Sviluppo di un metodo LC-MS/MS per la determinazione quantitativa e simultanea di 10 ormoni steroidei in campioni di siero umano

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1 Sviluppo di un metodo LC-MS/MS per la determinazione quantitativa e simultanea di 10 ormoni steroidei in campioni di siero umano Roberto Bozic PerkinElmer Italia S.p.A., Monza RIASSUNTO E stato sviluppato un metodo basato sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) robusto, preciso e specifico per la determinazione quantitativa e simultanea di 10 ormoni steroidei: 11-deossicortisolo, 17α-idrossiprogesterone, aldosterone, androstenedione, corticosterone, cortisolo, deidroepiandrosterone, deidroepiandrosterone solfato, progesterone e testosterone. La misurazione di questo profilo steroideo può essere un valido aiuto nel riconoscimento clinico, la diagnosi e il trattamento delle malattie che colpiscono le ghiandole surrenali, ovaie, testicoli, e placenta. Il metodo è caratterizzato da una preparazione del campione che prevede una precipitazione delle proteine, a partire da 100 μl di siero umano. Tale metodo si avvale di un sistema HPLC e di uno spettrometro di massa tandem dotato di una sorgente a ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI), in modalità sia positiva che negativa, e in acquisizione Multiple Reaction Monitoring (MRM). Per la determinazione quantitativa degli steroidi ci si è avvalsi dell uso di standard interni marcati con isotopi stabili. In questo articolo verranno riportati i risultati di precisione, linearità, sensibilità e recupero del metodo, ottenuti utilizzando siero umano arricchito con gli analiti steroidei. Inoltre saranno anche riportati i risultati, (preliminari e tuttora in corso di definizione), di comparazioni tra questo metodo e vari metodi immunometrici. Il metodo/kit sviluppato permette la misurazione simultanea di 10 steroidi negli intervalli di interesse clinico, sia pediatrico che nell adulto con una buona linearità, sensibilità e precisione. La semplice preparazione del campione rende tale metodo adatto ad un uso di routine nei laboratori clinici. Parole chiave: LC-MS/MS; Spettrometria di massa tandem; Ormoni steroidei; Profilo steroideo ABSTRACT Development of an LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of 10 steroid hormones in human serum samples. A robust, precise and specific multiplexed LC-MS/MS assay was developed for the quantitative determination of 10 steroid hormones in 100 μl of human serum: 11- deoxycortisol, 17α-hydroxy progesterone (17-OHP), aldosterone, androstenedione, corticosterone, cortisol, dehydroepiandrosterone (DHEA), dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS), progesterone and testosterone. Determination of concentration profiles of these analytes may aid in the clinical recognition, diagnosis and treatment of diseases affecting the adrenal glands, ovaries, testes, and placenta. The method involves a simple sample preparation by protein precipitation protocol. All the studies were performed using a HPLC tandem quadrupole mass spectrometer system equipped with an atmospheric pressure chemical ionization (APCI) source, in both positive and negative mode and Multiple Reaction Monitoring (MRM) acquisition. The steroids were quantified by use of peak areas in reference to the stable-isotope-labeled internal standard. Assay performance was tested using human serum enriched with steroids. Assay linearity, sensitivity, precision and recovery will be reported. Moreover, LC-MS/MS steroids measurements were compared with immunoassay (IA), these preliminary data, (still in progress), will also be reported. The method developed allows the simultaneous quantification of 10 steroids over the pediatric and adult range of clinical relevance with good linearity, sensitivity and precision. Short hands-on time for sample preparation makes it suitable for routine clinical practice. Key words: LC-MS/MS;Tandem mass spectrometry; Steroid hormones; Steroid profiling INTRODUZIONE Gli ormoni steroidei sono composti endogeni lipofili che regolano numerosi processi fisiologici critici 1,2. I glucorticoidi, come il cortisolo, sono coinvolti nell equilibrio energetico e nella risposta a condizioni di stress. L aldosterone, un mineralcorticoide, regola l equilibrio elettrolitico e la pressione arteriosa. Il progesterone interviene nella preparazione e nel mantenimento della gravidanza. Gli androgeni, come il testosterone, regolano lo sviluppo riproduttivo maschile e le caratteristiche sessuali secondarie. Il mantenimento di appropriati livelli di steroidi è vitale per il normale sviluppo e la salute. Gli ormoni steroidei sono sintetizzati nella corteccia surrenale, nelle ovaie, nei testicoli o nella placenta. Il precursore biosintetico di tutti gli steroidi è il pregnenolone che è un prodotto metabolico del colesterolo. Numerosi enzimi, come la 21-idrossilasi, l aldosterone sintetasi e l enzima di clivaggio della catena laterale del colesterolo, intervengono nella conversione del colesterolo nei singoli steroidi 3,4 (Fig. 1). Mutazioni genetiche spontanee o ereditarie che coinvolgono la sintesi di questi enzimi sono 52 LigandAssay 15 (4) 2010

