RICERCA E CONTEGGIO DI LISTERIA MONOCYTOGENES ED ALTRE SPECIE LISTERIA

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1 METODO STANDARD HPA RICERCA E CONTEGGIO DI LISTERIA MONOCYTOGENES ED ALTRE SPECIE LISTERIA F 19 Emesso da Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training Centre for Infections Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 1 di17 Riferimeto no: F 19i3

2 STATO DEI METODI STANDARD NAZIONALI I Metodi Standard Nazionali, che includono le procedure operative standard (SOPs), algoritmi e note guida, promuovono prestazioni di elevata qualità e contribuiscono ad assicurare il confronto delle informazioni diagnostiche ottenute da laboratori diversi. Ciò facilita la standardizzazione della sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e controllo, promovendo nel contempo la salute pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. Questi metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard per la microbiologia clinica e la salute pubblica. Tuttavia, utilizzando i Metodi Standard Nazionali, i laboratori devono tener conto delle necessità locali e possono richiedere di intraprendere ricerche addizionali. Questi metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. I Metodi Standard Nazionali sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con un ampio processo di consultazione in cui le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in considerazione ed i documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi. I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo è presente sulla pagina iniziale, sono membri dei gruppi di lavoro che hanno sviluppato i Metodi Standard Nazionali. L inclusione del logo di una organizzazione nella prima pagina implica il sostegno per gli obiettivi e le procedure volte alla predisposizione dei metodi standard. Questi rappresentanti partecipano allo sviluppo dei Metodi Standard Nazionali ma le loro opinioni non sono necessariamente quelle dell insieme dell organizzazione di cui sono membri. L elenco aggiornato delle organizzazioni partecipanti può essere ottenuto inviando una a standards@hpa.org.uk La prestazione dei metodi standard dipende dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure dei prova commerciali o messi a punto in loco. I laboratori devono garantire che queste siano state validate e che siano idonee allo scopo prefissato. Devono anche essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed esterno. Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la Health Protection Agency non può essere ritenuta responsabile dell accuratezza o dell utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall uso o da modifiche delle informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i professionisti che operano in questo settore nel Regno Unito, pertanto, se necessario, si dovrà ricorrere ad altri consulenti. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, devono essere omessi tutti i riferimenti alla Health Protection Agency. La Health Protection Agency (HPA) dovrebbe in ogni caso essere informata La Health Protection Agency è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Informazioni più dettagliate possono essere trovate sul sito La Health Protection Agency è un organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza 1. Maggiori informazioni possono essere ottenute sul sito web. Contributi allo sviluppo dei documenti sono possibili contattando standards@hpa.org.uk. Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager, la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente. Riferimento suggerito per questo documento: Health Protection Agency (2009). Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes and other Listeria species. National Standard Method F 19 Emissione 3 Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 2 di17

3 INDICE STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD... 2 INDICE... 3 PROCEDURA DI MODIFICA... 4 INTRODUZIONE PRINCIPIO DEFINIZIONI CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ATTREZZATURA TERRENI DI COLTURA PROCEDIMENTO SUL CAMPIONE PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER LA RICERCA PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER IL CONTEGGIO RICONOSCIMENTO E CONTEGGIO DELLE COLONIE PROVE DI CONFERMA 10 7 CALCOLO DEI RISULTATI REFERTAZIONE DEI RISULTATI STRUTTURE DI RIFERIMENTO RINGRAZIAMENTI E CONTATTI APPENDICE 1: DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA DI RILIEVO E CONTEGGIO DI LISTERIA MONOCYTOGENES E DI ALTRE SPECIE LISTERIA APPENDICE 2 COFRONTRA FRA MEDODO F19 ED ISO PARTE 1 E BIBLIOGRAFIA Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 3 di17

4 PROCEDURA DI MODIFICA Documento di riferimento controllato Titolo del documento controllato F 19 Ricerca e conteggio di Listeria monocytogenes e di altre specie Listeria Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la standards@hpa.org.uk. Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio. Modifica Numero/ Dat a 6/ Emissione no. Scartata Inserita Emissione no. Pagina Sessione(i) interessate Conoscenza di base 8 Terreni di coltura Modifica La proposta relativa al volume per il conteggio è stata allargata per comprendere 0.5 ml per piastra da 90mm. Terreno cromogenico CLA sostituito con agar Listeria cromogenico con codicillo che specifica la possibilità di utilizzo di altri terreni cromogenici se dimostrati equivalenti. Aggiunto agar oxford come seconda piastra di agar selettivo per il metodo di ricerca. 10 Sezione Riferimento all uso della luce UV è stato trasferito nella nota informativa spiegando che può essere utilizzato. Citazione del riferimento ISO rimosso per chiarezza. Appendice 2 Inserito confronto fra i metodi della HPA ed ISO. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 4 di17

