UNIVERSITÀ - OSPEDALE di PADOVA MEDICINA NUCLEARE 1. Medicina Nucleare in Vitro o metodiche radionuclidiche non imaging.

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1 UNIVERSITÀ - OSPEDALE di PADOVA MEDICINA NUCLEARE 1 Medicina Nucleare in Vitro o metodiche radionuclidiche non imaging Lezione 7: Generalità à sul RIA D. Cecchin, F. Bui

2 Diverse tipologie di RIA? 1) DOSAGGIO ALL EQUILIBRIO: E la metodica più spesso utilizzata e consiste nell incubare simultaneamente antigene non marcato, antigene marcato ed anticorpo. Schema: AB + AG + AG* 2) DOSAGGIO PER COMPETIZIONE DI LEGAME: In un primo tempo si incubano antigene marcato e anticorpo. Il complesso (AB+AG*) viene poi incubato con l antigene non marcato (che spiazza in parte il marcato). Schema: AB + AG* ABAG* + AG 3) DOSAGGIO SEQUENZIALE: Si incubano, in eccesso di anticorpo, antigene non marcato e anticorpo. Successivamente viene aggiunto l antigene marcato che satura i restanti siti anticorpali liberi. Pur essendo generalmente piu sensibile, il range di concentrazioni misurabili e molto ridotto. Schema: AB + AG ABAG + AG*

3 Conte aspecifiche o Bianco (NSB) In una situazione ideale (utopica) si riescono a separare perfettamente frazione legata (ABAG e ABAG*) e frazione libera (AB, AG, AG*). Purtroppo nella realtà una quota della frazione libera non è separabile dalla frazione legata. La quota di antigene marcato libero che resta assieme alla frazione legata da dei conteggi aspecifici (perche c e solo l antigene marcato ma non e legato ad un anticorpo). Tali conteggi vengono anche definiti bianco o conte aspecifiche Perchè questo fenomeno? Piccole quantita della frazione libera restano intrappolate nel precipitato ed e difficile anche con buoni lavaggi eliminarla totalmente. L isotopo radioattivo puo avere contaminanti radioattivi che non si legano all antigene ma restano in soluzione e contribuiscono ai conteggi aspecifici. A tal proposito esistono i controlli di qualita per il tracciante. Adsorbimento alla parete della provetta. Per questo sono stati sviluppati materiali che minimizzino l adsorbimento. Utilizzo di tecniche sbagliate o poco efficaci per la separazione.

4 Metodi di separazione La separazione e quella procedura che serve a separare la frazione libera da quella legata. Se il metodo fosse perfetto la separazione avrebbe le seguenti caratteristiche ideali: 1) Non essere influenzata dalle sostanze presenti nel siero. 2) Separare completamente frazione libera e legata. 3) Non interferire con la reazione antigene anticorpo. 4) Essere rapida, semplice ed economica. Come e evidente un metodo che soddisfi a tutte queste caratteristiche non esiste. Non resta allora che scegliere di volta in volta il metodo di separazione più efficace.

5 Separazione: precipitazione aspecifica Precipitazione non specifica della frazione legata (complessi ABAG e ABAG*) con sali e solventi: il PEG (polietilenglicole), l etanolo, il solfato d ammonio ed altre sostanze trasformano la frazione legata da solubile ad insolubile provocandone quindi la precipitazione. La frazione libera resta invece solubile e viene quindi eliminata. Come e intuitivo e importante trovare un giusto equilibrio della concentrazione di sali e solventi in modo tale che precipiti solo la frazione legata e non anche quella libera. Le concentrazioni consigliate (che variano pero con il kit) sono: 40-50% per il solfato d ammonio % per il polietilenglicole % per l etanolo. Tale tecnica e rapida, semplice, economica e riproducibile ma e gravata da una certa precipitazione della frazione libera e da una incompleta precipitazione di quella legata. Inoltre dipende da ph, temperatura e concentrazione proteica. Se si aumenta la concentrazione di sali e solventi inoltre aumentano molto le conte aspecifiche (bianco).

6 Separazione: immunoprecipitazione Immunoprecipitazione dei complessi (tecnica del doppio anticorpo): Un secondo anticorpo diretto contro l anticorpo della prima reazione viene aggiunto alla miscela. Si ha la formazione di grossi complessi insolubili che precipitano (AB1AG* + AB1AG + AB2 = AB1AG*AB2 o AB1AGAB2). Tale tecnica viene anche definita postprecipitazione. La preprecipitazione invece consiste nel far reagire i due anticorpi e solo in un secondo momento aggiungere l antigene. Questa seconda tecnica ha una minore sensibilita perche spesso il legame fra i due anticorpi interferiscce con il legame antigene-anticorpo. L immunoprecipitazione e specifica, separa bene frazione libera e legata ed e indipendente da temperatura e ph tuttavia servono due anticorpi e molti passaggi in piu il che richiede tempo, denaro ed e indubbia possibile fonte di errori analitici. Talora inoltre alcune proteine possono crossreagire con il secondo anticorpo Una variante della tecnica del doppio anticorpo prevede la combinazione con la tecnica del gel. In altre parole si aggiunge PEG in bassa concentrazione 5%-6% al fine di accelerare la precipitazione dei due anticorpi.