2 Figure 1 Biosintesi degli steroidi analizzati dal CHS MSMS Steroids Kit. Star (proteina regolatoria acuta della steroidi genesi); SCC (enzima di clivaggio della catena laterale del colesterolo); 3β (3βidrossisteroide deidrogenasi; 17α (attività della 17α-idrossilasi del CYP17A1); 17,20 (attività della 17,20 liasi del CYP17A1); STS (sulfotransferasi); SULT (sulfatasi); 17β (17β-idrossisteroide deidrogenasi); 21 (21-idrossilasi); 11β (11β-idrossilasi); AS (aldosterone sintetasi); intermedio steroideo responsabili dell alterazione dei normali livelli degli ormoni steroidei. La regolazione della sintesi degli steroidi è tessutospecifica ed è controllata da numerosi fattori solubili. L asse ipotalamico-pituitario-surrenale/gonadico è una via regolatoria cruciale per la regolazione della sintesi degli steroidi 2. L ormone di rilascio della corticotropina (CRH), prodotto nell ipotalamo, stimola la ghiandola pituitaria anteriore a secernere l ormone adrenocorticotropina (ACTH) che a sua volta induce la produzione di glucocorticoidi nella corteccia surrenale. In una via analoga l ormone di rilascio delle gonadotropine secreto dall ipotalamo (GnRH) induce la produzione dell ormone luteinizzante (LH) e dell ormone follicolo stimolante (FSH) da parte della ghiandola pituitaria anteriore e la produzione di progesterone e androgeni da parte delle ovaie e dei testicoli. La sintesi dell aldosterone da parte della corteccia surrenale è regolata sia dai livelli di potassio sia dalla via della renina-angiotensina sotto il controllo delle cellule iuxtaglomerulari renali 5. Il meccanismo di regolazione a feedback negativo dell ipotalamo e della ghiandola pituitaria da parte degli steroidi circolanti è coinvolto nel mantenimento dei loro livelli fisiologici. La perdita o l acquisizione di funzioni da parte dei principali fattori regolatori o dei loro recettori può alterare la normale espressione degli steroidi. Disordini della biosintesi degli steroidi Numerosi enzimi sono coinvolti nella biosintesi degli steroidi e dei loro intermedi. La perdita della funzionalità di alcuni enzimi può causare cambiamenti significativi nel modello di espressione steroideo. Un esempio è l iperplasia surrenale congenita (CAH) causata dalla deficienza dell enzima 21-idrossilasi. Questo enzima catalizza l idrossilazione del 17-idrossiprogesterone (17-OHP) e del progesterone al carbonio 21, necessaria per la sintesi dei glucocorticoidi e dei mineralcorticoidi. Le mutazioni più gravi dell enzima 21-idrossilasi determinano la mancata produzione sia dei mineralcorticoidi che dei glucocorticoidi. L aumento dell ACTH in risposta ai bassi livelli di glucocorticoidi causa l aumento della produzione dei precursori degli steroidi nella corteccia surrenale, portando a livelli elevati di 17-OHP, androstenedione e progesterone. Forme meno gravi mantengono i livelli normali dei mineralcorticoidi, ma comportano ugualmente livelli elevati di 17- OHP, androstenedione e progesterone. È stato dimostrato che la deficienza della corticosterone metilossidasi II (CMO-II) deriva dalla mutazione dell aldosterone sintetasi, l enzima che catalizza i passaggi finali della sintesi dell aldosterone 7. Questa deficienza causa un abbassamento dei livelli di aldosterone, mentre i livelli degli altri steroidi rimangono immutati. Mutazioni nella proteina regolatoria acuta della steroidogenesi (StAR) sono responsabili dell iperplasia surrenalica lipoide congenita, una forma grave della CAH 8. La proteina StAR facilita il trasporto del colesterolo dal citosol alla membrana mitocondriale interna per la conversione in pregnenolone, primo passaggio della steroidogenesi. La deficienza della StAR è coinvolta in due fasi della patologia. Inizialmente, la sintesi di tutti gli steroidi viene ridotta per l incapacità di aumentare il trasporto del colesterolo nei mitocondri in risposta alla normale domanda fisiologica. Successivamente, l accumulo di colesterolo e dei metaboliti del colesterolo nelle vescicole cellulari porta alla patologia cellulare con perdita della sintesi