Determinazione simultanea di aflatossine, ocratossina A e tossine di Fusarium in cereali. immunoaffinità multi anticorpo e LC-MS/MS

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1 Determinazione simultanea di aflatossine, ocratossina A e tossine di Fusarium in cereali mediante purificazione su colonnine ad immunoaffinità multi anticorpo e LC-MS/MS V.M.T. Lattanzio, M. Solfrizzo, S. Della Gatta, S. Powers, A. Visconti Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA), BARI

2 RASFF Report Annuale 2008 Numero di Notifiche Mycotoxin Total Cereal products Cocoa, coffee, tea Dietetic food and food supplements Feed for foodproducing animals Fruit and vegetables Herbs and spices Nuts, nut products and seeds ther food product /mixed Pet food Wine Aflatoxins Deoxynivalenol 4 4 Fumonisins chratoxin A Zearalenone 2 2 Patulin 3 1 2

3 EC regulations 1881/2006 and 1126/2007: Limiti massimi ammissibili di micotossine in cereali Deossinivalenolo 1750 µg/kg mais frumento duro - avena 1250 µg/kg altri cereali Aflatossine 2 µg/kg AFB 1, 4 µg/kg somma di B 1, B 2, G 1, G 2 Fumonisine Zearalenone chratossina A 4000 µg/kg mais 350 µg/kg mais 100 µg/kg altri cereali 5 µg/kg Tossine T-2 e HT-2 In discussione Svulippo e validazione di nuove metodiche analitiche

4 Analisi di singole classi di micotossine CRATSSINA A AFLATSSINE DESSINIVALENL C H NH H Cl CH 3 H H3C H CH 2 CH H 3 H H ZEARALENNE H CH 3 Differente natura chimica delle micotossine: - Polarita - Assorbimento UV o in fluorescenza - Forma ionica (dipendente dal ph) Differenti concentrazioni target (da µg/kg a mg/kg) TSSINA T-2 C H 3 H (H3C)2HCH2CC H H 3 CC CH2 CH3 H H H CCH3 Presenza in matrici diverse Differenti strategie analitiche e di preparazione del campione H H H H H3C CH3 CH 3 H NH 2 CH 3 H H FUMNISINE

5 LC-MS/MS => Analisi Multimicotossina Punti chiave nello sviluppo di un metodo multi-micotossina: Co-extrazione di tutti gli analiti Purificazione delle differenti micotossine in un solo passaggio Rivelazione mediante una tecnica universale, con un ampio range di linearità

6 Determinazione simultanea di 39 micotossine in estratti non purificati di frumento e mais Co-extrazione: acetonitrile/acqua/acido acetico 79:20:1 Purificazione: X analisi di estratti diluiti 1+1 Rivelazione: LC-ESI-MS/MS, API 4000 Qtrap Effetto Matrice (Aflatossine) Recuperi non accettabili (<60%) per alcune tossine (Fumonisine) Sulyok M, Berthiller F, Krska R, Schuhmacher R. Development and validation of a liquid chromatography/tandem mass spectrometric method for the determination of 39 mycotoxins in wheat and maize. Rapid Commun Mass Spectrom. 20(2006): Sulyok M, Krska R, Schuhmacher R. A liquid chromatography/tandem mass spectrometric multi-mycotoxin method for the quantification of 87 analytes and its application to semi-quantitative screening of moldy food samples. Anal Bioanal Chem. 389(2007):

7 Determinazione simultanea di 33 micotossine in estratti non purificati di arachidi, pistacchi, frumento, mais, cornflakes, uva passa e fichi Spanjer M, Rensen PM, Sholten JM. Food Addit. Contam. 25 (2008) Co-extrazione: acetonitrile/acqua 80:20 metanolo/acqua 70:30 (fichi, uva passa) Purificazione: X analisi di estratti diluiti Rivelazione: LC-ESI-MS/MS (+) Recuperi non accettabili per alcune micotossine: FB1 20% (RSDr 72%), FB2 46% (RSDr 8%) (slurry di mais) Effetto Matrice Aflatossine fino a 53% soppressione ionica Tossine T2 e HT2 fino a 65% soppressione ionica (slurry di frumento) Bassa sensibilità per DN (ioni positivi)

8 UPLC-MS/MS Determinazione simultanea di 17 micotossine in alimenti e mangimi Ren Y. et al. J. Chromatogr. A 1143 (2006) Tempi di analisi ridotti Elevata sensibilità (LD <0.2 µg/kg) Elevata risoluzione Estrazione con acetonitrile/acqua 84:16 SPE clean up Fumonisine escluse! 2 corse cromatografiche ESI(+) ESI(-) Tempo totale < 10 min ESI (-) (1) NIV; (2) DN; (3) FX; (4) TA; (5) 3-ADN; (6) 15-ADN; (10) ZN; (11) ZAN (IS) ESI (+) (7) ATG2; (8) ATM1; (9) ATG1 (12) ATB2; (13) ATB1; (14) CTN; (15) HT-2; (16) T-2; (17) ZAN (IS); (18) SMC; (19) VCG.

