3 2073/2005 A. PAPARELLA,

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1 CRITERI COMUNITARI PER LA DETERMINAZIONE DELLA SHELF-LIFE: LIFE: IL CASO DEGLI ALIMENTI PRONTI Prof. Antonello Paparella Microbiologia degli alimenti

2 La normativa europea in materia di criteri microbiologici dei prodotti alimentari presenta impatto indiretto sulle attività di determinazione della shelf-life life art. 3 Reg. 2073/2005

3 Alimenti pronti prodotti alimentari destinati dal produttore o dal fabbricante al consumo umano diretto, senza che sia necessaria la cottura o altro trattamento per eliminare o ridurre a un livello accettabile i microrganismi presenti art. 2 Reg. 2073/2005

4 CRITERI DI SICUREZZA ALIMENTARE Listeria monocytogenes substrato permissivo substrato non permissivo se il produttore dimostra che il prodotto non supera 100 ufc/g durante la shelf-life se il produttore NON dimostra che il prodotto non supera 100 ufc/g durante la shelf-life Circ. Min : Ass. in 25 g sia in produzione sia durante la shelf-life

5 ALIMENTI NON PERMISSIVI per Listeria monocytogenes automaticamente considerati tali ph 4,4 aw 0,92 ph 5,0 e aw 0,94 conservabilità < 5 giorni normalmente trattati come tali Alim. sottoposti a trattamento listericida, non ricontaminabili (es. pastorizzati post confezionamento) Frutta e ortaggi freschi interi,tranne semi germogliati Pane, biscotti ed analoghi Acqua, bevande alcoliche e non, e analoghi Zucchero, miele, dolciumi, prodotti a base di cacao e cioccolata, e analoghi eventualmente considerati tali Molluschi bivalvi vivi ALTRI, purché vi sia una giustificazione scientifica

6 Offerta crescente di alimenti pronti, estesa negli ultimi anni agli alimenti di origine vegetale Previsioni di consumo pro capite in USA anno 2020

7 Alimenti miracolosi? I consumatori richiedono alimenti miracolosi che siano totalmente naturali, con zero calorie, zero grassi e colesterolo, gusto delizioso, ottime caratteristiche nutrizionali, prezzo contenuto, rispettosi dell ambiente, con un packaging verde e che garantiscano un fisico perfetto, l amore e l immortalità. Carol Brookins, Global Food and Agriculture Summit, 1999

8 IL CASO CANADESE (2008): L. monocytogenes nei prodotti a base di carne 56 CASI DI LISTERIOSI (22 DECESSI) associati al consumo di prodotti a base di carne affettati, provenienti da uno stabilimento di Toronto Azioni tempestive di richiamo del prodotto Curva epidemiologica ridotta a 4 mesi Risarcimento di 27 milioni Dollari canadesi (5mila consumatori in class action)

9 IL CASO CANADESE: curva epidemiologica (Health Canada, 2009) Nominato un consulente esterno per le indagini, che ha consegnato il suo rapporto nel luglio RACCOMANDAZIONI, soprattutto sulla gestione dell allerta. Non sono stati identificati fattori-chiave a livello di processo.

10 LISTERIOSI E DANNO DI IMMAGINE PER L AZIENDA ALIMENTARE: IL CASO CANADESE

11 LINEE-GUIDA COMUNITARIE PER GLI STUDI DI DURABILITA E I CHALLENGE-TEST, IN RIFERIMENTO A LISTERIA MONOCYTOGENES (NOVEMBRE 2008) (DOCUMENTI DG SANCO EFSA AFSSA) indirizzato dalla DG-SANCO (Bruxelles) agli OSA indirizzato dal Laboratorio di Riferimento Comunitario AFSSA ai laboratori di analisi SCARICABILI DA:

12 DOCUMENTI DG SANCO EFSA - AFSSA TRE LIVELLI DI SPERIMENTAZIONE: I FASE: Test di permissività (Challenge Test δ) (inoculo artificiale determinazione carica iniziale e finale) II FASE: Test di valutazione del tasso di crescita (Challenge Test µ max ) (inoculo artificiale-determinazione curva di crescita completa) III FASE: Test di durabilità (in condizioni di alta prevalenza) (inoculo naturale)

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14 CHALLENGE TEST δ : FINALITÀ Valutare la permissività di un alimento verso L. monocytogenes δ> 0,5 log 10 UFC g -1 = PERMISSIVO δ 0,5 log 10 UFC g -1 = NON PERMISSIVO Fornire una prima stima del comportamento di L. monocytogenes dalla produzione al consumo Identificare possibili limiti intermedi, da utilizzare in produzione, in modo da garantire 100 UFC g -1 al consumo Es. se: δ> 0,88 log 10 UFC g -1, il limite di carica a t 0 (produzione) sarà: 2 0,88 = 1,12 log 10 UFC g -1 (13 UFC g -1 )