5 RICERCA E CONTEGGIO DI LISTERIA MONOCYTOGENES E DI ALTRE SPECIE LISTERIA INTRODUZIONE Scopo Il presente metodo descrive la ricerca e il conteggio di Listeria monocytogenes e di altre specie Listeria ed è applicabile a tutte le matrici alimentari, compresi i prodotti lattiero-caseari ed i tamponi ambientali. In generale, il limite inferiore di conteggio di questo metodo è di 1 ufc per millilitro di campione di prodotto liquido, o 10 ufc per grammo di campione per gli altri prodotti. Conoscenza di base La legislazione Europea che prescrive i principi di sicurezza alimentare riguardanti L. monocytogenes 2 è divenuta operativa in Inghilterra l Queste direttive prevedono l assenza del microrganismo in 25 g di campione o livelli inferiori a 100 unità formanti colonia (ufc) per grammo durante tutto il periodo di conservazione degli alimenti pronti all uso. Concentrazioni di L. monocytogenes superiori alle condizioni di sicurezza alimentare devono essere considerate legalmente insoddisfacenti. Da parte dei produttori di alimenti pronti all uso, con possibile rischio per la salute pubblica di L. monocytogenes, esiste inoltre, per la ricerca di questo microrganismo, l esigenza di inserire nei loro programmi di campionamento i controlli prelevati dalle aree di produzione alimentare e dalle attrezzature 2. Le vigenti linee guida della PHLS/HPA per la maggior parte degli alimenti pronti all uso 4 contengono principi di indirizzo per tutte le specie Listeria. Il riscontro di specie Listeria diverse dalla L. monocytogenes suggerisce la probabile presenza di L. monocytogenes in altre parti del lotto alimentare o nell ambiente. I campioni che contengono più di 100 ufc/g di altre specie Listeria sono considerati insoddisfacenti e la loro presenza a concentrazioni maggiori richiede accertamenti. La verifica del livello di contaminazione in questi prodotti alimentari è eseguita con il conteggio diretto su terreni selettivi solidi. In alcuni alimenti pronti all uso, quali formaggi molli stagionati, paté e confezioni sottovuoto o in atmosfera modificata di carni cotte a lunga conservazione, la presenza di Listeria è dovuta principalmente alla capacità del microrganismo di moltiplicarsi durante la conservazione refrigerata ove raggiunge concentrazioni significative. Per questi alimenti è richiesta una ulteriore procedura di arricchimento per determinare la presenza o assenza del microrganismo in una determinata quantità di alimento. Il metodo descritto si avvale della BS EN ISO parti 1 e 2 5, 6. Per la ricerca ed il conteggio di L. monocytogenes a livello internazionale sono riconosciuti metodi equivalenti. Si utilizza un terreno di isolamento cromogenico che per azione della -glucosidasi presente in questi batteri consente lo sviluppo delle specie Listeria con formazione di colonie blu-verdi. La successiva differenziazione fra le specie è ottenuta con la prova del fosfatidilinositolo o lecitina 7-9 ; con loro idrolisi enzimatica prodotta dalla fosfolipasi di L. monocytogenes e L. ivanovii e formazione di alone opaco attorno alla colonia; nessun altra specie Listeria produce un alone opaco attorno alla colonia. Questo Metodo differisce dalle vigenti ISO e (che comprendo l Emendamento No. 1:2004) per un certo numero di dettagli di minor importanza. Entrambi i metodi ISO sono comunque in revisione. Le differenze significative fra le procedure descritte nella F19 e quelle dei metodi ISO revisionati includono il volume da seminare per il conteggio sull agar che nella F19 è di 0.5 ml per piastre da 90 mm invece di 0.1 ml (o di 1 ml su tre piastre da 140 mm) e F19 descrive pure l uso del sistema API per identificazione, che non è compreso nello standard corrente, ma è inserito nella bozza della ISO L elenco più dettagliato delle differenze è disponibile nell Appendice 2. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 5 di17

