VETTORI DI CLONAGGIO

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1 VETTORI DI CLONAGGIO

2 Perché clonare il DNA Per preparare una sonda di ibridazione Per costruire una genoteca allo scopo di isolare un gene o un cdna Per trascrivere un gene e ottenere quantità elevate del relativo RNA Per trascrivere e tradurre un gene per ottenere quantità elevate della relativa proteina Per sequenziare una molecola di DNA Per mutare un gene Per studiare la funzione di un elemento regolativo (es.: promotore, enhancer, silencer)

3 I vettori di clonaggio: : differenze nelle dimensioni degli inserti Vettore Ospite naturale Dimensioni inserto Plasmidi E. coli 5-10 kb Fago λ E. coli 5-25 kb Cosmidi E. coli kb Fago P1 E. coli kb PAC E. coli kb BAC E. Coli 300 kb YAC S. cerevisiae kb

4 Vettori per applicazioni specializzate Vettori per il clonaggio di DNA a singolo filamento Vettori per la preparazione di sonde a RNA Vettori per l espressione di proteine: Vettori che massimizzano la sintesi proteica Vettori che semplificano la purificazione delle proteine ricombinanti Vettori che favoriscono la solubilizzazione delle proteine espresse Vettori che promuovono l esportazione delle proteine

5 I PLASMIDI

6 La biologia dei plasmidi naturali: caratteristiche generali I plasmidi sono molecole di DNA extracromosomico che si propagano stabilmente nei batteri perché in grado di autoreplicarsi Nella maggioranza dei casi assumono la forma di molecole circolari di DNA a doppio filamento, con dimensioni che vanno da 1,5 a 500 kb Sono ampiamente diffusi nei procarioti Non sono indispensabili alla sopravvivenza della cellula ospite, tuttavia le conferiscono talvolta fenotipi molto utili: resistenza ad antibiotici sintesi di antibiotici fermentazioni di zuccheri sintesi di enterotossine resistenza a metalli pesanti sistemi di restrizione-modificazione del DNA degradazione di composti aromatici

7 La biologia dei plasmidi naturali: caratteristiche generali Lo spettro d ospite: d ampio o ristretto Sequenza ORI Geni del plasmide coinvolti nella replicazione Il numero di copie: basso (1 4), medio (~10)( e alto (20 40) Meccanismi molecolari che regolano la replicazione la stabilità segregativa Regione par Superavvolgimento Incompatibilità Utilizzo dello stesso meccanismo di controllo della replicazione

8 I plasmidi come vettori di clonaggio: caratteristiche desiderabili Basso peso molecolare facili da manipolare facili da purificare in genere sono ad alto numero di copie siti unici per un ampio numero di enzimi di restrizione marcatori genetici selezionabili

9 pbr322, il capostipite dei vettori plasmidici artificiali passaggi molecolari per la creazione di pbr322

10 Mappa di restrizione di pbr siti unici di restrizione nel gene Tc R e 6 nel gene Ap R, utili per il clonaggio pbr bp pbr bp

11 La famiglia dei plasmidi puc I vantaggi del Multiple Cloning Site 1. Aumenta la flessibilità delle strategie di clonaggio poiché aumenta la scelta degli enzimi di restrizione utilizzabili per il clonaggio. 2. Si può effettuare un clonaggio con due diversi enzimi di restrizione, senza rischiare di rimuovere parti importanti del vettore, eliminando così il problema della ricircolarizzazione del plasmide. 3. L MCS di puc è inserito all interno del gene lacz permettendo la selezione bianco/blu dei cloni contenenti il plasmide ricombinante.