15 CHALLENGE TEST δ : INDICAZIONI RIPORTATE NELLA GUIDA TECNICA EUROPEA Caratteristiche del prodotto Numero di lotti Scelta dei ceppi Preparazione dell inoculo Numero di unità campionarie per lotto Inoculazione delle unità campionarie Condizioni di conservazione dei campioni inoculati Determinazione delle caratteristiche fisico-chimiche Analisi microbiologiche: metodi di ricerca e conteggio Calcolo del potenziale di crescita

16 CHALLENGE TEST δ : NUMERO MINIMO DI UNITÀ CAMPIONARIE ANALISI t 0 t finale Carica di L. monocytogenes 3 3 Ricerca/conteggio di L. monocytogenes in campioni di controllo (opzionale) 3 3 Caratteristiche fisiche e chimiche 3* 3* Carica dei microrganismi associati 3 3 * 1 unità è sufficiente se il prodotto è omogeneo

17 CHALLENGE TEST δ : CAMPIONI E INOCULO INFORMAZIONI NECESSARIE NUMERO MINIMO DI LOTTI NUMERO MINIMO DI CEPPI PREPARAZIONE DELL INOCULO MODALITÀ DI INOCULAZIONE ecologia microbica, catteristiche fisiche e chimiche, packaging, shelf-life 3 cocktail di 3 ceppi, di cui 1 di riferimento e gli altri 2 isolati dalla stessa matrice o da matrici analoghe 2 passaggi su terreno, il secondo dei quali a temperatura prossima a quella del campione, aggiustamento della carica e del volume inoculato 1. in profondità (campioni omogenei, es. macinati, emulsioni, oppure particolati, es. insalate di frutta); 2. in superficie (per simulare una contaminazione durante il processo, es. prodotti affettati) LIVELLO DI INOCULO circa 50 UFC g -1 (comunque < 100 UFC g -1 )

18 CHALLENGE TEST δ : CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Fase della catena del freddo Dalla produzione fino all arrivo all espositore di vendita Distribuzione al dettaglio: espositore Conservazione domestica Temperatura di incubazione dei campioni Temp. giustificata da informazioni dettagliate Temp. giustificata da informazioni dettagliate Temp. giustificata da informazioni dettagliate Durata oppure, se non 8 C giustificata da conosciuta, informazioni dettagliate oppure, se non conosciuta, oppure, se non conosciuta, 12 C 12 C Durata giustificata da informazioni dettagliate Durata giustificata da informazioni dettagliate Durata della conservazione oppure, se non conosciuta, oppure, se non conosciuta, oppure, se non conosciuta, Shelf-life 21 gg 1/3 della shelf-life totale del prodotto 1/3 della shelf-life totale del prodotto 1/3 della shelf-life totale del prodotto Shelflife > 21 gg 7 gg 1/2 (shelf-life 7 gg) 1/2 (shelf-life 7 gg)

19 CHALLENGE TEST δ : TEMPERATURA DI CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Temperatura giustificata da dettagliate informazioni = 75 percentile delle osservazioni relative alla nazione nella quale è situata la fase della catena del freddo URGE DISPORRE DI DATI UFFICIALI RIGUARDANTI IL TERRITORIO ITALIANO!! Circ. Min

20 CHALLENGE TEST µ max : FINALITÀ Accertare il livello di crescita di L. monocytogenes in uno specifico alimento, ad una determinata temperatura COSTRUZIONE DELL INTERA CURVA DI CRESCITA E STIMA DEI PARAMETRI DI CRESCITA: LATENZA E ACCELERAZIONE (µ max ) DIVERSI POSSIBILI (MICROBIOLOGIA PREDITTIVA) APPROCCI DI MODELLAZIONE

21 Dal disegno sperimentale all accertamento di µ max Disegno sperimentale Generazione dei dati Fitting delle curve Modellazione Previsione

22 CHALLENGE TEST µ max : NUMERO MINIMO DI UNITÀ CAMPIONARIE COME PER IL CHALLENGE TEST δ CAMPIONI E INOCULO INFORMAZIONI NECESSARIE NUMERO MINIMO DI LOTTI NUMERO MINIMO DI CEPPI PREPARAZIONE DELL INOCULO MODALITÀ DI INOCULAZIONE come per il Challenge test δ 3 2 ceppi inoculati singolarmente, scelti tra isolati dalla stessa matrice o da matrici analoghe e 1 ceppo di riferimento (i 2 ceppi a crescita più rapida) 2 passaggi su terreno, a 37 C, aggiustamento della carica e del volume inoculato come per il Challenge test δ LIVELLO DI INOCULO circa 100 UFC g -1