degli steroidi a livello basale. I disturbi degli organi coinvolti nella produzione e nella regolazione degli steroidi può portare a livelli steroidei patologici. Per esempio, la malattia di Cushing, caratterizzata dall eccessiva produzione di cortisolo, può essere causata da una produzione eccessiva di ACTH, generalmente dovuta ad adenomi pituitari 9,10. La malattia di Cushing può essere dovuta anche ad adenomi surrenalici o a carcinomi adrenocorticali che causano una produzione eccessiva di cortisolo indipendentemente dai livelli di ACTH. È stato dimostrato che nei maschi la mancata regolazione ipotalamica-pituitaria-surrenale/gonadica a seguito di lesione cerebrale traumatica porta alla carenza di cortisolo come pure alla carenza di testosterone 11. Nei paesi sviluppati la risposta autoimmune alla corteccia surrenale è la causa principale della malattia di Addison ed è caratterizzata da una minor produzione di cortisolo e aldosterone. Nei paesi in via di sviluppo la malattia è scatenata spesso dall infezione tubercolare 12,13. Considerando che i disturbi del metabolismo steroideo spesso riguardano l alterazione di numerosi steroidi, è utile determinare il profilo steroideo completo piuttosto che i singoli analiti steroidei. Per esempio, è stato dimostrato che nello screening della CAH il profilo steroideo contemporaneo del 17-OHP, dell androstenedione e del cortisolo mediante la HPLC-MSMS riduce in modo significativo la percentuale di falsi positivi e migliora il valore predittivo positivo rispetto alla misurazione del solo 17-OHP mediante saggio immunometrico con traccianti radioattivi,fluorimetrici ed enzimatici 14,15. In un altro esempio, usando il profilo steroideo piuttosto che la misurazione del singolo steroide è stata migliorata l accuratezza diagnostica nella determinazione dell insufficienza surrenalica 16. Il metodo, LigandAssay 15 (4)

3 discusso in questo articolo, permette di dosare simultaneamente 10 ormoni steroidei fondamentali, fornendo un profilo steroideo utile nella diagnosi dei disturbi del metabolismo steroideo. Metodi per il dosaggio di steroidi I principali metodi oggi utilizzati per il dosaggio di ormoni endogeni sono: i metodi immunometrici, la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC/MS) e la cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC- MS/MS). I metodi immunometrici sono ampiamente utilizzati nel dosaggio degli steroidi, in quanto risultano essere rapidi, facili da eseguire e garantiscono una buona sensibilità. Tuttavia, tali metodi risultano poco specifici a causa della cross-reattività, dovuta ad interferenti endogeni steroidei o lipidici ed a causa dell effetto matrice 17, 18. Inoltre, sono stati riportati problemi nel dosaggio immunometrico degli steroidi soprattutto in campioni derivanti da pazienti quali neonati, neonati pretermine, femmine (per il dosaggio del testosterone) e nel caso di dosaggio in matrici diverse quali ad esempio la saliva 19, 20. Limitazioni nel dosaggio immunometrico degli steroidi derivano anche da una scarsa standardizzazione esistente tra i vari metodi commercialmente disponibili; ne deriva che gli intervalli di riferimento risultano metodo-dipendenti e i risultati spesso non sono tra loro comparabili 18, 21. Infine, tali metodi permettono il dosaggio di un singolo analita steroideo per test, non fornendo così un valido strumento diagnostico quale quello derivante dalla determinazione di un profilo steroideo completo 18. Un metodo alternativo all immunometria dotato di buona sensibilità e specificità è la GC-MS 17. Tale metodo però richiede una lunga e laboriosa preparazione del campione dovuta ai passaggi di derivatizzazione. Questo allunga i tempi e rende tale metodo non adatto ad un uso di routine con caratteristiche di elevata produttività 18. Recentemente sono stati ottenuti miglioramenti tecnologici nell analisi clinica degli steroidi grazie all introduzione della LC-MS/MS. Tale tecnica oltre ad una elevata sensibilità è in grado di fornire anche un alta specificità in matrici complesse. Tale specificità va ricercata nel funzionamento di un analizzatore di uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo o spettrometro di massa tandem (Fig. 2). Tale analizzatore è formato da tre quadrupoli (Q1, Q2 o cella di collisione e Q3). Il primo quadrupolo (Q1) è impostato in modo da filtrare tutti gli ioni tranne il precursore (analita). Nel Q2 o cella di collisione, il precursore viene frammentato per generare ioni prodotto caratteristici. Il Q3 filtra tutto tranne lo ione prodotto selezionato (derivante dall analita precursore). In questo modo viene