6 1 PRINCIPIO Negli alimenti o tamponi che richiedono prove per presenza/assenza o quando può essere significativo un numero ridotto di microrganismi, la ricerca di L. monocytogenes e di altre specie di Listeria richiede l arricchimento primario a 30 C per 24 ore in brodo selettivo contenete metà della concentrazione di acido nalidixico e acriflavina. A questo segue un arricchimento secondario nello stesso brodo selettivo contenente gli agenti selettivi a concentrazione intera ed incubazione a 37 C per 48 ore. Eseguire isolamenti su due agar selettivi da entrambi i brodi di arricchimento. Questi agar selettivi sono esaminati per verificare la presenza di tipiche colonie e l identificazione delle specie tramite le caratteristiche morfologiche e le prove biochimiche. Con questo metodo il conteggio di L. monocytogenes e delle altre specie di Listeria è ottenuto seminando sulla superficie di un terreno selettivo un volume definito del campione alla diluizione 10-1 e di altre appropriate diluizioni decimali. Le piastre cromogeniche di agar Listeria sono incubate a 37 C per 48 ore. Il calcolo del numero di ufc per grammo o ml di campione di L. monocytogenes e di altre specie di Listeria è ottenuto dal numero di colonie tipiche cresciute sul terreno selettivo, confermato in seguito dalle caratteristiche morfologiche e dalle prove biochimiche. 2 DEFINIZIONI Nel contesto di questo metodo si applicano le seguenti definizioni: Specie Listeria Microrganismo che sviluppa tipiche colonie sui terreni selettivi solidi, e che presenta le caratteristiche morfologiche e biochimiche descritte in questo metodo. Listeria monocytogenes Microrganismo conforme alla precedente definizione di specie Listeria, presenta di solito -emolisi su agar sangue di cavallo e produce acido dal ramnosio, ma non dallo xilosio, presenta reazione negativa alla prova DL-alanina -naftilamide (DIM) dopo aggiunta del reagente ZIM B usando la confezione API Listeria. Ricerca di L. monocytogenes e di altre specie di Listeria Determinazione della presenza o assenza di questi microrganismi in un determinato peso o volume di alimento o di prodotto lattiero caseario, o in campione ambientale. Conteggio di L. monocytogenes e di altre specie di Listeria Determinazione del numero di questi microrganismi per grammo o ml di alimento o prodotto lattiero-caseario. 3 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA Applicare le normali precauzioni del laboratorio di microbiologia. Le lavoratrici in gravidanza o presunte tali, devono essere esentate dalla manipolazione di colture note di Listeria monocytogenes. Lo ZIM B è tossico e può indurre infertilità e causare danneggiamento nei bambini non nati L infezione causata in gravidanza dalla Listeria è rara ma può determinare complicanze in funzione del trimestre di acquisizione dell infezione, compresi aborto ed infezione neonatale. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 6 di17

7 4 ATTREZZATURA Normale attrezzatura di laboratorio ed aggiungere: Bilancia con sensibilità di 0.1 g Stomacher Diluitore gravimetrico (opzionale) Miscelatore Vortex Piastratore a spirale (opzionale) Termostati a 30 C 1 C, 37 C 1 C Contatore colonie (opzionale) Microscopio a luce normale: obiettivo 40x Buste per Stomacher (sterili) Pipettatori automatici e relativi puntali sterili in grado di erogare 0,1 ml, 1 ml e 10mL (opzionale) Pipette (sterili con rilascio totale) 10mL e 1mL graduate in volumi di 0.1 ml (opzionale) Spatole (sterili) Lampada UV (lunghezza d onda 365 nm) 5 TERRENI DI COLTURA Si possono utilizzare terreni commerciali disidratati equivalenti; seguire le indicazioni del produttore. Diluente peptone salino (DPS - diluente di maggior isolamento) Peptone Cloruro di sodio Acqua ph a 25 C Acqua peptonata tamponata (APT, opzionale) Peptone Cloruro di sodio Sodio fosfato monoacido Potassio fosfato biacido Acqua ph a 25 C 1.0 g 8.5 g 1 L 10.0 g 5.0 g 3.5 g 1.5 g 1 L Diluente citrato di sodio (opzionale) tri-sodio citrato biidrato (Na 3 C 6 H 5 O 7.2H 2 O) Acqua ph a 25 C 20.0 g 1 L Diluente di-potassio fosfato monoacido (opzionale) di-potassio fosfato monoacido (K 2 HPO 4 ) Acqua ph a 25 C o a 25 C 20.0 g 1 L Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 7 di17