12 Inserzione di un frammento di DNA nel plasmide puc19

13 HOCH 2 HOCH 2 O O HO Galactose O Glucose OH HO OH HO OH Lactose O-β-D-galactopyranosyl-(1->4)-β-D-glucopyranose

14 X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-d-galactopyranoside HO HOCH 2 O Galactose β-galactosidease Lac Z gene product O H 2 O Cl Br HO OH X-Gal (Colorless) N H

15 X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-d-galactopyranoside β-galactosidease HOCH 2 O Cl HO Galactose OH HO Br HO OH N H Blue

16 So How Do You Know If You Cloned Something? IPTG - Induces expression of lacz X-Gal - A lactose analog which turns blue when split by β-galactosidase Ampicillin - Kills all bacteria that lack the plasmid

17 IPTG - Induces expression of lacz X-Gal - A lactose analog which turns blue when split by β-galactosidase Ampicillin - Kills all bacteria that lack the plasmid So How Do You Know If You Cloned Something? Blue colonies - Express β-galatosidase which metabolizes colorles X-gal to blue and turn blue thus lacz is not disrupted and there is no foreign DNA cloned Cloned fragments disrupt lacz thus make no b-galactosidase and colonies remain white

18 Introduzione dei vettori plasmidici in cellule batteriche Trasformazione con CaCl 2 Batteri trattati con soluzioni fredde di ioni bivalenti, in particolare di ioni calcio, lasciano entrare molecole di DNA in modo più efficiente. Si ipotizza che il calcio modifichi le proprità chimico-fisiche della parete e della membrana plasmatica rendendole più permeabili al DNA.

19 Introduzione dei vettori plasmidici in cellule batteriche Elettroporazione Le cellule (procariotiche ed eucariotiche) sottoposte a stimolazione elettrica possono internalizzare il DNA. Impulsi elettrici ad alto voltaggio destabilizzano la membrana plasmatica e inducono la formazione di pori transienti del diametro di alcuni nanometri, attraverso cui possono passare molecole di DNA.

20 Apparecchio per l elettroporazione cuvette cuvette 0.4cm

21 I metodi per la purificazione del DNA plasmidico 1. Gradiente di densità in CsCl contenente etidio bromuro Le molecole di DNA a doppio filamento circolari chiuse assorbono meno EtBr rispetto alle lineari. Dal momento che la densità dei complessi DNA-EtBr è inversamente proporzionale alla quantità del composto intercalante, le molecole di plasmide hanno una densità maggiore di quella del DNA lineare cromosomico e possono quindi essere separate in un gradiente di densità di CsCl

22 2. Lisi alcalina delle cellule batteriche e precipitazione selettiva del DN A plasmidico. Trattamento con lisozima per indebolire la parete cellulare. Trattamento con Sodio Dodecil Solfato (SDS) per degradare la membrana plasmatica e con NaOH per denaturare il frammenti lineari ad alto peso molecolare di DNA cromosomico. Precipitazione selettiva del DNA cromosomico ad alto peso molecolare con sodio acetato a ph acido. 3. Kit commerciali di estrazione e purificazione. Associano la lisi alcalina all utilizzo di resine a scambio ionico preimpaccate in colonne. 4. Lisi batterica in gel di agarosio per plasmidi di grandi dimensioni. Dopo trattamento con lisozima i batteri vengono lisati in gel di agarosio a cui viene aggiunto un detergente. Il DNA plasmidico viene recuperato direttamente dal gel.

23 IL BATTERIOFAGO λ

24 La biologia del fago λ: caratteristiche generali

25 La biologia del fago λ: caratteristiche generali ciclo litico e ciclo lisogenico del fago λ

26 Tappe principali del ciclo litico del fago λ Infezione Circolarizzazione del genoma Replicazione bidirezionale del genoma Replicazione a cerchio rotante

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28 Tappe principali del ciclo litico del fago λ Infezione Circolarizzazione del genoma Replicazione bidirezionale del genoma Replicazione a cerchio rotante Sintesi delle proteine della testa e della coda Impaccamento del genoma nella testa Assemblaggio della coda

29 Impaccamento del DNA genomico del fago λ nelle particelle fagiche Un singolo genoma viene tagliato in corrispondenza della sequenza cos e inserito nel testa

30 La biologia del fago λ: il genoma Non essenziale per il ciclo litico COS COS Non essenziale per il ciclo litico Il genoma del fago λ è una molecola di DNA lineare a doppio filamento lunga 48,5 kb. Al 5 di ciascuna delle estremità è presente un prolungamento a singolo filamento di 12 nt che costituisce le estremità cos

31 Il fago λ come vettore di clonaggio

32 Il fago λ come vettore di clonaggio Il braccio sinistro contiene l informazione genetica per la produzione delle teste e delle code. Il braccio destro contiene i geni per la replicazione del DNA e per la lisi delle cellule. Il frammento intermedio porta i geni per i processi di integrazione-escissione.

