Norovirus e molluschi bivalve: dati epidemiologici e attività di ricerca

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II FACOLTÀ DI MEDICINA VETERINARIA SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN ISPEZIONE DEGLI ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE Norovirus e molluschi bivalve: dati epidemiologici e attività di ricerca Dott.ssa Iole Ventrone Napoli, 18 Maggio 2013

2 LE MALATTIE TRASMESSE DA ALIMENTI COSTITUISCONO UN DIFFUSISSIMO PROBLEMA PER LA SALUTE PUBBLICA Malattie che si manifestano in seguito all ingestione di alimenti che contengono agenti patogeni Le malattie legate ad alimenti contaminati sono forse il più diffuso problema di salute pubblica nel mondo contemporaneo ed un importante causa di riduzione della produttività. Esiste un elevata sottostima

3 MALATTIE TRASMESSE DA ALIMENTI Sintomi solitamente gastroenterici vomito nausea diarrea bambini Le M.T.A. si manifestano con maggiore gravità nelle popolazioni più sensibili donne gravide immunodepressi anziani

4 Agenti patogeni responsabili di MTA Esistono oggi al mondo più di 250 MTA che si manifestano con differenti sintomi e sono causate da diversi agenti patogeni. Batteri Muffe Virus Parassiti Spesso si vedono (es.: frutta ammuffita) Oppure si vedono gli effetti della loro attività (es.: carni alterate) Sono meno evidenti: siamo consapevoli dei loro effetti quando incorriamo in una infezione

5 Virus trasmessi da alimenti Gli alimenti possono rappresentare una causa di trasmissione all uomo di patogeni di varia natura. II virus, differentemente dai batteri, non si moltiplicano e non producono tossine negli alimenti ma possono essere semplicemente veicolati da questi al momento dell ingestione. Veicolo di patogeni Virus enterici Dati epidemiologici e clinici indicano una crescente importanza dei virus come causa di malattie trasmesse con gli alimenti, il cui numero è ancora sottostimato.

6 Virus enterici: infezione Ingestione di alimenti contaminati I virus inducono focolai di infezione a livello di tessuti dell intestino tenue si replicano a livello della mucosa intestinale vengono eliminati con le cellule infettate nel lume intestinale (passano attraverso il colon con il chimo) eliminati con le feci ( virus/g) Vomito milioni di particelle virali

7 Virus enterici Appartengono a 6-8 famiglie diverse Virus che causano gastroenteriti: Rotavirus, Astrovirus, Adenovirus tipo 40 e 41 e i Calicivirus (NoV e SaV) Virus dell epatite entericamente trasmessa: HAV e HEV Virus che si replicano nell intestino umano, ma che causano malattia dopo essere migrati in altri organi, come il sistema nervoso centrale o il fegato: Enterovirus

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9 Norovirus Sono considerati una delle maggiori cause di gastroenteriti di origine non batterica Solo negli Stati Uniti sono responsabili di 23 milioni di casi di malattia all anno, pari a circa l 85% di tutti i casi di gastroenterite Analoghe percentuali sono state riscontrate in Giappone e Australia dove l impatto dei Norovirus risulta superiore a quello di qualsiasi agente di natura batterica, compresa Salmonella spp.. In Europa sono responsabili del 40% delle gastroenteriti non batteriche di cui il 52% è riconducibile al consumo di molluschi bivalvi

10 Precedentemente conosciuti come Norwalk-like virus, dalla città omonima nell Ohio (USA), dove nel 1968 si ebbe il primo episodio di infezione nell uomo

11 Norwalk virus Norwalk like virus SRSVs SRSVs (Small Round Structured Viruses) Piccoli virus (27-35 nm) Gastroenteritis viruses A = Rotavirus B = Adenovirus C = Norovirus D = Astrovirus Le particelle virali sono riportate allo stesso ingrandimento.