rilevato un segnale solo quando il precursore selezionato genera il Figura 2 Schema del funzionamento di un analizzatore a triplo quadrupolo, Multiple Reaction Monitoring frammento specifico (transizione MRM, Multiple Reaction Monitoring). In contrasto con i metodi immunometrici, che permettono il dosaggio di un singolo steroide, l utilizzo della spettrometria di massa tandem permette di dosare simultaneamente più ormoni steroidei. Il profilo steroideo che ne deriva, fotografa lo stato degli enzimi coinvolti nella biosintesi degli steroidi, fornendo un valido aiuto alla diagnosi dei disordini legati al metabolismo steroideo. L ultima generazione di spettrometri di massa tandem, presenta limiti di quantificazione superiori, ciò permette di evitare i laboriosi passaggi di derivatizzazione, facilitando la fase preanalitica di preparazione del campione. Tale tecnica si mostra quindi adatta ad uso di routine superando i problemi di specificità ed efficienza prima discussi per i metodi immunometrici. Lo scopo del nostro lavoro è stato quello di sviluppare e validare un metodo/kit rapido e sensibile, per la misurazione simultanea di 10 ormoni steroidei mediante LC-MS/MS, in grado di sostituire i metodi immunometrici nell analisi clinica di routine degli steroidi. Considerazioni metodologiche nello sviluppo di un metodo LC-MS/MS per il dosaggio di steroidi Tecniche di ionizzazione. In letteratura18, 22 sono riportati numerosi metodi basati sulla spettrometria di massa tandem per la determinazione di steroidi. Le tre differenti modalità di ionizzazione maggiormente adottate in tali metodi sono: Electrospray ionizzazion (ESI), Atmosferic Pression Chemical Ionization (APCI), Atmospheric Pressure Photoionization (APPI). L ESI è considerata più sensibile rispetto l APCI per composti polari; tuttavia per composti non polari o poco polari (come 8 dei 10 steroidi oggetto di questo lavoro), la sensibilità ottenuta mediante l utilizzo di una sorgente APCI è spesso migliore rispetto quella ottenuta da una sorgente ESI. La sorgente APCI è meno soggetta all effetto matrice rispetto l ESI. Soldin et al. 17 hanno dimostrato che la più recente sorgente APPI risulta essere più sensibile rispetto all ESI e APCI per steroidi quali: DHEA, DHEAS, androstenedione, testosterone, progesterone, cortisolo, 11-deossicortisolo, corticosterone e aldosterone. Nonostante le similitudini strutturali tra i composti steroidei, l efficienza di queste tecniche di ionizzazione soft può essere molto differente. Tale efficienza di ionizzazione deve essere valutata per ogni singolo steroide e può differire usando sorgenti e strumenti differenti Considerata la scarsa diffusione di sorgenti APPI nei laboratori clinici, abbiamo trovato essere l APCI un buon compromesso per l analisi dei 10 steroidi oggetto di questo lavoro (aldosterone, androstenedione, corticosterone, cortisolo, 11-deossicortisolo, DHEA, DHEAS, progesterone, 17α-idrossiprogesterone, testosterone). Derivatizzazione vs non-derivatizzazione. Le concentrazioni fisiologiche per i diversi ormoni steroidei possono talvolta essere molto basse. La derivatizzazione permette di aumentare l efficienza di ionizzazione, portando ad una maggiore sensibilità e specificità nella loro misurazione 27. Questo approccio presenta però gli svantaggi di diminuire la precisione, a causa dell aggiunta di diversi passaggi (derivatizzazione, estrazione) nella preparazione del campione, e anche di compromettere l accuratezza. 54 LigandAssay 15 (4) 2010

4 Materiali Figura 3 Tipi di ionizzazione e polarità dei composti Infatti, la derivatizzazione a ph estremi può portare all idrolisi di eventuali coniugati presenti con conseguente aumento della risposta ottenuta e perdita di accuratezza. Per esempio, l estradiolo coniugato 17, durante la derivatizzazione a ph estremi, viene idrolizzato (fornendo estradiolo) con conseguente aumento della risposta ottenuta, rispetto ad un metodo che non prevede derivatizzazione. Negli ultimi anni i limiti di quantificazione dei moderni spettrometri di massa tandem sono migliorati, permettendo spesso di evitare i laboriosi passaggi di derivatizzazione. Per queste ragioni nel metodo da noi sviluppato per la misurazione degli steroidi abbiamo evitato di ricorrere alla derivatizzazione. Separazione cromatografica. La separazione cromatografica riveste un ruolo importante nello sviluppo di un metodo LC-MS/MS. La colonna analitica deve essere in grado di garantire una sufficiente ritenzione e separazione dei vari steroidi. Infatti, molti frammenti risultano comuni nonostante derivino dalla frammentazione di composti steroidei diversi