8 Brodo di Fraser e Fraser a mezza concentrazione Fraser Fraser a mezza concentrazione Peptone della proteosi 5.0 g 5.0 g Triptone 5.0 g 5.0 g Estratto di carne 5.0 g 5.0 g Estratto di lievito 5.0 g 5.0 g Cloruro di sodio 20.0 g 20.0 g di- Sodio fosfato monoacido 12.0 g 12.0 g Potassio fosfato biacido 1.35 g 1.35 g Esculina 1,0 g 1,0 g Cloruro di litio 3.0 g 3.0 g Ammonio citrato ferrico 0.5 g 0.5 g Acido nalidixico 10 mg 20 mg Idrocloruro di acriflavina 12,5 mg 25 mg Acqua 1 L 1 L ph a 25 C Agar sangue di cavallo Agar Columbia con 5% sangue di cavallo. Agar Listeria Cromogenici (quali: OCLA, ALOA,) 7-9 (Formulazione ISO) Nota: per l isolamento di Listeria possono essere usati altri terreni cromogenici, purché sia dimostrata equivalenza, ed una completa validazione con la ISO se la formulazione usata differisce da quella dichiarata dalla ISO ALOA OCLA Digerito di tessuti animali 18.0 g 18.0 g Digerito enzimatico di caseina 6.0 g 6.0 g Estratto di lievito 10.0 g 10.0 g Piruvato di sodio 2.0 g 2.0 g Glucosio 2.0 g 2.0 g Glicerofosfato di magnesio 1.0 g 1.0 g Solfato di magnesio (anidro) 0.5 g 0.5 g Cloruro di sodio 5.0 g 5.0 g Cloruro di litio 10.0 g 10.0 g di-sodio fosfato monoacido 2.5 g 2.5 g (anidro) Lecitina di soia (contenente almeno 30% di fosfatidilinositolo) 2.0g L- -Fosfatidilinositolo 2.0 g Bromo-4-cloro-3-indolil--Dglucopiranoside 0.05 g 0.05g Cicloexemide 0.05 g o Amfotericina B 0.01 g 0.01 g Sale sodico di acido nalidixico 0.02 g 0.02 g Ceftazimide 0.02 g 0.02 g Solfato di Polmixina B UI UI Agar g g Acqua 1 L 1 L ph a 25 C Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 8 di17

9 Agar selettivo Listeria (Agar oxford) 13 Base Columbia agar sangue Esculina Ammonio citrato ferrico Cloruro di litio Cicloexemide o Amfotericina B Solfato di colistina Acriflavina Cefotetan Fosfomicina Acqua ph a 25 C 39.0 g 1.0 g 0.5 g 15.0 g 0.4 g 0.01 g 20.0 mg 5.0 mg 2.0 mg 10.0 mg 1 L Reagenti per colorazione Gram (opzionale) Confezione commerciale per prove biochimiche API Listeria e reagente ZYM B (consultare la sezione 3 per importante nota sulla sicurezza) 6 PROCEDIMENTO SUL CAMPIONE 6.1 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER RICERCA PREPARAZIONE DEL CAMPIONE E PRE-ARRICCHIMENTO L arricchimento è necessario per definire la presenza/assenza in campioni di 25g, tamponi ambientali e prodotti quali paté e quelli confezionati sotto vuoto o in atmosfera modificata con data di scadenza prolungata ed alimenti confezionati per bambini di età inferiore a 12 mesi. Pesare 25 g di campione rappresentativo in una busta sterile per stomacher usando strumenti sterili ed operando in modo asettico. Omogeneizzare con stomaker in un volume o peso di brodo Fraser a mezza concentrazione di nove volte superiore. Registrare il peso del campione ed il peso o il volume del brodo di Fraser utilizzato a mezza concentrazione. Se la quantità del campione disponibile è inferiore a 25 g o ml mantenere il rapporto campione:diluente a 1:9 (1 in 10). Per tamponi ambientali, verificare che il tampone sia completamente immerso nel brodo di Fraser a mezza concentrazione; ottenere una diluizione di circa 1:10. Passare su Vortex o in Stomaker per portare i microrganismi in sospensione. Trasferire l omogeneizzato o la sospensione del tampone in un contenitore dotato di chiusura (come un sacchetto o contenitore con tappo a vite) INCUBAZIONE ED ARRICCHIMENTO Inserire il brodo di arricchimento primario (Fraser a mezza concentrazione) in termostato a 30 1 C per 24 2 ore. Eseguire sottocolture con 0.1 ml del brodo incubato di Fraser a mezza concentrazione in 10 ml di brodo di Fraser ed inserire in termostato a 37 C 1 C per 48 2 ore SOTTOCOLTURE IN AGAR SELETTIVI Dopo 24 2 ore eseguire dal brodo di arricchimento primario (Fraser a mezza concentrazione) sottocolture negli agar Listeria cromogenico ed agar oxford. Eseguire sottocolture dal brodo di arricchimento secondario (Fraser) dopo 48 2 ore su agar Listeria cromogenico ed in agar oxford. Incubare entrambi i tipi di piastre seminate in aerobiosi a 37 C 1 C. Esaminare le piastre per la presenza di colonie tipiche, come descritto nella sezione 6.3, dopo incubazione di 24 3 ore e dopo altre 24 3 ore se necessario. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 9 di17