12 Norovirus spp. Famiglia Caliciviridae Lagovirus (Rabbit hemorrhagic disease virus, European brown hare syndrome virus) - Vesivirus (Canine calicivirus, Feline calicivirus, Vesicular exanthema of swine virus) - Sapovirus (Sapporo virus) Filogenesi basata sulla proteina capsidica

13 Norovirus spp.: generalità Privi di involucro esterno Capside icosaedrico con depressioni superficiali a forma di calice Capside formato da 180 molecole (90 dimeri) della proteina virale capsidica VP1 (55 60 kda circa) Proteina capsidica organizzata in 2 domini

14 Genoma Singolo filamento di RNA (ssrna) a polarità positiva ( ~7,5 Kb) Tipico dei virus della famiglia Caliciviridae Genoma contiene 3 aree maggiori (ORFs) ORF 1 (~ 1700 aa) codifica per un precursore poliproteico non strutturale poi convertito dalla viral 3C-like protease (3CL). Tale poliproteina include RdRp (regione altamente conservata usata per la diagnosi di Norovirus) ORF 2 (~ 550 aa) codifica per la proteina maggiore del capside (VP1) ORF 3 codifica per la proteina strutturale minore del capside (VP2) con proprietà attualmente non ancora conosciute.

15 La proteina VP1 forma due domini : P (protundente, P1 e P2) e S (capsidico). Il sub-dominio P2, più esterno, è il più soggetto a mutazioni e quindi responsabile dell elevata variabilità genetica del genere Norovirus P2 contiene i siti recettoriali, quindi riconosce gli antigeni dei gruppi sanguigni e si lega ad essi.

16 Norovirus Si distinguono geneticamente 5 genogruppi (GI, GII, GIII, GIV e GV), che a loro volta sono divisi in diversi clusters o genotipi GI, GII e GIV infettano l uomo il GIII il bovino, il GV è stato isolato dal topo Il GII (il più diffuso tra i genogruppi umani) contiene 19 genotipi

17 Gastroenterite da Norovirus: Cenni clinici Periodo di incubazione : 1-3 giorni La malattia ha decorso acuto ed è considerata essere autolimitante Sintomi: febbre, vomito, diarrea e nausea. Sono più lievi nei bambini, a differenza delle altre gastroenteriti virali. La loro risoluzione si verifica generalmente entro 2-3 giorni. In uno studio epidemiologico condotto in Olanda > 20% delle persone che aveva avuto la malattia riportava sintomi anche dopo due settimane (Rockx, 2002)

18 Norovirus: trasmissione e resistenza Trasmissione principalmente oro-fecale E descritta anche la trasmissione per via aerea, a seguito di formazione di particelle di aerosol a partire da episodi di vomito a getto Oltre 30 milioni di particelle virali espulse con il vomito possono contaminare superfici in una larga area: ci sono evidenze di una sopravvivenza lunga di tali virus sulle superfici contaminate L elevata infettività dei NoV è ulteriormente potenziata dalla resistenza all azione della temperatura e dei comuni disinfettanti, rendendo estremamente difficoltosa la loro eliminazione da superfici e alimenti contaminati

19 Norovirus Infettività Elevata infettività: 10 particelle virali sufficienti a provocare la malattia Inizialmente detta malattia invernale da vomito Attualmente in aumento anche in mesi primaverili ed estivi (Regno Unito)

20 Diffusione dei Norovirus Bassa dose infettiva : consente al virus di diffondersi attraverso aereosol, vomito, contatti interpersonali e contaminazione dell ambiente (livello di reinfezione del 30% o più tra contatti stretti e familiari) La liberazione virale precede l esordio della malattia nel 30% circa delle persone esposte e può continuare a lungo dopo la malattia aumentando il rischio potenziale di una reinfezione Virus resistente ad un ampio spettro di temperature (dal congelamento a 60 C), sopravvive sulle superfici ambientali, nell acqua delle fontane e da bere, e in numerosi cibi mangiati crudi Grande varietà dei norovirus e mancanza di una completa protezione crociata e di una immunità duratura (le reinfezioni possono avvenire per tutta la vita) Genoma che facilmente va incontro a mutazioni che causano cambiamenti antigenici e ricombinazioni, che determinano l evoluzione in nuovi ceppi capaci di infettare soggetti sensibili.