9 Punti Critici nello sviluppo di un metodo multi-micotossinamicotossina Co-estrazione di tutti gli analiti Alte percentuali di metanolo o acetonitrile (> 75%) Afs, TA, ZEA, DN, T-2/HT-2 Alte percentuali di acqua (50%) o basso ph Fumonisine Preparazione del campione Analisi di estratti diluiti Purificazione dell estratto: SPE - IAC (ASIS HLB: Sørensen et al. 2005, J. Chromatogr. B, 820:183 Lattanzio et al.2008, Food Addit. Contam. 25:320) Separazione cromatografica Ionizzazione e riduzione dell effetto matrice

10 Determinazione simultanea di aflatossine, ocratossina A, fumonisine, tricoteceni e zearalenone in cereali mediante LC-MS/MS e purificazione su colonnine ad immunoaffinità Lattanzio VMT, Solfrizzo M, Powers S, Visconti A Rapid Commun Mass Spectrom, 21 (2007) ) Doppia Estrazione 2) Purificazione su colonnine ad immunoaffinità multi-anticorpo Basata sull uso di nuove colonnine ad immunoaffinità (Vicam, MYC6in in1 TM ) contenenti anticorpi per aflatossine, ocratossina A, fumonisine, deossinivalenolo, zearalenone, tossine T-2 e HT-2. 3) Rivelazione mediante LC-ESI-MS/MS

11 Preparazione del campione Campione (10 g) Tampone fosfato (ph 7.4) 50 ml, 60 min shaking Aggiunta di Metanolo al pellet (metanolo/acqua ~ 70:30) 60 min shaking Estratto A Estratto B Centrifugazione Prelievo dell estratto Centrifugazione Prelievo dell estratto e diluizione Estratto A deossinivalenolo, fumonisine, tossine (T-2) e HT-2 Estratto B aflatossine, ocratossina, zearalenone Myco6in1 TM Clean up su colonnine a immunoaffinità LC-ESI-MS/MS

12 ttimizzazione delle Condizioni MS Q1 Q2 Q3 ESI D Time, min Selezione degli ioni precursori [DN + CH 3 C] - m/z [AFG 2 + H] + m/z [AFG 1 + H] + m/z [AFB 2 + H] + m/z [AFB 1 + H] + m/z [HT2 + NH 4 ] + m/z [T2 + NH 4 ] + m/z [FB 1 + H] + m/z [FB 2 + H] + m/z [TA + H] + m/z [ZEA H] - m/z Fase Mobile: Metanolo/Acqua 0.5% acido acetico 1mM ammonio acetato Eluizione in Gradiente FBs - TA T2-HT2-DN Polarity switching Buona Separazione Cromatografica

13 Cromatogramma (TIC) di un estratto di mais artificialmente contaminato con: 500 µg/kg DN; 2 µg/kg AFG 2, AFB 2 ; 6 µg/kg AFG 1 ; 10 µg/kg AFB 1 ; 500 µg/kg FB 1 ; 250 µg/kg FB 2 ; 100 µg/kg HT-2, T-2, ZEA; 20 µg/kg TA. 100 ZEA (-) (+) (+) (-) (+) DN x % B Intensity, % FB 1 T-2 FB 2 40% B 20% B 0 AFG 2 AFG 1 AFB 2 AFB 1 HT-2 TA Time, min Colonna: Gemini RP18 ( mm, 5 µm) Phenomenex Flusso: 200 µl/min Column oven: 40 ºC Solv A: H 2, 0.5% acido acetico, 1mM AcNH 4 Solv B: CH 3 H, 0.5% acido acetico, 1mM AcNH 4 Volume iniettato: 20µl (100 mg matrice)