33 Selezione delle placche fagiche ricombinanti Prodotti della reazione di ligasi A Saldatura di due bracci Non danno progenie fagica. Non si impaccano nella testa poiché hanno una dimensione <37 kb (~29 kb) B Genoma selvatico Non danno progenie fagica nel ceppo E. coli lisogeno per il fago P2, poiché hanno fenotipo Spi +, ossia sono sensibili alla inibizione da parte del profago P2 C Genoma ricombinante Danno progenie fagica nel ceppo E. coli lisogeno per il fago P2, poiché sono Spi -, ossia sono resistenti alla inibizione da P2

34 I vettori λ EMBL

35 Introduzione dei vettori λ in cellule batteriche: Impaccamento in vitro del DNA del fago λ + + concatenamero del genoma ricombinante + proteine di assemblaggio Molecole di DNA di dimensioni inferiori a 37 kb o superiori a 52 kb non vengono impaccate. Questo determina il limite di clonaggio per inserti di dimensioni non superiori alle 23 kb Efficienza di trasferimento del vettore λ nelle cellule ospiti: Trasformazione: placche/μg DNA ricombinante Trasfezione: 10 6 placche/μg DNA

36 Produzione delle teste e delle code del fago λ per l impaccamento in vitro del DNA ricombinante

37 Crescita in laboratorio del fago λ Fago λ Batteri In laboratorio il fago lambda viene cresciuto su una patina di cellule batteriche. I batteri e le particelle di fago vengono mescolate con top agar liquido non troppo caldo. La sospensione viene versata su una piastra di agar già preparata, sulla quale il top agar viene lasciato solidificare. La piastra è incubata per h a 37 C.

38 Vantaggi dei vettori fagici rispetto ai vettori plasmidici Maggiore capienza Maggiore efficienza di trasferimento del DNA nelle cellule batteriche Facilità di purificazione del vettore ricombinante

39 I FAGI A SINGOLA ELICA

40 La biologia del fago M13: il ciclo vitale Il genoma del fago M13 è costituito da una molecola di DNA circolare a singola elica, lunga 6407 nt. M13 infetta solo ceppi F + poiché entra nella cellula batterica attraverso il pilo codificato dal fattore F. Il DNA viene convertito nella forma replicativa intermedia a doppio filamento (RF). Vengono sintetizzate circa 100 copie della forma RF. Inizia la replicazione a cerchio rotante di un unica elica del genoma virale. Vengono sintetizzate circa 1000 copie. Il genoma viene assemblato alle proteine per costituire le nuove particelle virali che fuoriescono dalla cellula batterica senza causarne la lisi.

41 Il batteriofago M13 come vettore per il clonaggio di DNA a singolo filamento Il genoma del fago M13, nella sua forma replicativa intermedia RF, viene utilizzato come vettore di clonaggio. Modificazioni del genoma selvatico per l ottimizzazione del vettore: Aggiunta del gene lacz come marcatore genetico per la selezione bianco/blu delle placche positive contenenti il genoma ricombinante Aggiunta di un polylinker all interno del gene lacz Eliminazione dei siti di restrizione naturali

42 Tappe del clonaggio di DNA a singolo filamento nei vettori derivati dal fago M13 Clonando l inserto nell orientamento opposto si ottengono copie multiple dell elica complementare Si linearizza il vettore M13 a doppio filamento con un enzima di restrizione, come se fosse un plasmide. Si mescola il vettore linearizzato con l inserto avente estremità coesive compatibili con quelle del vettore. Si aggiunge la ligasi. Il prodotto della reazione di ligasi viene inserito nelle cellule E. coli mediante trasformazione. Nell ospite batterico il vettore verrà replicato prima in maniera bidirezionale producendo copie a doppia elica e poi a cerchio rotante producendo copie a singola. Si selezionano le placche di colore bianco contenenti il vettore ricombinante e si scartano le blu contenenti il vettore virale senza inserto.