21 Gastroenteriti da NoV ( ) I CDC (Centers for Disease Control and Prevention) americani stimano che siano almeno 23 milioni ogni anno i casi di gastroenteriti acute dovute ad infezione da Norovirus e che, nel complesso, questi agenti siano responsabili del 50% del totale delle gastroenteriti.

22 Gastroenteriti da NoV in UE

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24 The most commonly reported settings for the virus outbreaks were restaurant, café, pub, bar or hotel (39 outbreaks), but also other settings were identified, including specific communities, such as residential institutions, hospitals or home care establishments. Several contributory factors were reported, either alone or in combination, for 59 outbreaks; among the most common were infected food handlers (33 outbreaks) and unprocessed contaminated ingredients (19 outbreaks). Four waterborne outbreaks attributable to calicivirus (including norovirus) were also reported.

25 Gastroenteriti da NoV in UE Regno Unito: il 15,7 % di tutti di infezioni legate al consumo di vegetali e frutta sono dovute alla contaminazione da Norovirus. Danimarca: (estate 2005) sono stati notificati più di 1100 casi di gastroenterite dovuti al consumo di una fornitura di lamponi contaminati con genotipi diversi di norovirus. Svezia: (giugno-agosto 2006) si sono verificati 3 episodi: 15 persone coinvolte dopo consumo in una festa privata di un dolce a base di crema e lamponi. Gli esami effettuati sui campioni di feci hanno evidenziato la presenza di Norovirus 10 persone si sono ammalate con sintomatologia riferibile a Norovirus dopo consumo di un cheesecake con lamponi. La segnalazione tardiva della tossinfezione non ha consentito il prelievo di campioni ma durante le indagini è emerso che i lamponi utilizzati per il cheesecake erano della stessa marca di quelli trovati nell episodio precedente. 12 bambini a seguito del consumo di una bevanda a base di lamponi; 9 persone dopo consumo di un dolce ai lamponi.

26 Gastroenteriti da NoV in UE 2006 Danimarca: 2 epidemie collegate ad ostriche (coinvolte 46 persone in un party), provenienza UK e Francia Italia: 2 epidemie collegate ad ostriche, provenienza Francia,(6 persone USSL12 Veneziana e 12 persone SIAN Trento). Olanda: epidemia collegata ad ostriche, provenienza Francia (3 casi) 2007 Malta: 71 casi accertati, alimento sospetto ostriche (provenienza Francia via Italia); presenza di GGI e GGII 2008 Francia: casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche dalla Spagna Olanda : casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche dalla Francia Norvegia: casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche da U.K. Norvegia: casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche da U.K.

27 Casi di GE da Norovirus in Italia Estate 2003 Villaggio turistico del centro Italia 183 persone coinvolte (169 ospiti e 14 impiegati) Norovirus in acqua di mare e acqua di falda non potabile (docce, piscine e servizi igienici) Dicembre 2005 Ristorante in provincia di Udine 184 soggetti coinvolti Antipasto di pesce contaminato da Norovirus 2007 Provincia di Bari Più di 1000 persone coinvolte Acqua potabile contaminata da Norovirus

28 Norovirus: virus da crociera Novembre 2003 Nave da crociera Aurora (P&O Cruises)

29 Gastroenteriti da NoV e crociere Luglio- Novembre 2002: epidemie a bordo di navi da crociera della stessa compagnia Ottobre 2003: epidemia a bordo di una Gennaio 2005: - epidemia a bordo di una nave da crociera nei Caraibi Motivi nave da crociera nel Mediterraneo - epidemia a bordo di una nave da crociera in Florida I focolai epidemici vengono individuati e denunciati più rapidamente su una nave da crociera che sulla terraferma. La vicinanza degli alloggi potrebbe accrescere le occasioni di contatto di gruppo. L arrivo di altri passeggeri potrebbe causare il contagio dei passeggeri già presenti e dei membri dell equipaggio