10 6.2 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER IL CONTEGGIO Seguendo le procedure descritte nel Metodo Standard F 2 (alimenti) o D 1 (prodotti lattiero-caseari), preparare un omogeneizzato in diluente peptone salino (DPS) alla diluizione 10-1 o in acqua peptonata tamponata (APT) od altri diluenti idonei (consultare D 1). Se necessario, preparare una diluizione a 10-3 in DPS. Se la ricerca è limitata alla Listeria, preparare un omogeneizzato a 10-1 in brodo Fraser non arricchito ed in Fraser arricchito a mezza concentrazione, con supplemento aggiunto dopo la semina delle piastre di conteggio. Seminare 0.5 ml della diluizione 10-1 sulla superficie di ciascuna di due piastre di agar Listeria cromogenico. Diffondere il più presto possibile l inoculo in modo accurato sulla superficie della piastra utilizzando una spatola sterile. Se sono attesi conteggi elevati, seminare anche 50 µl delle diluizioni 10-1 e 10-3 con piastratore a spirale su piastre di agar Listeria cromogenico. Per consentire l assorbimento dell inoculo nell agar lasciare le piastre sul banco di lavoro per circa 15 minuti. Capovolgerle ed inserirle nel termostato a 37 C 1 C per 24 3 ore e, se necessario, per altre 24 3 ore. 6.3 RICONOSCIMENTO E CONTEGGIO DELLE COLONIE RICONOSCIMENTO Esaminare le piastre dopo 24 3 ore per la ricerca delle colonie tipiche delle specie Listeria. e, se necessario dopo altre 24 3 ore. In corso di ricerche epidemiche l incubazione delle piastre può essere protratta a 96 ore se non si manifesta crescita o non compaiono colone tipiche dopo 48 ore 15. Agar Listeria cromogenico Le colonie di Listreria appaiono di colore blu o blu-verde. Dopo 24 ore le tipiche colonie di L. monocytogenes sono circondate da un alone opaco che può apparire di debole intensità o a lento sviluppo se il microrganismo è stressato, in modo particolare da un ambiente acido. Anche i ceppi di L. ivanovii sviluppano un alone opaco, ma entro 48 ore. Le altre specie di Listeria non producono alone. Anche altre specie di batteri possono sviluppare colonie di colore blu, quali: Bacillus, Carnobacterium, stafilococchi, e streptococchi. Agar Oxord Dopo 24 ore le colonie di Listeria appaiono piccole, diametro di 1 mm, grigiastre circondate da un alone nero (esculina positiva). Dopo 48 ore divengono scure, talvolta con lucentezza verdastra, sono di 2 mm di diametro con alone nero e centro incavato CONTA DELLE COLONIE CON METODO DI CONTEGGIO Per il conteggio utilizzare piastre con più di 150 colonie (se disponibile). Se sulla piastra sono presenti più di un tipo di colonie eseguire un conteggio differenziato. Se dopo 24 ore sono presenti colonie con alone eseguire il loro il conteggio perché nel periodo d incubazione successivo gli aloni possono incrementare di dimensione e rendere difficile la loro determinazione. 6.4 PROVE DI CONFERMA SELEZIONE DELLE COLONIE PER CONFERMA Eseguire la sottocoltura dalla piastra di agar Listeria cromogenico su agar sangue di cavallo di non più di cinque colonie sospette per ciascun tipo morfologico di Listeria (o tutte quelle che se sono presenti in numero inferiore a cinque) ed eseguire le prove di conferma come di seguito specificato. Se nessuna di queste è confermata come L. monocytogenes (assenza di colonie tipiche o le prove di conferma identificano specie Listeria diverse da L monocytogenes) eseguire le sottocolture di cinque colonie (o di tutte, se presenti in numero inferiore) da ciascuna delle piastre di sottocoltura ottenute dai brodi di arricchimento primario e secondario. Esaminare attentamente le differenti morfologie che si sviluppano, se presenti, eseguire sottocolture almeno di ciascun tipo rappresentativo. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 10 di17