43 Perché si clona DNA a singolo filamento? Per sequenziare l inserto clonato con il metodo di Sanger Per mutare l inserto l con le tecniche di mutagenesi sito-specifica specifica Per ottenere sonde di ibridazione a singola elica Vantaggi del vettore M13 La forma replicativa RF a doppio filamento può essere manipolata come un normale plasmide Non ci sono limiti nelle dimensioni dell inserto come per il vettore lambda poiché le dimensioni delle particelle virali dipondono dalla lunghezza del DNA che contengono. Tuttavia inserti di dimensioni maggiori di 8-98 kb rendono instabili il vettore

44 I COSMIDI

45 Caratteristiche dei vettori cosmidici I cosmidi sono vettori di clonaggio creati dall uomo. Uniscono alcune proprietà dei pasmidi e dei fagi. Sono plasmidi contenenti la regione COS del fago lambda. Si replicano come i plasmidi poiché contengono la sequenza ORI,, ma si impaccano nelle teste proteiche a formare le particelle virali come i fagi poiché contengono le estremità cos. Dimensioni del cosmide: ~5 kb ORI Polylinker Marcatori genetici selezionabili (in genere il gene Ap R e lacz ) Sito Cos

46 Schema semplificato del clonaggio in vettori cosmidici Linearizzazione del cosmide con un enzima di restrizione Digestione enzimatica del DNA genomico e selezione dei frammenti con dimensioni di kb Reazione di ligasi Impaccamento in vitro Infezione delle cellule batteriche. Nelle cellule ospiti il cosmide circolarizza e si replica come un plasmide Selezione bianco/blu delle colonie batteriche ampicillina resistenti in terreno contenente ampicillina e X-Gal

47 Svantaggi nella sintesi del cosmide ricombinante Ligazione tra i frammenti da clonare Circolarizzazione del plasmide Ligazione tra due molecole di vettore Soluzioni Defosforilazione dei frammenti da clonare Digestione del cosmide con due enzimi

48 Clonaggio in vettori cosmidici di ultima generazione Vettore. Due siti cos separati da un sito di restrizione per Sca I, che produce estremità piatte. Digestione del cosmide con BamH I e Sca I Genoma. Digestione parziale del DNA genomico con BamH I. Defosforilazione dei frammenti di DNA genomico per evitare la ligazione tra due frammenti

49 Vantaggi dei vettori cosmidici Clonaggio di inserti di dimensioni comprese tra le 32 le 47 kb. Migliore efficienza di trasferimento del vettore ricombinante nelle n cellule batteriche. Sono molto utili ai fini della creazione di una genoteca poiché gli inserti di maggiori dimensioni permettono lo screening di un numero più ridotto di cloni.

50 Plasmidi, fagi e cosmidi a confronto Vettore Dimensioni inserto propagazione Introduzione nei batteri Plasmidi 5-10 kb Replicazione del plasmide Trasformazione Fago λ 5-23 kb Riproduzione del fago Infezione fagica Cosmidi kb Replicazione del plasmide Infezione fagica

51 I VETTORI P1

52 La biologia del fago P1 Il genoma del batteriofago P1 è costituito da una molecola di DNA a doppio filamento, lunga 115 kb e impaccata all interno di una testa fagica. Dopo l infezione del batterio il fago P1 può: attivare il ciclo litico producendo particelle fagiche e lisando il batterio reprimere il ciclo litico e mantenersi nella cellula come un grosso plasmide a basso numero di copie Il fago P1 possiede due origini di replicazione, una per controllare la replicazione litica (fagica), e l altra per mantenere il plasmide durante la crescita non litica

53 Il fago P1 come vettore di clonaggio Dimensioni del vettore: ~ 15 kb sito pac siti loxp Marcatori genetici (Ap R, Tc R, Kan R, sacb) Replicone plasmidico Replicone fagico (litico)