30 Alimenti coinvolti Frutta e verdure Molluschi bivalvi ACQUA CONTAMINATA

31 Fonti di contaminazione primaria di Norovirus

32 Molluschi e Norovirus Diffusi su tutti i fondali Animali scavatori sessili Mediante meccanismo di filtrazione si nutrono di piccole particelle alimentari presenti nell acqua o nei sedimenti Metabolismo molto attivo Trattengono nel loro organismo il plancton necessario al nutrimento, ma anche batteri e virus eventualmente presenti nelle acque Molluschi bivalvi alimenti ad alto rischio Mitilo Ostrica Europea Ostrica Americana C litri/giorno Litri/ora 1,

33 Network europeo per la rapida individuazione delle tossinfezioni virali derivate dagli alimenti

34 I.S.S. ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA Laboratorio Nazionale di Riferimento (LNR) scelto nel 2002 dal Ministero della Salute per il controllo delle contaminazioni virali dei molluschi bivalvi Collabora e diffonde le informazioni provenienti dal Laboratorio Comunitario di Riferimento, il "Centre for Environment, Fisheries and Aquaculture Science " (CEFAS) - Weymouth - United Kingdom

35 Reg CE 2073/2005 (1441/2007) sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari Criteri di sicurezza Alimento Microrganismo Piano campionamento (1) n c Limiti (2) Molluschi bivalvi vivi Salmonella 5 0 Assente in 25g E.coli MPN/100 g (1) n= numero di unità che formano il campione c= numero di unità campionarie i cui valori si situano tra m ed M (2) Si applica l ultima edizione della norma Consideranda : (12) Gli indicatori fecali convenzionali non sono affidabili ( ) e non è pratica sicura basarsi sulla rimozione degli indicatori batterici fecali per determinare i tempi di depurazione dei frutti di mare. (23) È opportuno che i criteri per i virus patogeni nei molluschi bivalvi vivi siano fissati quando i metodi d analisi sono stati sufficientemente messi a punto. (27) Si ribadisce la necessità dello sviluppo di metodi di analisi per virus enterici

36 Regolamenti /2004 Classificazione delle aree di produzione/stabulazione dei molluschi bivalvi vivi Classificazione A,B e C basata sul numero di E.coli: - A <230 E.coli/100g; - B < 4600 E.coli/100g (Tolleranza analitica del 10% ) - C <46000 E.coli/100g Molluschi provenienti da area B: devono essere sottoposti a depurazione presso Centri autorizzati (854 e 853/2004 part C) Molluschi provenienti da area C: stabulazione di lunga durata, almeno due mesi (854 e 853/2004 part C)

37 2006 :AUMENTO DEI CASI DA NOROVIRUS IN EUROPA Al programma FBVE partecipano 13 nazioni, 12 hanno risposto al quesito 9 nazioni hanno confermato un aumento della frequenza di focolai/casi rispetto allo stesso periodo del 2004 L Italia non ha comunicato le informazioni prima della pubblicazione dei dati. I soli 4 casi indicati suggeriscono una marcata sottostima della situazione nazionale.

38 Raccomandazione 20/04/2007 La mancanza di un sistema di monitoraggio adatto a registrare tutti i casi di tossinfezioni virali ha spinto il Ministero della salute a emanare nel 2007 una raccomandazione nella quale esorta le Regioni a delegare i laboratori ufficiali per studiare metodiche standardizzate al fine di rendere più efficaci i controlli ufficiali.

39 I.S.S. partecipa all istituzione del gruppo CEN/TC275/WG6/TAG4 Horizontal method for detection of Norovirus and Hepatitis A virus in food by RT-PCR coordinatore dr. David Lee (CEFAS) Necessità di definire metodi di riferimento (standardizzati ed internazionalmente riconosciuti) per NV (GGI e GGII) e HAV: Superfici Frutta e vegetali Acqua Molluschi bivalve

40 Metodi classici Microscopia elettronica Scarsa sensibilità Saggi immunoenzimatici (ELISA) Cross reattività Colture cellulari Virus difficilmente o affatto coltivabili Metodi molecolari METODO DI ELEZIONE

41 Tecniche molecolari Basso numero di virus presenti Natura complessa e non omogenea della matrice alimentare Hanno evidenziato la più alta sensibilità nell individuare i Norovirus