e una completa selettività non è sempre possibile (es. per composti isobari quali corticosterone e 11- deossicortisolo, oppure DHEA e DHEAS, isobari dopo la frammentazione in sorgente del gruppo solfato di quest ultimo). La selettività dei metodi MS/MS deve essere quindi supportata da una buona separazione cromatografica. Le colonne maggiormente utilizzate per questi analiti steroidei sono a fase inversa C-18 o C-8. Noi abbiamo trovato più conveniente, in termini di riduzione dei tempi di ritenzione, utilizzare una colonna C-8 per separare i 10 steroidi determinabili con il nostro kit. MATERIALI E METODI Campioni Un totale di 100 campioni in siero umano provenienti da pazienti pediatrici di ambo i sessi e da pazienti ginecologiche adulte, sono stati raccolti presso il 3 Laboratorio Analisi degli Spedali Civili di Brescia. Tutti i campioni, in forma anonima, sono stati conservati a -20 C prima dell analisi. Reattivi, calibratori, standard interni marcati con isotopi stabili e controlli di qualità necessari per il dosaggio simultaneo di 10 steroidi sono compresi nel CHS TM MSMS Steroids kit fornito e prodotto da PerkinElmer (Wallac OY, Turku, Finlandia). Gli standard deuterati sono: 2 H 7 -aldosterone, 2 H 5 -androstenedione, 2 H 8 -corticosterone, 2 H 3 - cortisolo, 2 H5-11-deossicortisolo, 2 H8-17α-idrossiprogesterone (sia per 17-OHP che per DHEA), 2 H 6 -deidroepiandrosterone solfato, 2 H 9 -progesterone, 2 H 5 -testosterone; mentre controlli e calibratori, preparati in siero umano trattato per adsorbimento su carbone attivo contengono: aldosterone, androstenedione, corticosterone, cortisolo, 11- desossicortisolo, deidroepiandrosterone (DHEA), deidroepiandrosterone solfato (DHEAS), progesterone, 17αidrossiprogesterone (17-OHP), testosterone. Tutti gli altri reattivi chimici e solventi usati erano di elevata purezza, disponibili da fornitori commerciali e usati senza ulteriori purificazioni. Preparazione del campione I campioni sono stati preparati mediante un protocollo di deproteinizzazione. In una piastra da 96 pozzetti (piastre NUNC comprese nel CHS TM MSMS Steroids kit), a 100 μl di campione (controllo o calibratore) sono stati aggiunti 200 μl di soluzione precipitante di acetonitrile con acido formico 0,1% contenente gli standard interni. Le piastre sono state coperte e agitate a 750 rpm per 15 min. e quindi centrifugate a 4210 RCF per 30 min., ad una temperatura compresa tra +4 C e +30 C. Terminata la centrifugazione, 175 μl di surnatante sono stati trasferiti in un'altra piastra e portati a secco mediante flusso d azoto. Il residuo è stato ricostituito con 125 μl di una soluzione costituita da 65% fase mobile A e 35% fase mobile B (v/v). La piastra è stata coperta, agitata a 750 rpm, per min. e infine caricata sull autocampionatore (termostatato ad una temperatura da +4 C a +25 C) per l analisi LC- MS/MS. Metodo LC-MS/MS Il sistema LC-MS/MS utilizzato era costituito da uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo API 5000 (ABSciex, Toronto, Canada) equipaggiato con una sorgente APCI. La sorgente è stata usata in modalità di ionizzazione negativa per l aldosterone e positiva per tutti gli altri 9 steroidi, e mantenuta ad una temperatura di 450 C. Gli altri parametri di sorgente sono stati così impostati: gas 1 a 35 psi, gas 2 a 40 psi, il curtain gas a 25 psi e NC (needle current) a 5 μa. Per ogni steroide sono state ottimizzate due transizioni MRM. La prima transizione è stata usata per una determinazione quantitativa dell analita mentre la seconda per una sua determinazione qualitativa. I parametri composto dipendenti ottimizzati per ciascun analita sono riassunti in Tabella 1. Il sistema è controllato dal software Analyst 1.5 (ABSciex), mentre l elaborazione dei numerosi dati prodotti è stata eseguita mediante il software CHS TM Data Suite Software (PerkinElmer). Per l analisi HPLC è stato usato un sistema quaternario Shimadzu Prominence (Shimadzu Corporation Kyoto, Japan). Per la separazione dei 10 steroidi (Fig. 4), è stata LigandAssay 15 (4)

