SeroPertussis IgA/IgM
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- Biaggio Fabbri
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1 SerPertussis IgA/IgM Dsaggi (ELISA) Per la determinazine qualitativa degli anticrpi specifici IgA e IgM anti- Brdetella Pertussis nel sier uman Istruzini per l us Kit per 96 determinazini (Cdice N A233-01) Per us diagnstic In Vitr Sl per us prfessinale Cnservare a 2-8 C. Nn cngelare Savyn Diagnstics Ltd. 3 Habsem St. Ashdd ISRAEL Tel.: Fax: supprt@savyndiagnstics.cm Us Il kit SerPertussis IgA/IgM è un dsaggi (ELISA) qualitativ per la determinazine degli anticrpi specifici IgA e/ IgM anti-brdetella pertussis. Quest kit può essere utilizzat cme due dsaggi separati che permettn il rilevament degli anticrpi IgA IgM ppure di entrambi. Per us diagnstic In Vitr. Sl per us prfessinale. Intrduzine La Pertsse (Pertussis) è una infezine batterica altamente cntagisa del tratt respiratri causata da Brdetella pertussis bacilli gram-negativi. Si manifesta tipicamente nei bambini cn spasmi parssistici di tsse acuta; tsse cnvulsa e vmit pst-tussiv che permane per mlte settimane. La malattia prvca un alt tass di mrbilità e mrtalità, sprattutt nei bambini. La Pertsse è una malattia endemica, ma cn epidemie che si ripetn gni 3 5 anni. Negli USA si registran casi gni ann. L incidenza della Pertsse è stata ntevlmente ridtta cn la vaccinazine di massa; peraltr, anche nei paesi cn vaccinazine ad elevata cpertura la malattia sta ricmparend (1). A livell mndiale si registran quasi 50 milini di casi di pertsse gni ann e circa 350,000 persne muin a causa della malattia (2). L incidenza della pertsse è aumentata cstantemente dal 1980 (3). L immunità indtta da vaccin scmpare dp 5-10 anni, rendend il sggett vaccinat vulnerabile all infezine. L infezine nelle persne vaccinate prvca una malattia nn-specifica più leggera, senza le fasi cliniche classiche. La pertsse è riscntrata slamente nel 6% di questi casi; peraltr la malattia è caratterizzata da una tsse nn-specifica prlungata che dura da mlte settimane a mesi. A causa di questi sintmi atipici la Pertsse è stt diagnsticata negli adulti ed adlescenti che pssn essere i prtatri dell infezine a bambini nn vaccinati (4). I bambini trpp piccli per essere vaccinati in md cmplet e quelli che nn hann ancra cmpletat la serie di vaccinazini primarie sn espsti al rischi maggire di malattia acuta. La malattia è altamente cntagisa e fin al 90% dei famigliari sviluppa la malattia clinica dp l espsizine. Un trattament anti-micrbic precce riduce la gravità dei sintmi e limita il perid di cntagi. Una prnta identificazine dei casi può aiutare a prevenire l infezine delle persne nn-vaccinate stt-vaccinate tramite vaccinazine prfilassi anti-micrbica. La diagnsi di labratri della Pertsse può essere diretta tramite cltura, DFA PCR, indiretta tramite test sierlgici. Piché i batteri risiedn nel tratt respiratri superire durante le prime due settimane dell infezine, pssn essere rilevati cn metdi diretti sltant durante quest perid. Per il rilevament dirett si preferisce il campine nasfaringe (aspirazine tampne). I test sierlgici aiutan nella diagnsi d infezini atipiche, cn tsse prlungata e per scpi epidemilgici. I livelli elevati di anticrpi anticrpi anti- tssina della pertsse (PT) e anti Emagglutinina Filamentsa (FHA) sn cnsiderati marcatri sierlgici sensibili nella diagnsi della Pertsse negli adulti e bambini nn vaccinati (5). Nei bambini