11 Se nessuna di queste colonie è confermata come L monocytogenes ma alcune o tutte sono confermate come specie Listeria può essere calcolato il conteggio (Sezione 7). Se la presenza di L. monocytogenes è stata già confermata col conteggio, non è richiesto alcun altro accertamento sulle sottocolture delle piastra seminate con il brodo di arricchimento, tranne che in corso di indagine epidemiologica in cui si ricerca uno specifico ceppo CONFERMA Seminare dapprima ogni colonia sospetta di Listeria su agar sangue di cavallo con una sola infissione (per facilitare il rilievo dell emolisi) e lo sviluppo di colonie separate, poi con strisci separati per verificarne la purezza ed ottenere colonie isolate. Incubare a 37 C per 24 3 ore e verificare purezza, aspetto morfologico e presenza di -emolisi. Registrare la tipologia dell emolisi. La maggior parte di ceppi di L monocytogenes sono emolitiche. Ceppi L. ivanovii sono intensamente emolitiche e L. seeligeri sono debolmente emolitiche Le altre specie, inclusa L. innocua, non sono emolitiche 16,17. Nota informativa: Alcuni ceppi di L monocytogenes raramente non sviluppano emolisi su agar sangue di cavallo e, se riscontrati, devono essere inviati al laboratorio di riferimento con allegati i risultati del sistema di identificazione API. Per la conferma selezionare colture pure delle colonie a morfologia diversa. Se richiesto, verificare il tipo di isolato con la colorazione Gram. Le specie Listeria sono Gram positive, pleiomorfe, a forma di bastoncino sottile, non sporigene e non pigmentate sugli agar sangue di cavallo. Per ciascun tipo morfologico eseguire le prove biochimiche con sistema di identificazione API Listeria seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere il reagente ZYM B. Listeria monocytogenes presenta reazione negativa alla prova DIM mentre le altre specie sono positive 17. Nota informativa: Il reagente ZYM B è sensibile alla luce e si deteriora rapidamente, fornendo reazioni falsamente positive. Conservare in condizioni di refrigerazione, proteggere dalla luce ed abbreviare il più possibile il tempo di permanenza del reagente a temperatura ambiente. Non superare la data di scadenza raccomandata dal produttore. Alcuni laboratori hanno osservato che l esame del DIM sotto luce UV (lunghezza d onda 365 nm) prima dell aggiunta del reagente ZIM B facilita la differenziazione fra i ceppi di L. monocytogenes e le altre specie Listeria. I ceppi di L. monocytogenes non emettono fluorescenza, mentre le altre specie Listeria manifestano fluorescenza blu/violetta conseguente alla liberazione di gruppi naftilici (consultare sezione 3 per informazioni riguardanti la sicurezza nell uso del reagente ZYM B), Prendere le opportune precauzioni durante l uso della luce UV. I profili API possono essere accettabili, buoni od eccellenti con percentuali d identificazione 90% ed indice T Registrare l identificazione dell isolato. Registrare anche il profilo API, la percentuale di identificazione e l indice T MICRORGANISMI DEL CONTROLLO DI QUALITA Le procedure del controllo di qualità interno devono essere eseguite secondo le indicazione del protocollo locale usando i seguenti ceppi di controllo. Controllo positivo Controllo positivo Listeria monocytogenes NCTC Listeria innocua NCTC controllo per agar Listeria cromogenico Controllo negativo Enterococcus faecalis NCTC 775 Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 11 di17

