A methodology for determination of priority phenolic compounds in contaminated soils by LC-APCI mass spectrometry

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1 A methodology for determination of priority ic compounds in contaminated soils by LC-APCI mass spectrometry F. Zanon, R. Lava, M. Prenzato, C. Cecchinato ARPAV Dipartimento Regionale Laboratori Laboratorio Provinciale di Venezia 1 MS-EnviDay Bologna, 13 maggio 2011

2 Origine sia industriale che naturale - intermedi/metaboliti di produzioni industriali: coloranti, farmaci, pesticidi/biocidi, esplosivi, industria cartiera e del rivestimento materiale legnoso - possibile fotodegradazione chimica dei fumi esausti auto - acidi umici Proprietà: tossicità e persistenza PENTACLOROFENOLO (sostanze prioritarie) Normativa di riferimento: D. Lgs. n.152/2006 parte IV, Titolo V, Allegato 5, Tab. 1 A Siti ad uso verde pubblico, privato e residenziale (mg/kg ss) B Siti ad uso commerciale e industriale (mg/kg ss) Fenoli non clorurati Metilfenolo (o,m,p) Fenolo 1 60 Fenoli clorurati 2-clorofenolo ,4 clorofenolo ,4,6 triclorofenolo pentaclorofenolo

3 Metodi di determinazione PRETRATTAMENTO CLEANUP DETERMINAZIONE ANALITICA Estrazione: con solvente con estrattore Soxhlet (metodo EPA 3540c e 3541), sotto pressione (metodo EPA 3545), con ultrasuoni (metodi EPA 3550b e IRSA 19a), metodo ISO per il pretrattamento di composti organici (ISO 14507). Purificazione e cleanup: su gel di silice (metodo EPA 3630c), mediante gel permeation (metodo EPA 3640a) o con un sistema di ripartizione acido/base (metodi EPA 3650b e IRSA 19a). Analisi e determinazione: condotta mediante GC (metodo EPA 8041), GC/MS (metodo EPA 8270c) o HPLC UV (Quad. Ist. Ric. Acque, 64 Metodo19a - Metodi Analitici per i fanghi, vol. 3). Esiste inoltre un metodo ISO per la determinazione di fenoli e clorofenoli ISO/CD Letteratura scientifica: Introduzione di nuove metodiche di cleanup (SPE, SPME, MEA) e determinazione (LCMS) - C. Mahugo Santana, Z. Sosa Ferrera, M.E. Torres Padròn and J.J. Santana Rodrìguez,, Molecules 14 (2009) M.C. Alonso, D. Puing, I. Silgoner, M. Grasserbauer and D. Barcelò, Journal of Chromatography A, 823 (1998) M.N. Sarrion, F.J. Santos, E. Moyano and M.T. Galceran, Rapid Communications in Mass Spectrometry 17 (2003) O.Jàuregui, E. Moyano and M.T. Galceran, Journal of Chromatography A 823 (1998) Necessità di conciliare protocolli ufficiali, standardizzati con metodiche proposte in letteratura scientifica progresso tecnico/scientifico per arrivare ad un metodo robusto ed affidabile che scenda ai limiti imposti dalla legislazione, ma allo stesso tempo che sia realmente compatibile con le attività di un agenzia di controllo (numero di campioni analizzati e tempistiche d analisi)

4 Sito di Porto Marghera Necessità di conferma in massa per complessità della matrice da analizzare

5 12 analiti determinati FENOLO METIL FENOLI: 2-Methyl, 3-Methyl, 4-Methyl, 2,4-Dimethyl NITRO FENOLI: 2-Nitro, 4-Nitro, 2,4 Dinitro CLORO FENOLI: 2-Chloro, 2,4-Dichloro, 2,4,6-Trichloro, Pentachloro standard interni impiegati Phenol-d 6, 2-Fluoro, 2,4,6-Tribromo

6 Preparazione Campione (Metodo CNR IRSA Quad. 64, vol opportunemente modificato e integrato con SPE cleanup 1. Prelevare 2 g di terreno tal quale ben omogeneizzato 2. Aggiungere 0.5 ml di acido acetico 3. Estrarre in ultrasuoni per 30 minuti con 5 ml di acetonitrile per 3 volte 4. Filtrare a 0.2 µm, recuperare 5 ml di estratto e concentrare fino a 1 ml con evaporatore a centrifuga 5. Riportare a 5 ml con acqua milliq a ph 2 6. Purificare con SPE Oasis HLB TM da 6 ml (200mg) precedentemente attivata con Metanolo 7. Seccare la cartuccia sotto vuoto 8. Eluire le cartucce con 5 ml di metanolo 9. Portare a piccolo volume con evaporatore centrifugo 10. Trasferire in vials per l analisi SPE Oasis HLB TM N-vinylpirrolidone-divinylbenzene copolymeric sorbent

7 Analisi in LC MS/MS Condizioni cromatografiche UFLC XR SHIMADZU Colonna: Restek Pinnacle C18 50x2.1 mm 1.9µm Eluenti: H 2 O e CH 3 CN/MeOH 1:1 Flusso: 0.20 ml/min Volume iniezione: 20 µl Temperatura colonna: 50 gradi C Detector API 4000 TM AB SCIEX Sorgente APCI GS1: CUR: TEMP: 370 C IS: volts

8 Condizioni strumentali detector di massa Analita Q1 Mass(Da)Padre Q3 Mass Figlio (Da) DP CE Rt 2-Chloro ,4-Dimethil Methil Methil Methil d ,4-Dinitro Nitro Nitro Fluoro ,4-Dichloro Pentacloro ,4,6-Tribromo ,4,6-Trichloro

