Livello 4 Reagente P5 Calibratore liofilo urinario Livello 5 Calibratore Livello µl Calibratore Livello µl Calibratore Livello µl Calibratore Livello µl Calibratore Livello µl Controllo Controllo 1000 µl Reagente C Sol µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl 2000 µl Tampone Controllare che il ph sia 6,0 Eventualmente correggerlo Agitare al Vortex FASE 3 : Versare tutti i campioni precedentemente preparati nelle colonne di Clean-up e scaricare ad un flusso di 1 ml/ minuto. FASE 4 : Lavaggio delle colonne di Clean-up: Lavare con 2 ml di Acqua di grado HPLC (non fornita nel kit) Scartare l eluato Lavare con 2 ml di Reagente D Soluzione di Lavaggio 1 Scartare l eluato Lavare con 2 ml di Reagente A Soluzione Condizionamento 1 e Lavaggio 2 Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria FASE 5 : Eluizione rigorosamente in provette di vetro con tappo in pyrex Eluire con 1 ml di Reagente E Soluzione Eluente Raccogliere l eluato in provette di vetro ed agitare al vortex FASE 6 : Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso elio o azoto. FASE 7 : Riprendere con 50 µl di Reagente M - Soluzione Derivatizzante Al vortex per 20 secondi Release N 011 Benzoilecgonina urinaria in GC/MS Settembre

5 FASE 8: Porre in stufa a 70 C per 20 minuti Raffreddare a Temperatura ambiente FASE 9 : Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume INIEZIONE : Iniettare 2 µl della soluzione nel GC Release N 011 Benzoilecgonina urinaria in GC/MS Settembre

6 REAGENTE H: SOLUZIONE TEST BENZOILECGONINA urinaria - Avvertenze Benzoilecgonina circa ng/ml REAGENTE P: CALIBRATORE LIOFILO URINARIO Lot 007 BENZOILECGONINA Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema GC. Aggiungere esattamente 5 ml di H 2 O di grado HPLC e agitare delicatamente per 20 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 36 mesi se conservati a 2 8 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 8 C e 1 mese a 20 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 1 x 5 x 5 ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. Liv.1 Liv.2 Liv.3 Liv.4 Liv.5 REAGENTE M: SOLUZIONE DERIVATIZZANTE Una volta aperta un ampolla trasferire tutto il contenuto, 1 ml, in una vial di vetro. Chiudere bene il tappo e conservare a 2-8 C. SETTAGGIO DEL GAS-CROMATOGRAFO : Colonna VF-5ms 30 m x 0,25 mm, 0,25 µm (condizionata) Temperatura iniettore 280 C Rapporto di Splittaggio Inizio: ON split 20 0 min: OFF 1 min: ON split min: ON split 20 Temperatura 120 C x 3,25 minuti + 20 C/min fino a 250 C x 1 minuto + 40 C/min fino a 300 C x 3 minuti (corsa 15 minuti) Gas Elio 1 ml/min SETTAGGIO DETECTOR DI MASSA (4000) : Range di Massa Temperatura della Massa: 180 C; Temperatura Transfer Line: 270 C; Temperatura Manifold: 80 C Filamento on: 3 minuti CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA VF-5 MS Seguire le prescrizioni del costruttore. Non condizionare la (le) colonna/e se attaccata al Detector di Massa. PULIZIA DELLA COLONNA E DELLA SIRINGA Lavare la siringa prima dell iniezione con ACETONE. Disconnettere il detector. Tenerla alla massima temperatura per il tempo consigliato. ( Vedi istruzioni del costruttore ) PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE 6

7 ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE CC46016 Calibratore urinario per Benzoilecgonina e Cocaetilene 2 x 5 x 5 ml CC43017 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livello 1 6 x 5 ml CC43018 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livello 2 6 x 5 ml CC43019 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livelli 1 e 2 2 x 6 x 5 ml Z Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 Pz S Riduttori di volume per vials da 2 ml 1 x 100 Pz 7

8 Benzoilecgonina (metabolita della cocaina) urinaria (Cromatogrammi/Spettri di riferimento in GC-MS) M Counts 02 t beg.sms 50:500 50: % Spectrum 1A BP: min, Scan: 1069, 50:500, Ion: 71 us, RIC: 2.938e+6, BC % Area: Beg TMS ng/ml min 50% % % minutes m/z Fig. 1 : Soluzione Test Fig. 2 : Spettro di Massa di Soluzione Test R.T Benzoilecgonina IONE MOLECOLARE : 82 8

9 Benzoilecgonina (metabolita della cocaina) urinaria (Cromatogrammi/Spettri di riferimento in GC-MS) M Counts cal 1000.sms 50: : % Spectrum 1A BP: min, Scan: 763, 50:1000, Ion: 47 us, RIC: 4.032e+6, BC % Area: 1.016e+6 Beg TMS 2032 RF min 50% % % minutes m/z Fig. 3 : Calibratore liofilo urinario Fig. 4 : Spettro di Massa di Calibratore urinario R.T Benzoilecgonina 1000 ng/ml IONE MOLECOLARE : 82 9

10 Benzoilecgonina (metabolita della cocaina) urinaria (Cromatogrammi/Spettri di riferimento in GC-MS) M Counts campione urinario 500.sms 50: : % Spectrum 1A BP: min, Scan: 762, 50:1000, Ion: 118 us, RIC: 1.391e+6, BC % % Area: Beg TMS 1629 RF min 25% % minutes m/z Fig. 5 : Campione urinario Fig. 6 : Spettro di Massa di Campione urinario R.T Benzoilecgonina 500 ng/ml IONE MOLECOLARE : 82 10