12 7 CALCOLO DEI RISULTATI Se è stato eseguito il conteggio, calcolare il numero delle colonie, quando possibile, utilizzando le diluizioni con crescite non superiori a150 colonie. Calcolare il numero di specie Listeria o di L. monocytogenes per grammo nel modo seguente: Conteggio per g = Numero di colonie confermate x Numero colonie saggiato Numero colonie conteggiato Volume saggiato x diluizione 8 REFERTAZIONE DEI RISULTATI Refertare tutti i microrganismi Listeria, includendo L. monocytogenes come specie Listeria. Se è stata isolata L. monocytogenes, refertare separatamente quest ultima. Se le specie Listeria non sono state isolate con l arricchimento, refertare come: Specie Listeria non rilevate in 25 g o nel tampone Se le specie Listeria non sono state isolate con il conteggio, ma lo sono con la procedura di arricchimento, refertare: Specie Listeria rilevate in 25 g (meno di 10/g) Refertare anche l identificazione della specie. Se non è stata riscontrata L. monocytogenes, refertare questa separatamente come descritto in precedenza. Se sono confermate alcune colonie come Listeria monocytogenes, refertare come: Listeria monocytogenes rilevata in 25g (meno di 10/g) Se le specie Listeria, compresa L. monocytogenes, sono state rilevate con il conteggio, refertare il numero totale come specie Listeria come conta per grammo o ml. Refertare separatamente anche il conteggio di L. monocytogenes per g o ml. Se il numero del microrganismi ricercato è compreso fra 10 e 99 per grammo, refertare nel modo seguente: a ufc/g ove a è un numero compreso fra 10 e 99 Se i microrganismi ricercati sono rilevati a conteggi superiori od uguali a 100 per grammo, refertare con una cifra precedente ed una successiva al punto decimale espresso dalla potenza di 10 secondo la formula; a x 10 b ufc/g ove a non è mai inferiore a 1.0 o superiore a 9.9 e b rappresenta l appropriata potenza di dieci. Arrotondare i conteggi al numero superiore se l ultima cifra è 5 o maggiore ed a quello inferiore se l ultima cifra è 4 od inferiore: esempio: 1920 ufc/g è refertato come 1.9 x 10 3 ufc/g /g è refertato come 2.4 x 10 5 ufc/g Deve essere riportato il peso reale dell alimento esaminato, per esempio 10 g, 25 g, 100 g. Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 12 di17

13 9 STRUTTURE DI RIFERIMENTO Tutti gli isolati di L. monocytogenes (emolitici e non emolitici), indipendentemente dalla loro concentrazione, devono essere inviati per la conferma a la caratterizzazione successiva al Food Safety Reference Unit, Laboratory, of Gastrointestinal Pathogens, HPA Centre for Infections. Accedere al collegamento riportato per ottenere un modulo di richiesta per l invio alle strutture di riferimento Centro per le Infezioni: tel: o RINGRAZIAMENTI ED CONTATTI Questi Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati e controllati dal Food and Dairy Working Group for National Standard Methods ( group.asp). Si ringraziano per il contributo le numerose persone appartenenti a laboratori per Alimenti, Acqua, Ambiente, i laboratori di riferimento e le organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti nel corso della preparazione di questo documento, ed infine il Redattore Medico. I Metodi Nazionali Standard sono emessi dalla Standards Unit, Department for Evaluations, Standards and Training, Centre for Infections, Health Protection Agency London. Per ulteriori informazioni contattateci a: Standards Unit Evaluations and Standards Laboratory Centre for Infections Health Protection Agency Colindale, London NW9 5EQ standards@hpa.org.uk Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 13 di17

14 APPENDICE 1: DIAGRAMMA DI FLUSSO PER PROCEDURA DI RICERCA E CONTEGGIO DI LISTERIA MONOCYTOGENES E DI ALTRE SPECIE LISTERIA Ricerca Arricchimento primario Alimenti e prodotti lattiero caseari Pesare o misurare 25 g o ml di campione ed aggiungere 225 ml di brodo di Fraser a mezza concentrazione Tamponi ambientali Immergere in brodo di Fraser a mezza concentrazione (rapporto circa 1:9) Omogeneizzare con stomacher o passare su vortex Incubare a 30 C 1 C per 24 2 ore Eseguire sottocolture in agar selettivi e confermare gli isolati come di seguito descritto per l arricchimento secondario Arricchimento secondario Seminare 0.1 ml di brodo incubato di Fraser a mezza concentrazione in 10 ml di brodo di Fraser Incubare a 37 C per 48 ore Eseguire sottocolture in agar selettivi Incubare le piastre di agar Listeria cromogenico e di oxford a 37 C 1 C per 48 ore in condizioni aerobiche Esaminare a 24 3 ore e di nuovo dopo altre 24 3 se necessario Eseguire sottocolture di 5 colonie sospette su agar sangue di cavallo Incubare a 37 C 1 C per 24 3 ore Selezionare per la conferma appropriati tipi morfologici di colonie Identificare come specie Listeria o Listeria monocytogenes con il sistema API di identificazione per Listeria Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 14 di17

