La maggior percentuale di Listeria spp. Per singola specie di alimento è stata riscontrata nella categoria dei derivati del latte. (Fig.2).

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1 Importanza della ricerca della Listeria monocytogenes nelle produzioni alimentari Alcune esperienze di un laboratorio di controllo ufficiale A.R.P.A.C.: Colacurci B., Tucci C., d Alessio A., Ciampi B., Improta A., Viscardi L., Mazzei G. Dipartimento Provinciale di Napoli D. T. P. di Napoli U. O. Alimenti: Dir. responsabile dr. D.Muselli INTRODUZIONE La Listeria monocytogenes è ampiamente diffusa negli ambienti naturali, nel terreno, nelle fogne, nella vegetazione in decomposizione ed è stata isolata in alcuni animali, nell uomo, nel latte e derivati, in piante ed ortaggi. La trasmissione dall ambiente all uomo avviene attraverso gli alimenti, in quanto la L. monocytogenes è un patogeno enterico, che determina una malattia detta listeriosi, la cui sintomatologia è caratterizzata da vomito, dolori addominali e diarrea. La listeriosi è contratta soprattutto da individui a rischio, quali donne in gravidanza e loro feti, neonati, pazienti debilitati ed immunocompromessi per varie patologie ed infine soggetti esposti a fattori di rischio quali alcolismo, cirrosi, asma e AIDS. Il rischio alimentare è maggiore nei pazienti che assumono costantemente antiacidi, perché i batteri patogeni non vengono eliminati dall acidità dello stomaco. In alcuni casi l infezione è più grave e si manifesta con sepsi e meningite. Il genere Listeria comprende le seguenti specie: L. monocytogenes: può provocare malattia sia nell uomo che negli animali. L. ivanovii: è associata soprattutto a patologie animali. L. innocua, L. seeligeri: raramente associate ad infezioni. L. murrayi, L. welshimeri, L. denitrificans, L. grayi: non sono associate ad infezioni. Nell ambito del controllo ufficiale degli alimenti, l Istituto Superiore di Sanità all inizio del 1988 allertava gli ex Laboratori d Igiene e Profilassi (LIP), a seguito dei numerosi casi di listeriosi verificatisi in Francia, casi dovuti a consumo di formaggio: furono programmati dei piani di monitoraggio sui derivati del latte per la ricerca delle listerie. Le metodologie di ricerca fornite con i ceppi batterici erano quelle in uso negli Stati Uniti, e prevedevano come terreni d arricchimento e d isolamento l Enrichment broth e l agar McBride che necessitava per il riconoscimento delle colonie sospette della lampada di Wood o del microscopio rovesciato. Questi mezzi colturali, tuttavia, risultarono molto poco selettivi, perché probabilmente adatti alla tipologia di alimentazione praticata negli U.S.A., dove vengono consumati cibi sterili o comunque a bassissima contaminazione microbica. 1