nn vaccinati, per rientrare nella definizine della Pertsse data dalla Wrld Health Organizatin (WHO), sn necessari incrementi nei livelli di immunglbulina G (IgG) immunglbulina A (IgA) cntr un antigene singl più antigeni. Nei bambini vaccinati è sufficiente un sl campine di sier per diagnsticare la Pertsse (6). SerPertussis TM IgG e SerPertussis TM IgA/IgM utilizzan una frazine arricchita di PT e FHA cme antigeni, permettend un rilevament sensibile degli anticrpi IgA e/ IgM e la determinazine semi-quantitativa degli anticrpi IgG anti Brdetella pertussis, cnsentend il fllw-up dell stat immune e le cinetiche degli anticrpi. Principi del Test Le micrpiastre SerPertussis sn rivestite cn una frazine arricchita di tssina Brdetella pertussis e Emagglutinina Filamentsa. Il sier da sttprre a test è diluit 1/100 e incubat sulla piastra SerPertussis. In questa fase gli anticrpi specifici B. pertussis si legan agli antigeni immbilizzati. Gli anticrpi nn-specifici sn eliminati mediante lavaggi. Si aggiunge il cniugat anti IgA e/ IgM uman marcat cn perssidasi di rafan (HRP). In questa fase il cniugat HRP si lega al cmpless antigene-anticrp precedentemente legat. Il cniugat nn legat è eliminat mediante lavaggi. M233-01I 05-02/12 1
2 Si aggiunge il substrat TMB che è idrlizzat dalla perssidasi e clra di blu la sluzine di Substrat ridtt. Dp l aggiunta della sluzine di arrest il clre blu diventa giall e si esegue la lettura cn un lettre ELISA alla lunghezza d nda di 450/620nm. La densità ttica è prprzinale ai livelli di anticrpi specifici legati agli antigeni fissati alla fase slida. Prcedura del test Aggiungere 50µl di Cntrll Cut Off, Cntrll, Cntrll, e 1/100 di campini diluiti ai pzzetti rivestiti cn prteine specifiche immundminanti di B.pertussis Cprire ed incubare per 1 ra a 37ºC al 100% di umidità Lavare 3 vlte cn Sluzine Tampnata di Lavaggi Aggiungere 50µl di Cniugat HRP diluit 1/300 Cprire ed incubare per 1 ra a 37ºC al 100% di umidità Lavare 3 vlte cn Sluzine Tampnata di Lavaggi Aggiungere 100µl di Substrat TMB Cprire ed incubare per 15 min. a temperatura ambiente Aggiungere 100 µl di Sluzine di Arrest Leggere a 450/620nm Calclare ed interpretare i risultati Materiali frniti Kit per 96 Determinazini Cdice N A233-01E 1. Micrpiastra rivestita cn antigene B. pertussis: 96 pzzetti separabili (8x12) rivestiti cn antigeni Brdetella pertussis, cnfezinati in una custdia di allumini cntenente una carta essiccante. 1 micrpiastra 2. Sluzine Tampnata di Lavaggi Cncentrata (20X): Un Tampne PBS - Tween. Cntiene prclin cme cnservante in quantità inferire all 0.05%. 1 flacne, 100 ml 3. Diluente del Campine RT: Sluzine tampnata prnta per l us cntenente anti-igg umane. Cntiene prclin cme cnservante in quantità inferire all 0.05%. 1 flacne, 60 ml 4. Diluente del Cniugat: Sluzine tampnata prnta per l us. Cntiene prclin cme cnservante in quantità inferire all 0.05%. 1 flacne, 40 ml 5. Cntrll IgA e IgM: Sier uman negativ per IgA e IgM anti B. pertussis prnt per l us Cntiene cnservante prclin in quantità inferire all 0.05%. e cnservante Sdi Azide in quantità inferire all 0.1%. 1 fiala, 2 ml 6. Cntrll IgA e IgM: Sier uman psitiv per IgA e IgM anti B.pertussis prnt per l us. Cntiene prclin in quantità inferire all 0.05%. e Sdi Azide in quantità inferire all 0.1% cme cnservanti. 