54 La ricombinazione sito-specifica specifica La sequenza interposta tra i due siti loxp orientati come ripetizioni dirette viene deleta La sequenza interposta tra i due siti loxp orientati come ripetizioni invertite viene invertita Sito loxp riconosciuto dalla ricombinasi Cre del batteriofago P1. I siti loxp sono sequenze di 34 bp che comprendono due ripetizioni invertite di 13 bp che fiancheggiano un elemento centrale di 8 bp

55 Tappe del clonaggio in vettori derivati dal fago P1 Il vettore viene digerito in modo da generare due bracci che vengono defosforilati per impedirne l autosaldatura Digestione enzimatica del DNA genomico e selezione dei frammenti con dimensioni di kb Reazione di ligasi per saldare i frammenti di DNA genomico ai bracci Impaccamento in vitro del vettore ricombinante in presenza delle teste e delle code fagiche e in presenza dell enzima enzima pacasi Infezione di un ceppo cre + di E. coli.. Nelle cellule ospiti la ricombinasi induce la circolarizzazione del vettore che inizia a replicarsi come un plasmide Si può incrementare l amplificazione l del numero di copie del vettore inducendo il replicone litico del fago

56 Tappe del clonaggio in vettori derivati dal fago P1

57 I VETTORI BAC

58 Caratteristiche dei vettori BAC siti cos del fago λ siti loxp del fago P1 polylinker marcatori genetici selezionabili (Cm R, lacz, sacb) oris e repe per la replicazione del fattore F i geni par per la stabilità segregativa I Cromosomi Artificiali Batterici (BAC) sono vettori che derivano dal fattore sessuale F

59 Vettori di clonaggio a confronto Vettore Dimensioni inserto propagazione Introduzione nei batteri Plasmidi Fago λ Cosmidi Fago P kb Replicazione del plasmide Trasformazione/ Elettroporazione 5-23 kb Riproduzione del fago Infezione fagica kb Replicazione del plasmide Infezione fagica kb Replicazione del plasmide Infezione fagica Riproduzione del fago BAC 300 kb Replicazione del Fattore F Trasformazione/ Elettroporazione

60 I VETTORI YAC

61 YAC: Yeast Artificial Chromosome ARS: Autonomously Replicating region, sequenza a replicazione autonoma di lievito. CEN: è una sequenza di 125 bp tratta dai cromosomi di lievito che permette una segregazione regolare dei vettori durante la mitosi delle cellule. TEL: è una sequenza di 13 bp ripetuta molte volte. E tratta dai telomeri dei cromosomi di lievito e serve a dare stabilità al vettore. Vantaggi: si possono clonare frammenti di DNA molto grandi (fino a 1Mb) Svantaggi: i costrutti sono difficili da manipolare perché fragili e nell ospite tendono a ricombinare

62 Introduzione di DNA nelle cellule di lievito Produzione di sferoplasti e trattamento con polietilenglicole Elettroporazione Coniugazione batterio lievito Marcatori genici di selezione Geni implicati nella biosintesi di uno specifico nutriente, in genere un amminoacido. I marcatori più utilizzati sono: His3, Leu2, Trp1, Lys2, Ura3. Il ceppo di lievito utilizzato nella trasfezione deve essere difettivo per la via biosintetica in questione. I ceppi che hanno internalizzato il vettore vengono identificati per la loro capacità di complementare il difetto nutrizionale, pertanto vengono fatti crescere su un terreno privo dello specifico nutriente.

63 Plasmidi per la preparazione di sonde a RNA Sono plasmidi caratterizzati dalla presenza di uno o più promotori fagici per la trascrizione dell inserto. Caratteristiche dei promotori fagici T3, T7 ed Sp6: 1. sono promotori molto forti 2. non sono riconosciuti dalla RNA pol di E.coli 3. le RNA pol dei fagi T3, T7 ed Sp6 sono enzimi semplici da manipolare

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65 Possibili domande di esame sui vettori di clonaggio Quali sequenze contengono Come si clonano gli inserti Quali sono i limiti delle dimensioni degli inserti Come vengono inseriti nella cellula ospite Come si replicano all interno della cellula ospite Come vengono selezionate le colonie o le placche contenenti i vettori ricombinanti