14 Validazione del metodo: RECUPERI e RIPETIBILITA Livelli di fortificazione (µg/kg) Recupero, % (RSDr, n=3) MAIS FRUMENT RZ Criteri CEN di accettabilità (EU regulation N. 401/2006) DN (4) 95 (0.6) 60 (9) µg/kg Recupero %, RSDr 20 > 500µg/Kg Recupero %, RSDr 20 AFG (3) 95 (5) 90 (13) AFG (2) 90 (3) 87 (6) AFB (3) 101 (0.7) 83 (6) < 1 µg/kg Recupero %, 1-10 µg/kg Recupero % > 10 µg/kg Recupero % RSDr = 0.66 RSD R AFB (5) 88 (4) 84 (6) FB (8) - - FB (6) - - HT-2+T-2 2 (*) (4) 79 (2) 86 (11) ZEA (4) 79 (1) 88 (9) 500µg/Kg Recupero %, RSDr 30 > 500µg/Kg Recupero70-110%, RSDr µg/kg Recupero %, RSDr 40 > 200 µg/kg Recupero %, RSDr µg/kg Recupero %, RSDr 40 > 50 µg/kg Recupero %, RSDr 25 TA (7) 99 (0.6) 91 (9) 1-10 µg/kg Recupero %, RSDr 20 (*) Durante l estrazione in PBS si verifica l drolisi della tossina T-2 in HT-2, le due tossine sono quindi quantificate come somma.

15 Validazione del metodo: LIMITI di RIVELABILITA (S/N=3) Limite di Rivelabilità (µg/kg) Limiti massimi ammissibili EC regulations 1126/2007, 1881/2006 MAIS FRUMENT RZ DN µg/kg mais frumento duro - orzo 1250 µg/kg altri cereali AFG AFG AFB µg/kg AFB 1, 4 µg/kg somma di B 1, B 2, G 1, G 2 AFB FB FB µg/kg somma di FB 1 + FB 2 in mais HT-2+T In discussione ZEA µg/kg mais 100 µg/kg altri cereali TA µg/kg

16 Cromatogramma (TIC) di un campione di MAIS naturalmente contaminato da 5 µg/kg DN, 72 µg/kg FB 1, 16 µg/kg FB 2, 0.5 µg/kg ZEA e 0.3 µg/kg TA. 100 FB 1 72 µg/kg FB 2 16 µg/kg Intensity, % DN 5 µg/kg x 5.0 ZEA 0.5 µg/kg TA 0.3 µg/kg Time, min

17 Cromatogramma (TIC) di un campione di FRUMENT naturalmente contaminato da 2.4 µg/kg DN, 55.2 µg/kg HT-2+T-2, 7.4 µg/kg ZEA e 1.6 µg/kg TA. 100 HT-2* 55.2 µg/kg ZEA 7.4 µg/kg % DN 2.4 µg/kg TA 1.6 µg/kg Time, min * Somma di T-2 + HT-2

18 Effetto matrice Rette di calibrazione ottenute solubilizzando le tossine standard in Fase mobile HPLC Estratto di mais purificato su colonnine a immunoaffinità DN Valutazione della significatività della differenza di pendenza tra retta di calibrazione in fase mobile e in matrice t-test (p = 0.05, n = 6, t value = 2.4) MAIS FRUMENT RZ injected ng DN No effetto matrice Soppressione ionica AFG AFB FB AFB 1 FB HT T ZEA injected ng TA

19 CNFRNT con METDICHE VALIDATE MAIS Campione 1 µg/kg MAIS Campione 2 µg/kg Metodo utilizzato per l analisi delle singole tossine Multi tossina Singola tossina Multi tossina Singola tossina DN MacDonald et al., 2005, J AAC (IAC-HPLC/UV) FB Sydenham et al, 1996, J. AAC FB (SAX-HPLC/FD) HT T ZEA AFs nd nd nd nd Visconti et al, 2005, J. Chromatogr. A (IAC-HPLC/FD) MacDonald et al., 2005, J AAC (IAC-HPLC/FD) Trucksess et al., 1991, JAAC (IAC-HPLC/FD) TA nd na nd na

20 CNCLUSINI E stato sviluppato un metodo sensibile, accurato e preciso per la determinazione simultanea di aflatossine (B 1, B 2, G 1, G 2 ), fumonisine (B 1, B 2 ), ocratossina A, tricoteceni (DN, HT-2, T-2) e zeralenone in cereali, mediante LC-ESI-MS/MS. La co-estrazione quantitativa di tutte le 11 micotossine è stata ottenuta mediante due estrazioni sequenziali con PBS e metanolo/acqua (70:30). Per la purificazione degli estratti sono state testate nuove colonnine a immunoaffinità multi-anticorpo: - La purificazione su colonnine a immunoaffinità riduce l effetto matrice o lo elimina del tutto. - La calibrazione in matrice o l utilizzo di standard marcati con isotopo 13 C 12 rimangono necessari per una determinazione quantitatica accurata. - La purificazione e pre-concentrazione del campione consentono di ottenere sensibilità elevata anche con strumentazione di medio costo. Accuratezza e ripetibilità conformi ai criteri stabiliti dal CEN (Regolamento EC No 401/2006) Buon accordo tra i risultati ottenuti con il metodo proposto e quelli ottenuti con metodi validati per l analisi di singole tossine.