1 fiala, 2 ml 7. Cntrll Cut-Off IgA: Calibratre prnt per l us, cntenente anticrpi umani IgA specifici per B.pertussis, utilizzat per la determinazine del cut-ff. Cntiene prclin in quantità inferire all 0.05%. e Sdi Azide in quantità inferire all 0.1% cme cnservanti. 1 fiala, 2.5 ml 8. Cntrll Cut-Off IgM: Calibratre prnt per l us cntenente anticrpi umani IgM specifici per B.pertussis, utilizzat per la determinazine del cut-ff. Cntiene prclin in quantità inferire all 0.05%. e Sdi Azide in quantità inferire all 0.1% cme cnservanti. 1 fiala, 2.5 ml 9. Cniugat HRP IgA (300X): Cniugat (HRP) anti IgA umane marcat cn perssidasi di rafan (catena specifiche). Cntiene prclin in quantità inferire all 0.05% cme cnservante. 1 fiala, 0.2 ml 10. Cniugat HRP IgM (300X): Cniugat (HRP) anti IgM umane marcat cn perssidasi di rafan (catena specifiche). Cntiene prclin in quantità inferire all 0.05% cme cnservante. 1 fiala, 0.2 ml 11. Substrat TMB: Sluzine prnta per l us. Cntiene 3, 3', 5, 5' Tetrametil-benzidina cme crmgen e perssidasi cme substrat. 1 flacne, 14 ml 12. Sluzine di Arrest: Sluzine prnta per l us. Cntiene H 2 SO 4 1M 1 flacne, 15 ml 13. Cperchi: 1 pezz 14. Istruzini per l us: 1 pezz Materiali Richiesti ma nn Frniti 1. Prvette pulite per la diluizine dei sieri dei pazienti. 2. Flacne di plastica mnus per la diluizine del cniugat HRP cncentrat. 3. Micrpipette reglabili e pipette multicanale (da 5-50, e l) e puntali mnus. 4. Un flacne vlumetric da 1 litr. 5. Un cilindr vlumetric da 50ml. 6. Flacne di lavaggi. 7. Carta assrbente. 8. Vrtex 9. Bagnmaria a 37 C cn cperchi, camera umida sistemata in incubatre a 37 C. 10. Lettre ELISA cn filtri a 450 e 620nm. 11. Acqua distillata bi-deinizzata. Avvertenze e Precauzini Per Us Diagnstic In Vitr 1. Quest kit cntiene sieri umani testati cn tecniche apprvate dalla FDA e risultati negativi ai test per HBsAg e per gli anticrpi HCV e HIV 1 & 2. Piché nessun test può garantire che i prdtti derivati da sangue uman nn trasmettan infezini, tutti i cmpnenti di sangue uman frniti in quest kit devn essere maniplati cme ptenzialmente infettivi, in cnfrmità alle raccmandazini pubblicate nel manuale M233-01I 05-02/12 2
3 CDC/NIH "Bisafety in Micr Bilgical and Bimedical Labratries, 1988". 2. La sluzine di Substrat TMB è irritante per la pelle e le mucse. Evitare il cntatt dirett. 3. Tutti i cmpnenti del kit sn stati calibrati e testati per singl ltt. Si scnsiglia di mesclare cmpnenti da ltti diversi, in quant i risultati ptrebber essere falsati. 4. L acid slfric diluit (1M H 2 SO 4 ) è irritante per gli cchi e la pelle. In cas di cntatt cn gli cchi sciacquare cn acqua e cnsultare un medic. Cnservazine e Scadenza dei Reagenti 1. Tutti i reagenti frniti devn essere cnservati a 2-8 C. Le fiale integre sn stabili sin alla data di scadenza indicata sulla cnfezine del kit. L espsizine a temperatura ambiente dei cmpnenti in cnfezine riginale sigillata per alcune re nn è danns ai reagenti. NON CONGELARE! 2. Il kit ha una durata di 90 girni dp l apertura. 3. Le strisce inutilizzate dev essere ripste nella custdia di allumini cn la carta essiccante, ripiegand il lat apert e sigilland accuratamente cn nastr tutta la lunghezza dell apertura. 