42 Protocollo sperimentale 1. Estrazione e concentrazione del virus dalla matrice alimentare 2. Estrazione e purificazione dell RNA per rimuovere gli inibenti 3. Retrotrascrizione a cdna tramite l enzima trascrittasi inversa 4. Amplificazione con Real Time PCR

43 Estrazione di Boom (NucliSENS MiniMag - biomerieux) Liberazione e stabilizzazione degli acidi nucleici Legame degli acidi nucleici Purificazione degli acidi nucleici, rimozione degli inibitori Recupero degli acidi nucleici in un piccolo volume

44 Real-Time PCR 5 VPG ORF 1 ORF 2 ORF 3 AAA3

45 Real-Time PCR Primers & Probes NOROVIRUS GI QNIF4 (FW): CGC TGG ATG CGN TTC CAT (Costafreda et al. 2006) NV1LCR (REV): CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC (da Silva et al. 2007) NVGG1p (PROBE): TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT (da Silva et al. 2007) NOROVIRUS GII QNIF2 (FW): ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA (Furhman et al. 2005) COG2R (REV): TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA (De Medici et al. 2004) QNIFS (PROBE): AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG (Furhman et al. 2005)

46 Protocollo Real-Time PCR Mix RT-PCR (kit Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One- Step System INVITROGEN) 2x Thermoscript reaction mix Primer 1 (12,5 μm) Primer 2 (22,5 μm) Probe (6,5 μm) ROX (50x) ThermoScript Plus / Platinum Taq Acqua RNA Step description Profilo termico: Temperature and time RT 55 C 1 h Preheating 95 C Amplification Denaturation Annealing- extention 5 min 95 C Number of cycles sec C 1 min 65 C 1 min

47 Estrazione acidi nucleici e PCR Mengovirus : controllo di processo (efficienza della procedura di concentrazione del virus ed estrazione degli acidi nucleici) amplificazione del virus tal quale amplificazione del virus estratto dal campione cdna di Norovirus : controllo interno (efficienza della reazione di PCR) amplificazione di RNA di sintesi amplificazione dell RNA di sintesi insieme al campione

48 RISULTATO

49 RISULTATO Nota del DGSAN del 24/11/2009 L ISS, in qualità di LRN, ha diramato agli IZZSS un metodo quantitativo per la determinazione di Norovirus e HAV in molluschi bivalve mediante Real Time PCR. Il citato metodo è stato sottoposto a validazione interna e risulta dotato dei requisiti di efficacia

50 Disegno sperimentale 1. MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO RT-PCR REAL TIME PER L IDENTIFICAZIONE DI NOROVIRUS IN MOLLUSCHI BIVALVE 2. RICERCA DI NOROVIRUS IN MOLLUSCHI BIVALVE RACCOLTI E COMMERCIALIZZATI NELLA REGIONE CAMPANIA

51 Campionamento 15 allevamenti (7 area A - 8 area B) 117 pools di Mytilus galloprovincialis prelievi al dettaglio Specie analizzate Mytilus galloprovincialis Ensis minor Chamelea gallina 2 Tapes philippinarum 1 Ostrea edulis N-O N-E 1 Glycymeris glycymeris S-O S-E Acquistati presso punti vendita (19 autorizzati e 16 ambulanti abusivi)

52 Materiali e metodi Arrivo dei molluschi in laboratorio Lavaggio per rimuovere fango e detriti dalla superficie esterna delle valve

53 Materiali e metodi Selezione di esemplari per pool Apertura delle valve con lama pulita in condizioni di sterilità Dissezione del tessuto digestivo con bisturi, pinzette e forbicine sterili Sminuzzamento con bisturi sterile

54 Disegno sperimentale Retrotrascrizione Fase di denaturazione Fase di annealing Fase di extension Estrazione e concentrazione dell RNA virale dalla matrice alimentare Retrotrascrizione a cdna Amplificazione con Real Time PCR Lettura dei risultati della Real Time PCR