2 Il tenore in germi piuttosto elevato in alcuni nostri cibi e specialmente nei formaggi a pasta filata, ha fatto sì che quando abbiamo ricercato L. monocytogenes nei derivati del latte, la crescita contemporanea delle altre specie batteriche ha causato notevoli problemi d isolamento, per cui nonostante la diffusione della Listeria spp., tale monitoraggio effettuato nel laboratorio ufficiale di controllo (ex Laboratorio d Igiene e Profilassi), non diede esito positivo in nessun campione analizzato. I primi risultati positivi si sono avuti solo in seguito, quando la ricerca della Listeria spp. è stata ampliata ad altri alimenti, e sono stati messi a punto nuovi terreni di ricerca ed in particolare quelli all esculina; tale innovazione permise di isolare ed identificare attraverso le conferme effettuate con metodi biochimici miniaturizzati (API), a breve tempo di distanza due casi di L. monocytogenes in un campione di pollo congelato ed in uno di verdura anch essa congelata. L importanza della ricerca della L. monocytogenes nelle preparazioni alimentari è stata recepita anche nella normativa vigente che la inserisce nel D.P.R. 132/95 nelle priorità dei controlli microbiologici e in alcune normative specifiche per latte e suoi derivati, quali la modifica dell O.M. 10/78 (O.M.12/93) ed infine il D.P.R. 54/97. Dal punto di vista scientifico, l importanza della ricerca viene sottolineata anche da alcuni studi (Galdiero E. e altri) che hanno dimostrato che il rinvenimento della L. monocytogenes non ha nessuna relazione con la presenza dei comuni indici di inquinamento fecale (coliformi). Ne consegue che risultano inefficaci i tradizionali sistemi di controllo basati sulla ricerca degli indicatori e degli indici di inquinamento; quindi per scongiurare i rischi da infezione bisogna agire sia ricercando direttamente negli alimenti la L. monocytogenes, che percorrendo la strada dell autocontrollo, pur prevista dalla normativa vigente (D.L. 155/97). In questo lavoro si prendono in considerazione i risultati ottenuti dalla ricerca della Listeria spp. effettuati nell ex Settore Biotossicologico del PMP di Napoli, oggi confluito nel Dipartimento Tecnico ARPAC. Dal 1/1/1996 al 31/12/2001 sono stati analizzati n campioni tra derivati del latte, prodotti di pasticceria e gelati, prodotti di gastronomia e carni. MATERIALI E METODI La ricerca quantitativa di L. monocytogenes viene effettuata secondo i criteri esposti nell O.M. 12/93. La ricerca qualitativa di Listeria spp. viene effettuata su 25 g di campione con: un pre-arricchimento in 225 ml di Half Fraser Broth per h a 32 C, Nel caso di latte e derivati come terreno di arricchimento viene utilizzato solo il Brodo EB o BEB a 32 C per 48 h; un arricchimento successivo in Fraser Broth per h a 37 C si preleva una ansata da entrambi gli arricchimenti e si striscia su terreni solidi selettivi, quali Listeria Selective Agar Base (Oxford) e Listeria Palcam Agar Base a 37 C per 24 h (il Palcam in microaerofilia). Questi terreni risultano molto più selettivi rispetto al McBride, grazie alla presenza di esculina che viene idrolizzata dalla L. monocytogenes, con produzione di un caratteristico alone nero. Il Palcam risulta particolarmente efficace grazie alla presenza di un 2 sistema indicatore (mannitolo e rosso fenolo): la L. monocytogenes non fermenta il mannitolo, a differenza di 2

3 enterococchi e stafilococchi che fermentandolo provocano il viraggio dell indicatore dal rosso al giallo. Le colonie su Oxford Agar si presentano di colore grigio marrone con concavità crateriforme al centro ed alone nero. Le colonie sul Palcam Agar si presentano invece di colore grigio-verdastro con centro nero infossato circondate da un alone nero, in contrasto con il colore rossastro del terreno, hanno diametro di 0,5-2 mm e sono rotonde con margini netti. sulle colonie sospette viene effettuato la prova della Catalasi (positiva) e quella della ossidasi (negativa) e l esame microscopico con colorazione di Gram (corti bacilli Gram+). se le risposte sono positive si procede con prove biochimiche miniaturizzate (API Listeria). per ulteriore conferma di L. monocytogenes si procede con il Test dell emolisi: si prelevano delle colonie tipiche e si seminano per infissione in una piastra di agar sangue, già suddivisa in diverse aree; contemporaneamente si effettua il controllo positivo e negativo, seminando nella stessa maniera L. monocytogenes, L. ivanovii e L.innocua; la piastra viene incubata a 37 C per h. L. monocytogenes mostra una stretta zona di chiarificazione (b-emolisi), L. innocua non mostra b-emolisi, L. ivanovii mostra generalmente una zona di chiarificazione (b-emolisi) ampia e ben evidenziata. RISULTATI E INTERPRETAZIONI Dei campioni analizzati, il 70% è risultato negativo alla ricerca di Listeria spp., mentre il 29,9% ha presentato crescita di L. spp. e solo lo 0,1% è risultato positivo per presenza di L. monocytogenes. Il risultato positivo si è ottenuto analizzando un campione di torta pervenuto come reperto (1997) ed un campione di formaggio fresco a pasta filata (1999). (vedi tabella 1 e fig.1). Tab.1 Risultati analisi Negativi per L. spp L. innocua 308 L. ivanovii 157 L. grayi 287 L. monocytogenes 2 Totale analisi