7 Separazione: Adsorbimento su fase solida Adsorbimento dell anticorpo su fase solida (es provette sensibilizzate con l anticorpo): Provette di materiale plastico (polistirene, polivinile o polipropilene) vengono lasciate a contatto dell anticorpo per molte ore. Un legame non covalente, aspecifico, idrofobico lega gli anticorpi alla parete delle provette. Si utilizzano poi i supporti cosi preparati per la reazione immune. Si noti che affinche una proteina venga adsorbita con un legame idrofobico ad una parete e necessario un ph tra per le IgG, una giusta concentrazione di sali (forza ionica), la temperatura intorno ai 20 gradi e due ore di tempo. Le provette vanno conservate a 4 gradi. Quando i successivi passaggi lo consentano si possono trattare le provette con glutaraldeide che trasforma il legame da idrofobico a covalente. L adsorbimento su fase solida quindi pur essendo efficace è gravato dalle condizioni suddette e da altri svantaggi: Ha dei limiti con grossi ormoni polipeptidici (che fanno fatica a spostarsi in soluzione fino alle pareti della provetta), servono grosse quote di anticorpo ed esiste un limite fisico sterico al numero di anticorpi legabili (per non ostacolare la reazione antigene anticorpo).oltre alle provette l anticorpo puo essere legato a molti altri materiali: particelle (polimeri di polisaccaridi e grani come il Sephadex), dischi di carta o vetro, cellulosa attivata ( con bromuro di cianogeno) ecc

8 Separazione: Adsorbimento su fase solida Adsorbimento non specifico dell antigene: Il DCC o carbone attivato destrano ha una superficie irregolare in grado di adsorbire molecole in modo diverso a seconda della loro massa e carica. Se, quindi massa e carica di frazione libera e legata sono abbastanza diverse il carbone lega la frazione libera e viene eliminato lasciando in soluzione la frazione legata. Anche talco, silice, idrossiapatite e resine a scambio ionico funzionano in modo analogo. L adsorbimento non specifico, quando possibile, e una tecnica semplice riproducibile, che richiede un solo passaggio ed economica. Tuttavia e influenzata da ph, temperatura, forza ionica e concentrazione proteica (standard controlli e campioni devono avere una concentrazione proteica molto simile).

9 Separazione: Filtrazione e Proteina A Filtrazione su gel (e cromatografia ed elettroforesi): Un gel composto da destrani polimerizzati (es Sephadex) ha la proprietà di imprigionare nella sua trama la frazione libera. La frazione legata che è piu grande e pesante invece attraversa il gel. La tecnica non è semplice e viene utilizzata di rado. Proteina A: La proteina A è una costituente della parete dello Stafilococco Aureo. Ha la peculiarità di legare il frammento Fc della maggior parte delle immunoglobuline G (IgG) dei mammiferi. Tale sito è importante perchè è lontano dal sito di legame con l antigene (e una tecnica simile a quella del doppio anticorpo).

10 UNIVERSITÀ - OSPEDALE di PADOVA MEDICINA NUCLEARE 1 Medicina Nucleare in Vitro o metodiche radionuclidiche non imaging Lezione 7: Generalità à sull IRMA D. Cecchin, F. Bui

11 Definizione: La tecnica IRMA è simile concettualmente al RIA ma vengono marcati gli anticorpi e non gli antigeni. Si lavora in eccesso di anticorpo. L impulso alla tecnica fu la possibilità di ottenere anticorpi monoclonali con la tecnica degli ibridomi (si fonde una cellula di mieloma con un linfocita, che produce una specifica immunoglobulina, ottenendo un ibridoma. Si inietta poi tale ibridoma nel peritoneo del topo. In tale sede si forma una coltura di cellule di mieloma che riversano anticorpi monoclonali nel liquido ascitico che risultano facilmente prelevabili). Proprio perchè utilizza anticorpi monoclonali (come tali specifici e provenienti da una sola linea cellulare) l IRMA e in genere piu sensibile del RIA. E un metodo non competitivo. Si ottiene una curva dose risposta dove i conteggi crescono linearmente con l aumento della concentrazione dell analita in esame

12 Metodologia: IRMA Sandwich Si utilizzano due diversi anticorpi diretti contro due diversi epitopi dell antigene. Uno dei due e legato in fase solida, il secondo e marcato con un isotopo (I-125). La procedura prevede: a) Il campione del paziente viene aggiunto ad una provetta dove c e l anticorpo legato in fase solida. b) Incubazione c) Si lava l eccesso di liquido e si aggiunge il secondo anticorpo marcato con un isotopo (I-125) d) Si forma un sandwich AB-AG-AB(I125) adeso alla parete. e) Si lava e si conta la fase solida.

13 Metodologia: IRMA Classico L IRMA possiede, come detto, il vantaggio della maggiore sensibilita ma e gravata dall effetto hook che consiste nel distacco dei complessi AB-AG legati in fase solida ed il formarsi di complessi AB-AG-AB(I125) in soluzione (non legati alla parete) che vengono lavati via. IRMA classico : Si fanno reagire anticorpo marcato ed antigene in soluzione. Passo poi la soluzione cosi ottenuta in una provetta che ha adesi alla parete antigeni. L anticorpo marcato non legato si leghera alle pareti lasciando in soluzione la frazione legata.