55 Risultati Allevamenti Allevamenti 1ºcampionamento Luglio 2007 / Maggio 2008 Prelievi: pool delle tre profondità di ciascun filare 2ºcampionamento Settembre 2008 / Giugno ºcampionamento Novembre 2009 / Marzo 2010 Zona A NO NE SO SE C NO NE SO SE C NO NE SO SE C NC NC NC NC NC NC NC NC NC NC Zona B NO NE SO SE C NO NE SO SE C NO NE SO SE C NC NC NC NC NC NC 13 NC + NC + NC NC NC + + Positivi 13 allevamenti campionati (86,6%) in almeno uno dei prelievi

56 Risultati Prelievi al dettaglio Prelievi al dettaglio Positività per NoVs Campioni negativi 27% 35 Mytilus galloprovincialis NoV GII NoV GI + NoV GII Ensis minor 0 0 Campioni positivi 73% 3 Chamelea gallina Tapes philippinarum 2 1 Positività in 33 dei 45 prelievi effettuati presso i punti vendita 1 Ostrea edulis Glycymeris glycymeris 1 1 Tot campioni positivi Il campione di Glycymeris glycymeris sequestrato in un ristorante della provincia di Napoli contaminato da Norovirus appartenenti ad entrambi i genogruppi.

57 Risultati per i punti vendita di Mytilus galloprovincialis Dei n. 35 punti vendita della Regione Campania nei quali sono stati acquistati i campioni di Mytilus galloprovincialis, sono risultati positivi : 10 dei 16 rivenditori ambulanti abusivi che vendevano il prodotto sfuso 17 dei 19 punti vendita regolarmente registrati

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59 Disegno sperimentale 1. MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO RT-PCR REAL TIME PER L IDENTIFICAZIONE DI NOROVIRUS IN MOLLUSCHI BIVALVE 2. RICERCA DI NOROVIRUS IN MOLLUSCHI BIVALVE RACCOLTI E COMMERCIALIZZATI NELLA REGIONE CAMPANIA 3. BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CRASSOSTEA GIGAS

60 3. BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CRASSOSTEA GIGAS IFREMER ( Institut Français de Recherche pour l'exploitation de la Mer ) Centro di Nantes (Francia) Sezione di Virologia (Laboratorio di Microbiologia - MIC) Dicembre Maggio 2010 È stata studiata l attività metabolica di bioaccumulo nelle ostriche dei due più comuni genotipi virali di Norovirus : NoVs GI.1 NoVs GII.3

61 BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CAMPIONI DI CRASSOSTEA GIGAS Gli esemplari di Crassostea gigas provenivano da allevamenti siti lungo le coste della Bretagna. Un grosso lotto di ostriche è stato prelevato e posto in un area lungo le coste della baia di Brest. Le ostriche sono state trasportate in cassette di legno tramite automezzi refrigerati presso i laboratori di ricerca dell IFREMER di Nantes.

62 Stoccaggio dei campioni I campioni sono stati stoccati in camera fredda termostatata all interno di vasche contenenti acqua di mare pulita, entro 24 ore dalla raccolta. Temperature della camera e dell acqua sono state preimpostate a 9 C Lo stoccaggio dei campioni è durata 24 ore per permettere ai molluschi di reidratarsi, rivitalizzarsi e adattarsi alle nuove condizioni ambientali. L acqua di mare, proveniente da cisterne interne dell IFREMER, era pulita e non contaminata da virus.

63 Preparazione dei Norovirus utilizzati negli esperimenti di bioaccumulo Sospensioni virali di Norovirus GI. 1 e Norovirus GII. 3 (10 6 virus / g di feci) Virus estratto da feci diarroiche provenienti da pazienti ospedalizzati I campioni di feci hanno evidenziato la presenza di NoVs GI.1 e NoVs GII.3 Le soluzioni virali preparate per i test di bioaccumulo sono state stoccate in frigo a 4 C