4 Fig.2- Numero di casi di Listeria spp. suddivisi per categorie di alimenti Numero di casi Vari Latte e derivati Pasticceria e gelati Campioni negativi Campioni positivi 6,2% Fig.1 - Risultati analisi 11,4% 0,1% negativi 12,3% L. innocua L. Ivanovii L. grayi 70,0% L. monocytogenes La maggior percentuale di Listeria spp. Per singola specie di alimento è stata riscontrata nella categoria dei derivati del latte. (Fig.2). 4

5 CONCLUSIONI Da quanto su esposto si rileva l indispensabilità della ricerca della Listeria monocytogenes sia nel controllo pubblico che nell autocontrollo, al fine di contrastare emergenze epidemiologiche; infatti il rinvenimento di una elevata percentuale di L. spp. dimostra che i trattamenti subiti dagli alimenti non scongiurano la possibilità che in essi si instaurino condizioni tali da favorire lo sviluppo anche dei ceppi patogeni, come nel caso di positività nella torta, reperto sospetto perché causa di tossinfezione alimentare (campione pervenuto nel 1997). Inoltre merita una riflessione un caso di rinvenimento di L. monocytogenes avvenuto su un campione di formaggio a pasta filata (prelevato nel 1999); tale rinvenimento non veniva confermato sulla seconda aliquota campionaria (II istanza analitica). Dall esame dei documenti esibiti dalla parte interessata (produttore), risultava che nel caseificio veniva applicato un ottimo piano di autocontrollo. Si evince che una buona applicazione del piano di autocontrollo aziendale è un ulteriore strumento per ridurre i rischi di contaminazione su tutta la filiera produttiva. Infatti se il caseificio non si fosse dotato di un buon piano HACCP, si sarebbe verificata una presenza maggiore di inquinamento del campione, per cui la L. monocytogenes probabilmente sarebbe stata riscontrata in entrambe le aliquote campionarie. In conclusione, gli strumenti più efficaci per la prevenzione dei rischi alimentari sono una corretta applicazione dell autocontrollo e un approccio diverso da quello seguito tradizionalmente nel campo dell igiene alimentare, che prevedeva principalmente la ricerca degli indici d inquinamento ed indicatori di processo, approccio che invece va indirizzato anche alla ricerca di quei patogeni che già da tempo vengono riconosciuti come emergenti cause di tossinfezione alimentare. BIBLIOGRAFIA.Bortolussi R., Schlech W.F., Albritton W.L.(1985): Listeria-In: Manual of clinical microbiology 4th ed. pp American society for Microbiology-Washinton, DC ;.Curtis G.D.W., Mitchell R.G., King A.F., Griffin E.j. (1989) A selective differential medium for the isolation of Listeria monocytogenes Lett.Appl.Microbiol.8:95-99 :.McBride M.E., Girard K.F. (1960): A selective method for the isolation of Listeria monocytogenes from mixed bacterial populations.j.lab.clin.med. 55: ;.Lovett J.,Hitchins A.D. (1989): Listeria isolation. In: Supplement Bacteriological Analytical manual (Second Printing). U.S. Food and Drug Administration.AOAC, Arlington, Virginia..Galdiero E., Mazzacca F.R., Aliberti F.: Igiene Alimentare La Lysteria m. nei derivati del latte a pasta filata, pubblicatosugli atti del 37 Congresso Nazionale: L igiene e la Sanità Pubblica alle soglie del /28 Settembre Elmer W. Koneman ed altri: Testo atlante di Microbiologia diagnostica,ii ed..rapporti ISTISAN 96/35. 5

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