AUTOMAZIONE DEI PERCORSI DIAGNOSTICI PER LA DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLA MALATTIA CELIACA. E. Tonutti (Udine)

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1 AUTOMAZIONE DEI PERCORSI DIAGNOSTICI PER LA DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLA MALATTIA CELIACA E. Tonutti (Udine)

2 Flow chart for the diagnosis of of celiac disease ttg IgA + total IgA ttg negative non IgA deficiency STOP ttg IgA positive ttg IgA negative <5 yrs Total IgA deficiency EMA IgA AGA IgA and IgG ttg and AGA IgG negative positive negative positive positive negative haplotype biopsy STOP haplotype biopsy STOP negative positive negative positive control biopsy STOP biopsy

3 Perché le IgA totali? I soggetti con deficit di IgA hanno un rischio relativo di sviluppare celiachia 10 volte superiore alla popolazione normale. Per ciascuna richiesta di a-ttg o EMA dobbiamo escludere il deficit. Su tutti i sieri eseguire il dosaggio delle IgA totali o.

4 IgA totali Individual IgA anti-ttg absorbance values according to the serum total IgA concentration

5 IgA totali Individuato il deficit di IgA anti-ttg IgG e AGA IgG

6 Anticorpi anti-gliadina (AGA) La ricerca per AGA deve essere eseguita utilizzando i nuovi test con peptidi deamidati della gliadina (non devono più essere utilizzati i test con gliadina estrattiva) Gli AGA peptidi IgG presentano una elevata specificità e devono essere utilizzati assieme agli a-ttg IgG per la diagnosi nei deficit di IgA Gli AGA peptidi IgA e IgG hanno un ruolo diagnostico in età pediatrica ed in tutti i casi nei quali a-ttg ed EMA non sono dirimenti o concordanti

7 Authors Method IgA-DGP IgG-DGP IgA-AGA IgG-AGA IgA-tTG IgG-tTG SE SP SE SP SE SP SE SP SE SP SE SP Sugai et al Clin Gastr Hepat 2006 CD 92 Adults Inova Agardh et al. Clin Gastr Hepat 2007 CD 119 Children Inova 91 H 91 P H 86 P H 96 P Niveloni et al. Clin Chem 2007 CD 60 Adults Ankelo et al Clin Exp Immunol 2007 CD 87 Ad. & Chil. Volta et al, Dig Dis Sci CD 128 Adults Korponay-Szabo et al. IPGN 2008 CD 74 Ad & Chil. Inova Homemade Inova Inova Prause et al 2007 CD Children 137 GAF- (3x) Euroim

8 16 pazienti con deficit di IgA e diagnosi istologica di celiachia GAF IgG = 93.7% GLIADINA IgG = 68.7% a-ttg IgG = 87.5%

9 Percorso diagnostico di laboratorio: 1)Test a-ttg IgA su strumento dedicato 2)Dosaggio delle IgA totali con strumento dedicato su tutti i campioni o su quelli selezionati dopo valutazione dei risultati del test a-ttg IgA 3)Se deficit di IgA è necessario rianalizzare il siero per a-ttg IgG e AGA IgG (test con peptidi) RISULTATO: Più prelievi - TAT lungo - iter complesso

10 Nuovo strumento in grado di automatizzare il percorso diagnostico della malattia celiaca: Strumento: IDS ISYS (Immuno Diagnostic Systems) Kit diagnostici per autoimmunità: Bouty- Technogenetics (Progetto CLARA) Processatore random access Sistema analitico: particelle magnetiche adsorbite con antigene specifico Sistema di rilevazione del segnale; chemiluminescenza (estere di acridinio)

11 IDS-iSYS system

12 Sono stati sviluppati i seguenti test diagnostici per celiachia: -Kit per anti-transglutaminasi IgA (antigene ricombinante umano) con possibilità di individuare sieri con deficit di IgA -Kit per anti-transglutaminasi IgG (antigene ricombinante umano) -Kit per anticorpi anti-peptidi deamidati della gliadina IgA e IgG

13 Il test per la determinazione delle IgA totali e degli anticorpi antitransglutaminasi IgA è il core diagnostico del processo

14 Una fase solida costituita da microparticelle sensibilizzate con l antigene transglutaminasi addizionate con microparticelle sensibilizzate con anticorpi monoclonali anti-iga umane. Nella seconda fase di reazione si utilizza un tracciante costituito da anticorpi monoclonali anti-iga umane marcati. Nei campioni non contenenti anticorpi IgA anti-t- Transglutaminasi la risposta varia esclusivamente in funzione della concentrazione di IgA totali presenti nel campione.

15 Per eliminare la possibile misclassificazione dei campioni a causa della risposta aggiuntiva generata dalla concentrazione di IgA, la quantità di microparticelle anti-iga aggiunte nel sistema di reazione è stata studiata in modo da fornire una curva di calibrazione sensibile in presenza di basse concentrazioni di IgA ma a saturazione in presenza di normali o alte concentrazioni di IgA totali. Per la normalizzazione delle risposte ottenute e per la loro interpretazione è stata elaborata una curva standard in grado di raccordare le risposte ottenute con ambedue le microparticelle.