9 Range di concentrazione Analita Standard interno Limite inferiore della curva Limite superiore della curva Assegnato µg/l µg/l r -d ,4-Dichloro 2,4,6-Tribromo ,4,6-Trichloro 2,4,6-Tribromo Pentacloro 2,4,6-Tribromo ,4-Dimethyl 2-Fluoro Methyl 2-Fluoro 3-Methyl 2-Fluoro Methyl 2-Fluoro 2-Chloro 2-Fluoro ,4-Dinitro 2-Fluoro Nitro 2-Fluoro Nitro 2-Fluoro

10 Curve di calibrazione Phenol Range ppb

11 2,4-Dinitro Range ppb

12 Pentachloro Range ppb

13 Ripetibilità QC 2-Chloro 2,4-Dimethyl (2,3,4) Methyl 2,4-Dinitro 2-Nitro 4-Nitro 2,4-Dichloro Pentacloro 2,4,6-Trichloro ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb ppb QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l QC-12.5 µg/l num valori Media Dev.St CV% Ripetibilita' (min 15 camp in 2 mesi) 8% 15% 14% 11% 18% 12% 7% 9% 9% 8%

14 Recuperi Recuperi calcolati con spike su terreno di 0.13 µg/g SampleName 2-Chloro 17-Gennaio-2011 Terreni 2,4-Dimethyl (2,3,4)- Methyl 2,4-Dinitro 2-Nitro 4-Nitro 2,4-Dichloro Pentacloro 2,4,6-Trichloro Gen Bianco1_terreno_purificato_1: Gen Bianco2_terreno_purificato_1: Gen Spike2_terreno_purificato_1: Gen Spike3_terrenoOpurificato_1: Gen Spike2_terreno_purificato_1: Gen Spike3_terreno_purificato_1: Medie purificati Recuperi Purificati 106% 115% 71% 74% 58% 104% 99% 102% 95% 112% CV%

15 Analisi in HPLC Fluo/PDA UV Condizioni cromatografiche HPLC Waters Alliance 2695 Colonna Spherisorb ODS2 4.6x250 mm 5 µm Eluenti: H 2 O 1% ac. acetico e CH 3 CN Flusso: 1.20 ml/min Volume iniezione: 20 µl Detector fluorimetrico: λ ex 273 nm; λ em 308 nm Detector PDA/UV 3 canali: a 280 nm per monocloro e diclorofenoli a 290 nm per 2,3,6 triclorofenolo e nitrofenoli a 300 nm per pentaclorofenolo Tempo (min) % H2O % CH3CN

16 Confronto tra LC MS/MS e HPLC Analita LOQ LCMS (µg/l) LOQ LCMS mg/kg s.s. LOQ HPLC mg/kg s.s. Limite 152/A mg/kg s.s. Limite 152/B mg/kg s.s ,4-Dichloro ,4,6- Trichloro Pentacloro ,4-Dimethyl non assegnato non assegnato 2-Methyl 3-Methyl 4-Methyl Chloro ,4-Dinitro non assegnato non assegnato 2-Nitro non assegnato non assegnato 4-Nitro non assegnato non assegnato

17 Confronto con MR RM 112 Valore dichiarato mg/kg s.s. Valore LCMS mg/kg s.s. Valore HPLC mg/kg s.s ± ± ± chloro 2.38 ± ± ± nitro 5.66 ± ± ± ,4-dichloro 2.53 ± ± ± 0.14 pentachloro 5.05 ± ± ± 0.31 RM 117 Valore dichiarato mg/kg s.s. Valore LCMS mg/kg s.s. Valore HPLC mg/kg s.s. 2-nitro 8.08 ± ± ± ,4-dichloro 8.02 ± ± ± ,4,6-trichloro 4.25 ± ± ± 0.09 pentachloro 6.99 ± ± ± 0.99

18 Analisi di campioni reali # ID (mg/kg s.s.) <LOD <LOD <LOD methyl isomers <LOD 0.07 <LOD <LOD <LOD 2-chloro <LOD <LOD * <LOD <LOD * <LOD * <LOD * <LOD * 2,4,6- trichloro pentachloroph enol <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD <LOD * <LOD <LOD <LOD Peso t.q. (g) RS 105 C % Frazione % <2mm * Valori risultati >LOD in HPLC, ma non confermati in LCMS

19 Ulteriori sviluppi del metodo Fenolo Colonna ammidica Colonna C18 Phenol Conc. 10 µg/l Conc. 20 µg/l Utilizzando la colonna ammidica Supelco Ascentis RP Amide 15 cm X 2.1 mm 2.7 µm si ottengono picchi molto piu stretti e separazioni ottimali per alcuni isomeri

20 2-, 3- e 4-chloro Colonna ammidica Colonna C18 2-chloro Conc. 0.8 µg/l Conc. 2 µg/l 4-chloropheno 3-chloro Conc. 0.8 µg/l

21 Considerazioni finali 1. Il metodo sviluppato consente la determinazione simultanea del fenolo e dei suoi metil, nitro e cloro derivati in matrice complessa con elevata sensibilità e selettività caratteristica del detector di massa, senza ricorrere alla derivatizzazione 2. LOQ adeguati ai limiti di legge per gli analiti ricercati 3. Metodo utilizzabile in un laboratorio di controllo ambientale (metodica veloce ) per un elevato numero di campioni