23 CHALLENGE TEST µ max : NUMERO MINIMO DI UNITÀ CAMPIONARIE ANALISI n Determinazione di µ max (curva di crescita) Ricerca di L. monocytogenes prima del Challenge test (t 0 ) e conteggio alla fine (t finale ) Caratteristiche fisiche e chimiche iniziali e finali 3* + 3* Carica dei microrganismi associati 2 o * 1 unità è sufficiente se il prodotto è omogeneo

24 IMPORTANZA DELLA TEMPERATURA DI INCUBAZIONE NELLA VALUTAZIONE DELLA PERMISSIVITÀ PER L. MONOCYTOGENES Alcuni ceppi, incapaci di sviluppare significativamente a temperature vicine a 4 C durante la shelf-life, potrebbero avere probabilità di sviluppo significativamente più elevate a 8 C e soprattutto a 12 C La simulazione di condizioni prolungate di abuso termico a 8 e 12 C nei Paesi incapaci di fornire dati esaustivi sulla catena del freddo potrebbe fornire dati sovrastimati

25 Evoluzione di isolati di L. monocytogenes (origine: industria del salmone) a 6 C in due substrati: BHI (linee continue) e Brodo di salmone (linee tratteggiate) Paparella et al 2004

26 Evoluzione di isolati di L. monocytogenes (origine: industria del salmone) a 9 C in due substrati: BHI (linee continue) e Brodo di salmone (linee tratteggiate) Paparella et al 2004

27 RELAZIONE TRA ABUSO TERMICO A 8 E 12 C E STIMA DEL TASSO DI CRESCITA DI LISTERIA SPP. Una condizione di abuso termico di sole 12 h a 12 C (----) e successivamente di 48 h a 8 C ( - ), rispetto alla conservazione a 3 C ( ), aumenta considerevolmente il tasso di crescita in mais precotto ( ) e mix di mais precotto e germogli di soia ( ), confezionati in film permeabile a O 2 e CO 2 (Thomas e O Beirne, 2000)

28 DIFFERENTE COMPORTAMENTO DEI CEPPI DI L. MONOCYTOGENES NEI CHALLENGE TEST, IN CONDIZIONI DI CRESCITA E DI INATTIVAZIONE Cinetica di crescita di L.m. 217 e L.m. 22/3A, inoculati a livello di 1 UFC g -1 in mortadella affettata, conservata a 4 e 7 C (Nufer et al., 2007) Log MPN/g t 0 t 24 t 48 t 72 Tempo ATCC7646 TE010 Cinetica di inattivazione di L.m. ATCC7646 e L.m. TE010, inoculati a livello di 1,1-1,2 x 10 7 UFC g -1 in alici marinate, conservate a 8 C (Paparella et al., 2001)

29 POTENZA ED ERRORE DEI CHALLENGE TEST PER L. MONOCYTOGENES (Powell, 2009) Secondo Powell, i protocolli proposti, compreso quello AFSSA, non possono consentire stime con errore e potenza compatibile con le finalità di tipo regolamentare Occorrerebbe aumentare notevolmente la dimensione del campione oppure ridurre l incertezza delle misure

30 POTENZIALE IMPATTO DEI DOCUMENTI EUROPEI Anche se la guida tecnica AFSSA non è indirizzata agli OSA, questo documento è già utilizzato da numerosi laboratori pubblici e privati per l accertamento della permissività verso L. monocytogenes e del livello di crescita del microrganismo CONDIZIONI FONDAMENTALI PER LA DEFINIZIONE DELLA DURATA DELLA VITA COMMERCIALE DEGLI ALIMENTI PRONTI

31 IN ASSENZA DI DATI SULLA CATENA DEL FREDDO, RAPPRESENTATIVI DEL 75 PERCENTILE DELLA DISTRIBUZIONE ITALIANA l impatto della guida tecnica sulle attività di definizione della durabilità degli alimenti pronti potrebbe portare GRAVI CONSEGUENZE per i produttori che sarebbero chiamati a FISSARE NUOVE DATE DI SCADENZA, calcolate incubando il prodotto per 1/3 della SL a 8 C e per 2/3 a 12 C, con una prevedibile contrazione della conservabilità stimata ed una minore concorrenzialità dei prodotti

32 CONCLUSIONI DATO MICROBIOLOGICO: uno dei tanti parametri per il calcolo della SL PER GLI ALIMENTI PRONTI : è un elemento fondamentale POSIZIONE EUROPEA: penalizza chi non documenta la catena del freddo POSSIBILE CONSEGUENZA: aumento dei prezzi e scarsa concorrenzialità

33 È IMPORTANTE E STRATEGICO: PROMUOVERE SCAMBIO DI INFORMAZIONI E COORDINAMENTO TRA RICERCATORI, PRODUTTORI, DISTRIBUTORI E AUTORITÀ DI CONTROLLO

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