5 Tabella 1 Parametri composto-dipendenti. Declustering potential (DP), entrance potential (EP), collision energy (CE), collision cell exit potential (CXP). Transizione quantitativa (quant), transizione qualitativa (qual). Steroid MW polarity MRM transition trans. DP EP CE CXP Testo 288, /97 quant /109 qual DHEA 288, /213 quant /197 qual OHP 330, /97 quant /109 qual Cc-one 346, /121 quant /97 qual Prog 314, /97 quant /109 qual DeoxyC 346, /109 quant /97 qual A-dione 286, /97 quant /109 qual DHEAS 368, /197 quant /213 qual C-ol 362, /97 quant qual Aldo 360,19-359/189 quant /331 qual utilizzata una colonna Phenomenex Luna C8, (50x3 mm, 3µm), preceduta da una precolonna Phenomenex SecurityGuard Cartridges C8, (4x2 mm), (Phenomenex, Torrance, CA) e da un filtro in linea Upchurch Scientific (Upchurch Scientific, Oak, Harbor, WA). Il volume di iniezione dell autocampionatore era di 100 μl. Le fase mobili utilizzate erano così costituite: fase A, soluzione di metanolo in acqua al 2% (v/v) + 0,025 % di additivo per HPLC (v/v); fase B, metanolo + 0,025% di additivo per HPLC (v/v). Il gradiente HPLC adottato prevedeva una fase iniziale di lavaggio del campione di 3 minuti al 35% di fase B (deviata allo scarico), seguita da un gradiente lineare da 35% a 45% di fase B in 1 minuto, e da un successivo gradiente lineare da 45% a 65% di fase B in 8 minuti; al termine del ciclo era previsto un lavaggio della colonna per 3 minuti con 100% di fase B (deviando il flusso allo scarico). La colonna veniva poi riequilibrata per 3 minuti alle condizioni iniziali, per un tempo totale della corsa analitica di 15+3 minuti. E stato usato un flusso di 600 μl/minuto e la colonna è stata mantenuta ad una temperatura di 40 C. Principio di calibrazione La determinazione quantitativa dei campioni è stata ottenuta mediante curve di calibrazione costituite da 7 calibratori. Le curve di calibrazione sono state calcolate usando la regressione lineare pesata 1/x 2, per assicurare la massima accuratezza alle concentrazioni più basse. E stata usata la seguente equazione: y= xm + b, dove y è il rapporto tra le aree dell analita ed il corrispondente standard interno, mentre x rappresenta le concentrazioni assegnate al calibratore. L utilizzo degli standard interni permette di normalizzare la preparazione dei campioni e la variabilità degli strumenti 28, nonché le differenze dell'intensità del segnale causate dagli effetti della matrice 28, 29. RISULTATI Precisione Figura 4 Tracciato cromatografico ottenuto mediante il metodo LC-MS/MS descritto. DHEA e 17-OHP coeluiscono ma la specificità nella loro determinazione quantitativa è assicurata da 2 diverse transizioni MRM. La precisione del dosaggio è stata stabilita in conformità alle linee guida NCCLS EP5-A2 30 usando il siero proveniente da coagulo naturale (OTC, off-the-clot) di donatori sani per i livelli di analiti endogeni, come pure campioni OTC arricchiti con 3 livelli di concentrazioni crescenti dei 10 analiti steroidei. I livelli di concentrazione di tutti gli analiti rientravano nell intervallo di calibrazione. Per ogni livello di concentrazione è stata determinata la precisione 56 LigandAssay 15 (4) 2010

6 intra-saggio, inter-saggio e totale. La precisione totale è stata calcolata come CV% in base all equazione: Precisione totale = [(Wr)2 + (Br)2]1/2 dove: Wr = precisione intra-saggio; e Br = precisione intersaggio; (totale come CV%). Nella tabella 2 sono riportati i risultati in termini di precisione del dosaggio ottenuti per i livelli di concentrazione endogeno (Endo), basso, medio e alto dei campioni. Linearità La linearità del metodo è stata determinata testando i campioni di siero arricchiti con concentrazioni note e crescenti di analita, coincidenti con l intervallo clinico di interesse. La linearità è stata calcolata considerando le concentrazioni di analita misurate in funzione dei corrispondenti livelli di arricchimento noti ed eseguendo un'analisi di regressione lineare dei dati. Nella tabella 3 è indicato l intervallo di linearità (l intervallo di concentrazione più ampio misurato in cui R 2 0,99) per ogni analita. Il limite inferiore dell intervallo di linearità per ogni analita è equivalente alla sensibilità funzionale del dosaggio per quell'analita. Recupero Le caratteristiche di recupero del dosaggio sono state determinate aggiungendo quantità crescenti di analita al siero OTC. I livelli aggiunti per i campioni OTC sono stati scelti in prossimità del limite inferiore e superiore degli intervalli di linearità, per ogni analita. Il recupero è stato calcolato usando l equazione: Drift Recupero =[Quantità misurata Quantità endogena misurata] Quantità aggiunta Per la valutazione di eventuali derive (drift) sono stati analizzati campioni contenenti i 10 steroidi per un periodo di 48 ore. Come mostrato in Figura 5, il metodo non presenta alcun significativo scostamento durante il periodo di acquisizione continuata dei dati. Comparazione di metodi Il dosaggio degli steroidi mediante il metodo LC- MS/MS qui descritto, è stato comparato con metodologie immunometriche. In particolare l aldosterone e il 17-OHP Tabella 2 Precisione intra-saggio, inter-saggio e totale di 10 analiti steroidei Analita Aldosterone