4. Durante la cnservazine a fredd la frmazine di cristalli nella Sluzine Tampnata di Lavaggi cncentrata 20x è del tutt nrmale. Scigliere i cristalli prtand la sluzine a 37C prima di diluire. Dp la diluizine la sluzine può essere cnservata fin a 21 girni a 2-8C. Racclta dei Sieri Preparare i sieri da campini asettici racclti cn tecniche standard. Nn utilizzare sieri inattivati cn trattament termic. Si scnsiglia l us di sieri lipemici, trbidi cntaminati. Particelle e precipitati nei sieri ptrebber causare falsi risultati. Questi campini devn essere chiarificati mediante centrifugazine filtraggi prima di effettuare il test. Cnservazine dei Campini I campini devn essere cnservati a 2-8 C e utilizzati entr 7 girni (si raccmanda l aggiunta dell 0.1% di Sdi Azide). Nel cas si preveda la cnservazine per peridi più lunghi aliqutare e cnservare i campini a -20 C. Evitare di cngelare e scngelare i campini più vlte. Prcedura del Test Utilizzare la stessa prcedura per IgA e IgM. A. Preparazine dei Reagenti 1. Prtare tutti i cmpnenti ed i campini clinici da testare a temperature ambiente. Mesclare delicatamente il Cntrll Cut-Off, il Cntrll, il Cntrll ed i campini clinici prima dell us. 2. Determinare il numer di campini da testare. In aggiunta ai campini includere in gni dsaggi i seguenti cmpnenti: un pzzett di Cntrll, un pzzett di Cntrll e due pzzetti di Cntrll di Cut-Off. 3. Estrarre la micrpiastra dalla custdia di allumini, tagliand un lat vicin al sigill. Psizinare il numer di strisce necessarie (a secnda del numer di campini da testare) nel supprt da 96 pzzetti. Le strisce inutilizzate devn essere ripste nella custdia di allumini cn la carta essiccante ripiegand il lat apert e risigilland accuratamente cn nastr su tutta la lunghezza dell apertura. 4. Diluire 1/20 la Sluzine Tampnata di Lavaggi Cncentrata cn acqua bi-deinizzata distillata. Ad esempi, per preparare un litr di sluzine tampnata di lavaggi aggiungere 50ml della Sluzine Tampnata di Lavaggi Cncentrata a 950ml di acqua bideinizzata distillata. B. Incubazine dei campini e dei cntrlli 5. Diluire ciascun campine di sier del paziente 1/100 cn il Diluente del Campine RT frnit cme segue: Aggiungere 10 l di sier del paziente a 190l di Diluente del Campine RT (1/20), e pi diluire ulterirmente aggiungend 25l della sluzine diluita 1/20 a 100l del Diluente del Campine RT. 6. Dispensare 50l di ciascun Cntrll di Cut-Off IgA e/ IgM e 50l del cntrll negativ e psitiv e dei campini diluiti 1/100 in pzzetti separati della piastra. 7. Cprire le strisce cn il cperchi ed incubare per 1 ra a 37 C in una camera umida. 8. Eliminare il cntenut liquid dei pzzetti. 9. Lavaggi: Lavaggi Manuale: Riempire ciascun pzzett fin al brd cn la sluzine tampnata di lavaggi ed eliminare il liquid. Ripetere altre due vlte per un ttale di tre lavaggi. Lavaggi Autmatic: Riempire ciascun pzzett cn 350ul di sluzine tampnata di lavaggi ed eliminare il liquid. Ripetere altre due vlte per un ttale di tre lavaggi. 10. Asciugare le strisce ed il supprt battend delicatamente su carta assrbente. C. Incubazine cn cniugat 11. Diluire il Cniugat HRP anti IgA e/ anti IgM umane immediatamente prima dell us. Diluire il rispettiv cniugat cncentrat HRP anti IgA e/ IgM umane 1/300 cn il Diluente del Cniugat. Ad esempi: per due strisce preparare almen 3 ml di cniugat cme segue: 10 l di Cniugat HRP anti IgA IgM umane cncentrat mesclat cn 3ml di Diluente del Cniugat. 12. Dispensare 50l di Cniugat HRP diluit in ciascun pzzett. 13. Cprire le strisce cn il cperchi ed incubare per 1 ra a 37 C in una camera umida. 14. Eliminare il liquid cntenut e lavare cme descritt ai precedenti punti D. Incubazine cn il Substrat TMB 15. Dispensare 100l di Substrat TMB in ciascun pzzett, cprire cn il cperchi ed incubare a temperature ambiente per 15 minuti. 16. Arrestare la reazine aggiungend 100l di Sluzine di Arrest (1M H 2 SO 4 ) in ciascun pzzett. E. Determinazine dei Risultati 17. Determinare le densità ttiche a 450/620nm e registrare i risultati. La determinazine nn deve superare i 30 minuti dall arrest della reazine crmgena. M233-01I 05-02/12 3