64 No. 8 esperimenti Esperimenti di bioaccumulo Il bioaccumulo dei due singoli genotipi è stato testato in 3 repliche Il bioaccumulo del cocktail contenente i due genotipi è stato testato in 2 repliche Ogni esperimento: durata complessiva di dieci giorni (da 0 a 9) utilizzo di tre vasche (A, B, C), più una quarta vasca contenente i campioni di Crassostea gigas utilizzati come controllo negativo l acqua delle vasche (300 ml per campione) e stata cambiata ogni 24 h con acqua di mare pulita controllo quotidiano dei parametri ambientali prefissati e della vitalità degli esemplari di Crassostea gigas

65 Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9) singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3 Giorno 0 vasca A : 32 campioni e soluzione NoVs vasche B e C : 8 campioni rispettivamente A B C

66 Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9): singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3 Giorno 0 vasca A : 32 campioni e soluzione di NoVs A B C Vasca A : Aggiunta di NoVs ogni 24h Prelievo di 8 campioni per valutare il bioaccumulo i giorni virus/g feci 3 3x10 6 virus/g feci 6 6x10 6 virus/g feci 9 9x10 6 virus/g feci

67 Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9): singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3 Giorno 0 vasche B e C : 8 campioni rispettivamente A B C Vasca B : Aggiunta di una soluzione di NoVs 10 6 virus/g di feci il giorno 8 NoVs il giorno 8 I campioni sono stati analizzati il giorno 9 dopo 24 h dall aggiunta della soluzione virale. Verifica dei parametri di vitalità e attività di filtrazione delle ostriche

68 Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9): singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3 Giorno 0 vasche B e C : 8 campioni rispettivamente. A B C Vasca C : Aggiunta di una soluzione di NoVs 9 x 10 6 virus/g di feci il giorno 8 I campioni sono stati analizzati il giorno 9 dopo 24 h dall aggiunta della soluzione virale Differenze dose-dipendenti dell attività di bioaccumulo di Crassostea gigas.

69 Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9): cocktail di NoVs GI.1 e NoVs GII.3 Giorno 0 vasche A, B e C : 16 campioni rispettivamente Vasca A : Aggiunta ogni 24h di cocktail di NoVs A B C Vasca B : Aggiunta ogni 24h di NoVs GI.1 Vasca C : Aggiunta ogni 24h di NoVs GII.3 Vasca A analisi del bioaccumulo del cocktail virale. Vasche B e C controllo per evidenziare competizione nell attività di bioaccumulo tra i due genotipi virali

70 Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9): cocktail di NoVs GI.1 e NoVs GII.3 Vasche A, B e C : Prelievo di 8 campioni rispettivamente i giorni: A B C virus/g feci dopo 24 h di bioaccumulo 9 9x10 6 virus/g feci dopo 9 gg di bioaccumulo e

71 Estrazione acidi nucleici Dissezione del tessuto digestivo Eluizione degli acidi nucleici 10µL mengo 1,5g tessuto digestivo sminuzzato Eluizione dei virus: glycine ph 9,5 chloroformebutanol cat floc T Purificazione degli acidi nucleici (Minimag Biomérieux ) Concentrazione dei virus: PEG agitation 1h; 4 C Lisi dei virus: (Nuclisens Lysis Buffer, Biomérieux ) 100 µl

72 Protocollo Real-Time PCR Mix RT-PCR (kit Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One- Step System INVITROGEN) 2x Thermoscript reaction mix Primer 1 (12,5 μm) Primer 2 (22,5 μm) Probe (6,5 μm) ROX (50x) ThermoScript Plus / Platinum Taq Acqua RNA Step description Profilo termico: Temperature and time RT 55 C 1 h Preheating 95 C Amplification Denaturation Annealing- extention 5 min 95 C Number of cycles sec C 1 min 65 C 1 min

73 3. BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CRASSOSTEA GIGAS RISULTATI NoVs GI.1 concentrato 10 6 / grammo di feci NoVs GI /g stool 10/03/ /04/ /04/2010 Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C D1 D3 1,8x10 3 9,5x10 3 7,5x10 3 9,1x10 3 8,5x10 3 4,5x10 4 D6 D9 3,5x10 4 4,5x10 4 7,1x10 4 6,5x10 4 4,5x10 3 3,9x10 4 3,5x10 4 5,4x10 4 7,7x10 4 9,5x10 4 1,0x10 4 2,0x10 5 Vasca A : I risultati nei giorni 1, 3, 6 e 9 si discostano di poco nelle tre repliche, variando tra loro di meno di un logaritmo. La concentrazione virale nell arco dei nove giorni ha seguito un trend positivo