Androstenedione Livello Endo Basso Medio Alto Endo Basso Medio Alto Medio (ng/ml) 0,02 0,46 1,26 3,34 0,31 1,58 4,10 10,70 CV(%) Wr 14,1 2,.9 2,9 2,8 3,1 3,8 4,5 3,7 Br 12,1 5,0 5,0 4,0 3,8 3,0 2,6 2,2 Totale 18,6 5,7 5,7 4,9 4,9 4,8 5,2 4,3 Analita Corticosterone Cortisolo Livello Endo Basso Medio Alto Endo Basso Medio Alto Medio (ng/ml) 1,.60 7,14 19,22 51,50 70,78 70,95 128,21 232,14 CV(%) Wr 3,3 3,2 3,.0 4,4 2,5 2,7 3,3 2,3 Br 4,7 3,1 3,0 2,9 2,2 2,0 2,3 2,5 Totale 5,8 4,4 4,2 5,3 3,4 3,4 4,1 3,4 Analita 11-deossicortisolo Deidroepiandrosterone Livello Endo Basso Medio Alto Endo Basso Medio Alto Medio (ng/ml) 0, ,05 10,66 1,89 7,74 19,68 52,98 CV(%) Wr 4, ,2 4,0 8,8 5,4 5,7 3,8 Br 7, ,6 2,5 7,3 5,9 4,4 4,4 Totale 9, ,9 4,7 11,4 8,0 7,2 5,8 Analita Solfato di deidroepiandrosterone Progesterone Livello Endo Basso Medio Alto Endo Basso Medio Alto Medio (ng/ml) 1042, ,7 2015,7 0,56 1,64 4,38 11,42 CV(%) Wr 6, ,1 6,2 3,0 3,7 3,5 2,8 Br 5, ,3 7,2 3,4 2,3 1,7 2,6 Totale 8, ,1 9,5 4,6 4,4 3,8 3,8 Analita 17α-idrossiprogesterone Testosterone Livello Endo Basso Medio Alto Endo Basso Medio Alto Medio (ng/ml) 1,02 1,86 5,34 14,65 1,98 2,00 3,52 5,46 CV(%) Wr 2,8 3,2 2,7 2,4 3,5 3,3 3,3 2,3 Br 15,1 8,3 3,2 3,1 2,5 2,2 2,2 2,2 Totale 15,4 8,8 4,2 3,9 4,2 4,0 4,0 3,2 LigandAssay 15 (4)

7 Tabella 3 Intervalli di linearità dei 10 analiti steroidei Intervalli di linearità (ng/ml) Analita Inferiore Superiore Aldosterone 0,017 16,6 Androstenedione 0,034 34,6 Corticosterone 0,050 72,9 Cortisolo 0, deossicortisolo 0,028 57,1 Deidroepiandrosterone 0,254 75,4 Solfato di deidroepiandrosterone 5, Progesterone 0,038 50,8 17α-idrossiprogesterone 0,038 33,8 Testosterone 0,019 33,1 Tabella 4 Recuperi tipici dell'analita per i campioni OTC Analita Recovery Media (%) DS (%) Recovery Min (%) RecoveryMax (%) Aldosterone Androstenedione Corticosterone Cortisolo desossicortisolo Deidroepiandrosterone Solfato di deidroepiandrosterone Progesterone α-idrossiprogesterone Testosterone Figura 5 Aree (Analita/IS) acquisite durante un periodo di 48 ore. sono stati dosati mediante metodi RIA: Active Aldosterone RIA (Immunotech Beckman Coulter, Praga, CZ) e 17OHP RIA CT, (DiaSource Immunoassay, Nivelles, BE) rispettivamente, androstenedione, cortisolo, DHEAS con il sistema Immulite 2000 (Siemens Healthcare, Siemens AG, Erlangen, D), progesterone, testosterone mediante CLIA, Architect i2000 SR (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA), mentre il DHEA mediante metodo DHEA ELISA (DRG Diagnostics, DRG International, Marburg, D). Tutte la fasi analitiche sono state allestite seguendo i protocolli dei singoli produttori. Questo studio di comparazione è stato eseguito in collaborazione con il 3 Laboratorio Analisi-Settore Endocrinologia e con il laboratorio di Igiene e Tossicologia Industriale degli Spedali Civili di Brescia utilizzando una parte dei campioni raccolti per i quali era stata richiesta l analisi degli ormoni sopracitati. Per la correlazione tra i metodi LC-MS/MS e quelli immunometrici, è stata usata la procedura di regressione non-parametrica di Passing e Bablock 31. Alcuni dati preliminari di questo studio, tuttora in corso, sono di seguito riportati. Come si può osservare dalla Figura 6 esiste una buona correlazione tra i metodi LC-MS/MS ed immunometrico per il dosaggio del DHEAS. Mentre per il dosaggio del 17-OHP si nota una leggera sovrastima dei metodi immunometrici rispetto LC-MS/MS (Fig. 7). Tale tendenze si fa più evidente nel dosaggio dell androstenedione e del cortisolo (Figg. 8, 9). Mentre per il dosaggio del DHEA la correlazione tra i due metodi si fa decisamente meno evidente (Fig. 10). A titolo esemplificativo viene riportato l istogramma raffigurante i profili ottenuti su una serie di campioni utilizzando il metodo LC-MS/MS (Fig. 11). La leggibilità è chiaramente influenzata dalle concentrazioni relative dei vari costituenti che variano con differenti ordini di grandezza. In ogni caso si può notare il gran numero di dati ottenibili in un singolo esperimento. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI Il metodo LC-MS/MS, qui descritto, per il dosaggio di 10 steroidi (aldosterone, androstenedione, corticosterone, cortisolo, 11-deossicortisolo, DHEA, DHEAS, progesterone, 17-OHP, testosterone), è riproducibile, robusto e specifico. Gli intervalli di linearità determinati mediante questo 58 LigandAssay 15 (4) 2010