4 Nta: Eliminare eventuali blle d aria prima di effettuare la lettura. Pulire accuratamente il fnd della piastra ELISA. Validazine del Test E necessari rispettare i criteri sttelencati al fine cnsiderare il test valid. Se questi criteri nn vengn rispettati il test deve essere cnsiderat nn valid e deve essere ripetut. 1. DO Cntrll Rapprt DO Cntrll / DO Cut -Off > DO Cntrll < 0.25 Calcl dei Risultati del Test 1. Calclare le densità ttiche medie del dsaggi del Cntrll Cut-Off in duplicat. 2. Per nrmalizzare i risultati ttenuti in test differenti, l indice di cut-ff (COI) è calclat cn la seguente frmula: 3. COI = Assrbanza del campini/ DO media del Cntrll Cut-Off (COC). Interpretazine dei Risultati L interpretazine è valida sia per IgA che per IgM Assrbanza a 450nm DO < COC <1.0 COC DO 1.1xCOC DO >1.1. x COC >1.1 COI Risultati Interpretazine Diagnstica Nessuna Anticrpi indicazine di IgA IgM infezine da nn rilevabili B.pertussis (vedi Limiti del Test) Brderline Prelevare un secnd campine dp 2-4 settimane e testare (Se il secnd campine è brderline il risultat è da cnsiderare negativ). Livelli significativi di anticrpi IgA e/ IgM Indicazine di infezine in att da B.pertussis Interpretazine dei risultati in base al rilevament di anticrpi IgM, IgA e IgG. Brdetella Pertussis IgG IgM IgA Nessun indicazine di infezine da B.pertussis (vedi Limiti del Test) Indicazine di infezine in att Indicazine di infezine recente Indicazine di infezine recente passata di immunizzazine precedente Limiti del Test 1. La diagnsi finale nn deve basarsi sl sul test sierlgic. E necessari prendere in cnsiderazine tutti i dati clinici e di labratri. 2. Campini prelevati trpp prest durante l infezine primaria pssn nn cntenere anticrpi rilevabili. Nel cas di sspetta B.pertussis si deve prelevare un secnd campine dp 2-4 settimane e testare in parallel cn il campine riginale. 3. Nel cas di sspetta infezine in bambini stt i sei mesi di età si deve eseguire un test divers (cltura, PCR) piché questi sggetti raramente sviluppan anticrpi. Per ttenere un prfil cmplet degli anticrpi si dvrebber effettuare i test per tutte e tre leclassi IgA, IgM e IgG. M233-01I 05-02/12 4
5 Caratteristiche Precisine per IgA Precisine IgA intra-saggi: Campine N di Repliche Valre DO medi CV% Precisine IgA inter-saggi: Campine N di Valre CV% Repliche DO medi Precisine per IgM Precisine IgM Intra-saggi: Eurpean Authrized Representative: Obelis s.a. Bulevard Général Wahis 53, B-1040 Brussels Tel: Fax: mail@belis.net Limite di temperatura Cnsultare le istruzini prima dell us Dispsitiv medicdiagnstic in vitr Prduttre Rappresentante eurpe autrizzat Campine N di Repliche Valre DO medi CV% Precisine IgM Inter-saggi: Campine N di Mean DO CV% Repliche Value Bibligrafia 1. Melker H.E. et al., Emerging Infectius Diseases 6(4), Centers f Disease Cntrl 2. Liberti G.E. (editr), Med Sci Bull. 19(3): CDC reprt, February Srug I. et al., Emerging Infectius Diseases 6(5), Centers fr Diseases Cntrl 5. Trllfrs B. et al., Clinical Infectius Diseases 1999; 28; Muller F-M.c. et al., J. Clin. Micr. 1997; 35(10); M233-01I 05-02/12 5
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