74 RISULTATI NoVs GII.3 concentrato 10 6 / grammo di feci NoVs II /g stool 16/02/ /03/ /04/2010 Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C D1 D3 1,3x10 6 1,2x10 4 2,8x10 6 1,3x10 5 5,2x10 4 3,3x10 5 D6 3,2x10 6 1,4x10 5 6,0x10 5 D9 9,6x10 6 1,1x10 6 1,7x10 7 3,4x10 5 2,1x10 5 7,0x10 5 4,9x10 5 6,1x10 4 8,5x10 5 Vasca A : La concentrazione virale nell arco dei nove giorni è costantemente in crescita in tutte e tre le prove Concentrazioni di virus più alte sono state evidenziate nella prima prova (mese di febbraio).

75 RISULTATI NoVs GI.1 concentrato 10 6 / grammo di feci NoVs GI /g feci 10/03/ /04/ /04/2010 Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C D1 D3 D6 D9 1,8x10 3 9,5x10 3 8,5x10 3 7,5x10 3 9,1x10 3 4,5x10 4 3,5x10 4 4,5x10 4 7,1x10 4 6,5x10 4 4,5x10 3 3,9x10 4 3,5x10 4 5,4x10 4 7,7x10 4 9,5x10 4 1,0x10 4 2,0x10 5 Vasca B La capacità di filtrazione permane immodificata fino all ultimo giorno della sperimentazione, le condizioni ambientali erano ottimali, bioaccumulo maggiore di quello osservato nelle ostriche in vasca A il giorno 1. Vasca C Le ostriche hanno bioaccumulato in 24h una quantità di virus pari o di poco superiore a quanto evidenziato nella vasca A

76 RISULTATI NoVs GI.1 (10 6 / grammo di feci) Nelle stesse condizioni di sperimentazione e a parità di concentrazione virale, i campioni di Crassostea gigas tendono a bioaccumulare maggiormente NoVs GII.3. NoVs GII.3 (10 6 / grammo di feci) La differenza tra i risultati di bioaccumulo è infatti di circa un logaritmo.

77 RISULTATI Cocktail (NoVs GI.1 + NoVs GII.3) concentrato 10 6 / grammo di feci NoVs GI.1+GII /g stool 27/04/ /05/2010 Vasca A Vasca A Vasca B Vasca C GI.1 GII.3 GI.1 GII.3 Vasca B Vasca C D1 1,0x10 4 2,5x10 4 8,5x10 3 8,1x10 4 1,1x10 4 9,5x10 4 5,0x10 3 6,4x10 5 D9 2,0x10 5 1,4x10 5 9,5x10 4 4,0x10 5 3,2x10 5 2,7x10 6 6,0x10 5 1,5x10 6 Riconfermata la maggiore capacità di bioaccumulo di NoVs GII. 3 sia se miscelato nel cocktail, sia se aggiunto singolarmente.

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79 CONCLUSIONI Metodica Real Time RT PCR efficace per la ricerca dei Norovirus (Nota MinSan 24/11/2009) Vasta circolazione di Norovirus in molluschi bivalve raccolti e commercializzati nella Regione Campania (57% di positività) Presenza di Norovirus appartenenti ai genogruppo II in tutti i campioni positivi Presenza di Norovirus in allevamenti di area A Più del 50% di positività in campioni provenienti da punti vendita autorizzati I campioni di Crassostea gigas hanno bioaccumulato una quantità di virus costantemente in crescita Il genotipo GII. 3 è il patotipo del genere Norovirus più stabile nel tessuto digestivo dei molluschi filtratori In compresenza di Norovirus GI. 1 e GII. 3, i campioni di Crassostea gigas hanno bioaccumulato entrambi i genotipi virali (non esiste immunità crociata per NoVs)

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