16 ANTI t-transglutaminase IgA CLARA Total IgA and anti-ttg IgA Standard Curves Cut off a-ttg IgA 10 UA/mL UA/mL RLU mg/dl IgA 2.9 UA/mL mg/dl IgA 25 mg/dl IgA Cut off IgA: se <17000 RLU scatta il test reflex per a-ttg IgG e AGA IgG UA/mL

17 ANTI t-transglutaminase IgA CLARA Negative Samples RLU UA/mL

18 Il percorso diagnostico su IDS ISYS avviene in questo modo: I sieri vengono caricati sullo strumento; su ciascun siero possono essere eseguiti uno o più parametri (es: nei bambini < 5 anni: a-ttg IgA e AGA peptidi IgA e IgG) Il test per a-ttg IgA è strutturato in modo da dosare anche le IgA totali La macchina fornisce i risultati e su tutti i test per a-ttg IgA seleziona quelli con valori di RLU < ad una soglia compatibile con deficit di IgA. Su questi sieri il software dello strumento fa eseguire i test reflex a-ttg IgG e AGA peptidi IgG.

19 Studio per la valutazione del sistema analitico, dei test e del sistema reflex: 40 sieri di soggetti con prima diagnosi di celiachia 15 sieri di soggetti con deficit di IgA (6 celiaci) 29 sieri di soggetti celiaci in dieta (3-35 mesi) 60 soggetti non celiaci Su tutti i sieri sono stati eseguiti i 4 test a-ttg IgA e IgG e AGA peptidi IgA e IgG Clara per correlare i risultati con a-ttg IgA e IgG Orgentec e AGA peptidi IgA e IgG INOVA Simulazione di una seduta per la ricerca di a-ttg IgA con sistema reflex per AGA IgG e a-ttg IgG sui sieri con valori di IgA < 25 mg/dl.

20 CLARA SYSTEM: comparison with ELISA A-tTG IgA UA/mL CLA y = 1,9336x + 5,1948 R 2 = 0, U/mL ELISA (Orgentec)

21 CLARA SYSTEM: comparison with ELISA A-tTG IgG UA/mL CLA y = 2,3747x - 11,16 R 2 = 0, U/mL ELISA (Orgentec)

22 CLARA SYSTEM: comparison with ELISA AGA peptidi IgA y = 1,1181x - 10,435 R 2 = 0,88 UA/mL CLAR U/mL ELISA (INOVA)

23 CLARA SYSTEM: comparison with ELISA AGA peptidi IgG y = 0,8519x - 3,662 R 2 = 0, UA/mL CLAR U/mL ELISA (INOVA)

24 Celiaci 1 a diagnosi n 40 Sensibilità Celiaci in dieta n 29 Sensibilità Deficit di IgA (6 cel.) n 15 Sensibilità Controlli n 60 Specificità a-ttg IgA Clara 100% 79.9% 0% 100% a-ttg IgA Orgentec 97.5% 51.7% 0% 100% a-ttg IgG Clara 57.5% 27.5% 46.6% 100% a-ttg IgG Orgentec 60% 13.8% 46.6% 100% AGA IgA Clara 77.5% 20.7% 0% 100% AGA IgA INOVA 77.5% 24.1% 0% ND AGA IgG Clara 70% 24.1% 40% 96.6% AGA IgG INOVA 72.5% 31.3% 33.3% ND

25 Concordanza 40 pazienti celiaci alla diagnosi A-tTG IgA A-tTG IgG Orgentec + Orgentec - Orgentec + Orgentec - Clara Clara Clara Clara AGA IgA AGA IgG INOVA + INOVA - INOVA + INOVA - Clara Clara Clara Clara

26 Concordanza 15 deficit di IgA (6 diagnosi di celiachia) A-tTG IgA A-tTG IgG Orgentec + Orgentec - Orgentec + Orgentec - Clara Clara Clara Clara AGA IgA AGA IgG INOVA + INOVA - INOVA + INOVA - Clara Clara Clara Clara - 0 9

27 Concordanza 29 pazienti celiaci in dieta (3-45 mesi) A-tTG IgA A-tTG IgG Orgentec + Orgentec - Orgentec + Orgentec - Clara Clara Clara Clara AGA IgA AGA IgG INOVA + INOVA - INOVA + INOVA - Clara Clara Clara Clara

28 La procedura di utilizzo dello strumento IDS impostato con i test reflex (a-ttg IgG e AGA IgG) ha dimostrato una corretta individuazione di tutti i 15 sieri con deficit di IgA e la conseguente esecuzione dei test reflex. Il valore in mg/dl di IgA dosato per ciascuno dei 15 sieri con deficit è stato il seguente:

29 N IgA mg/dl 657 2, , , , ,0 084L 2, ,5 136L 4, , , , , , , ,7

30 CONCLUSIONI I kit diagnostici Technogenetics Clara per a-ttg e AGA peptidi IgA e IgG forniscono ottime performance diagnostiche. Lo strumento IDS Isys è in grado di fornire una risposta di completa automazione al laboratorio di autoimmunologia L algoritmo sviluppato su IDS Isys è in grado di coprire l iter diagnostico della malattia celiaca riducendo costi e tempi di refertazione L efficienza del sistema IDS può portare ad una migliore qualità diagnostica per l inquadramento della celiachia

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