8 Figura 6 Comparazione del dosaggio del DHEAS mediante LC-MS/MS e CLIA. La linea di regressione per LC-MS/MS (y) e immunoassay (x) per DHEAS è: y= 0,983x + 67,522. Figura 7 Comparazione del dosaggio del 17-OHP mediante LC-MS/MS e RIA. La linea di regressione per LC-MS/MS (y) e immunoassay (x) per 17-OHP è: y= 0,875x + 0,850. Figura 8 Comparazione del dosaggio dell androstenedione mediante LC- MS/MS e CLIA. La linea di regressione per LC-MS/MS (y) e immunoassay (x) per androstenedione è: y= 0,644x + 0,529. Figura 9 Comparazione del dosaggio del cortisolo mediante LC-MS/MS e CLIA. La linea di regressione per LC-MS/MS (y) e immunoassay (x) per cortisolo è: y= 0,640x + 104,2. Figura 10 Comparazione del dosaggio del DHEA mediante LC-MS/MS e ELISA. La linea di regressione per LC-MS/MS (y) e immunoassay (x) per DHEA è: y= 0,618x + 79,17. Figura 11 Profili prodotti per una serie di 11 campioni di siero analizzati in un'unica seduta analitica per tutto il pannello di steroidi. L ordine di grandezza di concentrazione del DHEAS ed, in misura minore, del cortisolo tendono a schiacciare i livelli di concentrazione degli altri steroidi. Per questo una attenta ridefinizione del modo di rappresentazione del dato grezzo unito ad una chiara definizione del quesito clinico sono necessarie al fine di produrre un referto di elevato valore diagnostico. LigandAssay 15 (4)

9 metodo e garantiti dai calibratori forniti con il nostro kit (CHS TM MSMS Steroids kit), coprono gli intervalli di interesse clinico, sia in ambito pediatrico che per l età adulta 32,33. Ovviamente i LLOQ (limiti inferiori di quantificazione) raggiunti per ogni analita sono dipendenti dallo strumento MS/MS utilizzato. I principali vantaggi di questo metodo, se comparato ad altri metodi LC-MS/MS e GC-MS, sono il limitato volume di campione iniziale richiesto, (100 µl), che lo rendono adatto anche per pazienti pediatrici e la facile preparazione del campione. Questa infatti è limitata ad una semplice precipitazione delle proteine e non richiede passaggi di derivatizzazione. Questa semplificata preparazione del campione, rende tale metodo adatto ad un uso di routine nei laboratori clinici. In letteratura è riportato che i metodi immunometrici generalmente producono valori più elevati rispetto quelli generati con il metodo LC-MS/MS per gli steroidi (quali per esempio: cortisolo 24, 11-deossicortisolo 25, 17-OHP 15, 14 ). Tale sovrastima, imputata ad una scarsa specificità analitica dei metodi immunometrici, è stata anche riscontrata nei risultati, preliminari e ancora in corso di definizione, riportati in questo articolo per 17-OHP, androstenedione e cortisolo. Inoltre, il metodo LC-MS/MS qui riportato permette anche di determinare 10 steroidi in un unica corsa analitica; il profilo steroideo che ne deriva offre un indubbio vantaggio dal punto di vista diagnostico rispetto le tecniche immunometriche. Questo approccio volto alla produzione di un profilo offre una grande possibilità di lettura e di interpretazione clinica che dovrà essere attentamente vagliata in futuro in modo da caratterizzare meglio quello che si sta rivelando un potente strumento a disposizione dell endocrinologo. Allo scopo di favorire l elaborazione di una così elevata mole di dati prodotti, (nonché valutazione dei cutoff, dei QC ecc.), abbiamo ritenuto utile sviluppare un software (CHS TM Data Suite Software) adatto a tale scopo ed interfacciabile con i software dei più comuni spettrometri di massa. In conclusione, il metodo/kit da noi sviluppato permette la determinazione simultanea di 10 steroidi negli intervalli di interesse clinico, sia in ambito pediatrico che per l età adulta con una buona linearità, sensibilità e precisione. Tale metodo si presta ad un uso di routine nei laboratori clinici. RINGRAZIAMENTI Dott. C. Iacobello, Dott.ssa A. Gussago Terzo Laboratorio Analisi Settore Ormoni Dott.ssa M.C. Ricossa Laboratorio di Igiene e Tossicologia Industriale A.O. Spedali Civili di Brescia BIBLIOGRAFIA 1. Holst JP, Soldin OP, Guo T, et al. Steroid hormones: relevance and measurement in the clinical laboratory. Clin Lab Med 2004;24: Nussey SS, Whitehead SA. In: Endocrinology: An Integrated Approach, BIOS Scientific Publishers Ltd. 3. Payne AH, Hales DB. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocr Rev 2004;25: Simard J, Ricketts ML, Gingras S, et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev 2005;26: Schweda F, Friis U, Wagner C, et al. Physiology 2007; 22: Speiser PW, White PC. Congenital adrenal hyperplasia. N Eng. J Med 2003;349: Pascoe L, Curnow KM, Slutsker L, et al. Mutations in the human CYP11B2 (aldosterone synthase) gene causing corticosterone methyloxidase II deficiency. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89: Bose HS, Sugawara T, Strauss JF3rd, et al. 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