15 Conteggio Preparare una diluizione10-1 del campione Omogeneizzare con stomacher (alimento, tamponi) o miscelare su vortex (tamponi) Preparare diluizioni successive in diluente peptone salino Diffondere 0.5 ml della diluizione 10-1 sulla superficie di due piastre di Listeria cromogenico Se è atteso un conteggio elevato, seminare anche 50 µl delle diluizioni10-1 e 10-3 su agar Listeria cromogenico utilizzando un distributore a spirale Incubare le piastre di agar Listeria cromogenico a 37 C 1 C per 48 ore in condizioni aerobiche Esaminare a 24 3 ore e dopo altre 24 3 ore Eseguire sottocoltura di 5 colonie sospette su agar sangue cavallo Incubare a 37 C 1 C per 24 3 ore Identificare utilizzando sistema identificazione API Listeria Calcolare il numero di Listeria spp. (e L. monocytogenes se presente) per grammo o ml Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 15 di17

16 APPENDICE 2: CONFRONTO FRA METODO HPA F 19 ED ISO PARTI 1 E 2 Metodo HPA F19 ISO parti 1 e 2 Definizione Include la definizione di specie Listeria Solo definizione di Listeria monocytogenes Tamponi ambientali Descrive la procedura per i tamponi ambientali Applicabile solo a prodotti preparati per consumo umano o alimenti per animali Volume Indica il volume delle sospensione iniziale da semiasse sull agar per il conteggio nella quantità di 0,5 ml per piastra da 90 mm Indica il volume delle sospensione iniziale da semiasse sull agar per il conteggio nella quantità di 0,1 ml (o 1 ml per tre piastre da 140 mm). Rivitalizzazione dei microrganismi Fase di rivitalizzazione non inclusa Descritta fase di rivitalizzazione Sistema identificazione API Descrive l uso del sistema di identificazione API ISO precisano le fasi d identificazione Laboratorio di Riferimento Tutti gli isolati di L. monocytogenes devono essere inviati per conferma Tutti li isolati possono essere inviati per conferma Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 16 di17

17 BIBLIORAFIA 1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December Commission Regulation (EC) No 2073/2005 of 15 November 2005 (and as amended) on microbiological criteria for foodstuffs. Official Journal of the European Union; p. L The Food Hygiene (England) (No 14) Regulations 2006 Statutory Instrument. England: HMSO; Gilbert RJ, de Louvois J, Donovan T, Little C, Nye K, Ribeiro CD, et al. Guidelines for the microbiological quality of some ready-to-eat foods sampled at the point of sale. PHLS Advisory Committee for Food and Dairy Products. Commun Dis Public Health 2000;3: BS EN ISO 11290: 1997 incorporating Amendment No. 1: Microbiological examination of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 1 (BS 5763, Part ): Detection method. London: British Standards Institution (BSI); BS EN ISO 11290: 1998 incorporating Amendment No. 1: Microbiological examination of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for detection and enumeration of Listeria monocytogenes - Part 2: Enumeration method. London: British Standards Institution (BSI); Greenwood M, Willis C, Doswell P, Allen G, Pathak K. Evaluation of chromogenic media for the detection of Listeria species in food. J Appl Microbiol 2005;99: Willis C, Baalham T, Greenwood M, Presland F. Evaluation of a new chromogenic agar for the detection of Listeria in food. J Appl Microbiol 2006;101: Beumer R, Hazeleger W. Chromogenic media for the detection and/or enumeration of Listeria monocytogenes. Results of trials performed by a working group of the International Organisation for Standardisation - ISO/TC 34/SC9. Archiv fur Lebensmittelhygiene 2007;58: Control of Substances Hazardous to Health Regulations General COSHH. Approved Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; Health Services Advisory Committee. Safety in Health Service Laboratories. Safe working and the prevention of infection in clinical laboratories and similar facilities. 2 nd ed. Suffolk: HSE Books; Advisory Committee on Dangerous Pathogens Infection risks to new and expectant mothers in the workplace: a guide for employers. HSE Books; Curtis G, Mitchell R, King A. A selective differential medium for the isolation of Listeria monocytogenes. Letters in Applied Microbiology 1989;8: National Standard Method QSOP 49 - Safe use of plastic bags for incubation of food samples. London: Health Protection Agency; Leclercq A. Atypical colonial morphology and low recoveries of Listeria monocytogenes strains on Oxford, PALCAM, Rapid'L.mono and ALOA solid media. J Microbiol Methods 2004;57: Roberts D, Greenwood M H, editors. Practical Food Microbiology. 3rd ed. Oxford: Blackwells; McLauchlin J. The identification of Listeria species. Int J Food Microbiol 1997;38:77-81 Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum Pagina 17 di17 Riferimeto no: F 19i3