ABI PRISM 7900 MANUALE D USO

Transcript

1 MANUALE NLM 5750 VER TOTALE PAGINE 10 DX001 ABI PRISM 7900 MANUALE D USO NUCLEAR LASER MEDICINE S.r.l. UFFICI OPERATIVI: Viale delle Industrie, SETTALA MI (Italy) Tel (+39) 02/ Fax (+39) 02/ SITO INTERNET: info@nlm.it Pagina MQI di 10

2 PROTOCOLLO PER CHIMICA FRET Accendere il PC e lo strumento ABI Prism 7900; aprire il programma SDS 2.3. Aprire File, quindi New. Si apre una finestra; alla voce Assay selezionare Standard Curve (AQ), alla voce Container selezionare 96 Wells Clear Plate e alla voce Template selezionare Blank Template. Dare OK. A) IMPOSTAZIONI DELLA PIASTRA Nella parte destra della pagina (in modalità setup in alto) selezionare alla voce passive reference: None. Selezionare Add Detector; nella sottopagina che si apre selezionare New e aggiungere il fluoroforo ROX alle voci Name e Reporter e lasciare NON FLUORESCENT alla voce Quencher. Dare OK. Selezionarlo e cliccare Copy To Plate Document e Done; si torna così alla pagina iniziale. Selezionare le posizioni utilizzate per la seduta nella piastra (alla sinistra della pagina) e associare il fluoroforo, spuntando con una X alla voce USE. Se non si utilizza tutta la piastra per la seduta, selezionare i pozzetti che non vengono utilizzati ed escluderli dall analisi attivando la casella OMIT WELLS (controllare che solo i pozzetti che si vogliono escludere dall analisi siano barrati da una croce rossa. Questa operazione velocizza la seduta in quanto accorcia i tempi di lettura della fluorescenza; solo i pozzetti che interessano vengono letti e non tutta la piastra). Selezionare quindi ogni pozzetto nella piastra associato all analisi e assegnargli un nome alla voce Sample Name. Indicare anche alla voce Task il tipo di campione che si analizza in quella determinata posizione: es. per un controllo negativo come l acqua selezionare NTC, per i campioni lasciare Unknown. Pagina 2 di 10

3 B) PROFILO TERMICO Lasciare la parte Setup e passare alla parte Instrument (sempre in alto nella parte destra). Compaiono tre sottopagine: Thermal Cycler, Real Time e Queue. Selezionare Thermal Cycler, quindi nel campo Mode scegliere Standard e inserire 25μl come Sample volume. Alla voce Thermal profile impostare il profilo termico come segue: Alla voce Auto Increment lasciare 0, alla voce Rampe Rate lasciare 100% per tutti i passaggi di amplificazione, mentre per la melting impostare 5% nella casella vicino agli 80 C finali. Alla voce Data Collection impostare l acquisizione del segnale di fluorescenza solo in fase di anneling nei cicli di PCR (deselezionando col mouse le eventuali altre acquisizioni impostate di default dallo strumento) e nella fase di melting. Selezionare quindi Real-Time. Se l Instrument Status risulta disconnesso, cliccare Connect to Instrument ed aspettare la connessione. Una volta avvenuta ed in modalità Idle, selezionare Open/close ed aspettare l apertura della porta e la fuoriuscita del supporto meccanico per l inserimento della piasta (se così non fosse, ripetere l operazione open/close fino alla fuoriuscita del supporto). Lo strumento è quindi pronto per lavorare. Lasciare in standby (Idle) e preparare la piastra con i campioni e la mix. Una volta preparata la piastra, sigillarla con la specifica pellicola adesiva (Micro Amp Optical Adesive Film PCR Compatible della Applied Biosystem) facendo attenzione a non creare bolle d aria. Centrifugare la piastra qualche secondo per eliminare eventuali bolle nei pozzetti che potrebbero falsare la lettura. Mettere il tappetino Applied Biosystem sulla piastra (con il lato grigio verso il basso e a diretto contatto con la pellicola adesiva) e quindi posizionare la piastra sul supporto dello strumento (con la posizione A1 in alto a sinistra) Premere Start per cominciare. Lo sportello si chiuderà autonomamente. Salvare la seduta in una cartella di lavoro a piacere. La seduta viene completata in circa 2 ore. Pagina 3 di 10

4 C) ANALISI DEI DATI Selezionare Analysis Analysis Setting e nella sottopagina Detector lasciare Automatic CT quindi cliccare OK. Passare all analisi dei dati: nella pagina Results compare l Amplification Plot Controllare che nella casella Detector sia selezionato il canale Fret; nella casella Plot selezionare Rn vs. Cycle per vedere la curva di amplificazione Pagina 4 di 10

5 Nella pagina Dissociation Curve compaiono le curve di melting Selezionare nelle caselle Detector Fret Plot Derivative Analizzare la curva di dissociazione per ogni campione cliccando sui pozzetti della piastra. Per ogni campione assegnare il corretto genotipo come riportato in metodica in base al numero e alle temperature dei picchi visualizzati. Questa operazione va eseguita manualmente per ogni singolo campione. Questa metodica è scaricabile dal sito NLM. Per scaricarla seguire: Pagina 5 di 10

6 MANUAL NLM 5750 VER TOTAL PAGES 10 DX001 ABI PRISM 7900 OPERATOR S MANUAL NUCLEAR LASER MEDICINE S.r.l. HEAD OFFICE: Viale delle Industrie, SETTALA MI (Italy) Tel (+39) 02/ Fax (+39) 02/ WEB: info@nlm.it Pagina MQE di 10

7 PROTOCOL FOR FRET PROBES CHEMISTRY Turn on the PC and the ABI PRISM 7900; open the program SDS 3.2. Open File New; for the Assay, select Standard Curve (AQ), for Container, select 96 Wells Clear Plate and for Template, select Blank Template. Click OK. A) PLATE LAY OUT Move into the settings page of the instrument. On the right side of the page (mode setup on top) for Passive Reference select None. Click Add Detector, select New and add for Name and Report the fluorophore ROX; select for Quencher NON FLUORESCENT; Click OK. Select the fluorophore and click Copy To Plate Document and Done. Return to home page. On the left of the page select the fluorophore for each position used in your plate, selecting with an X where it appears USE. If you do not use the whole plate, deselect the wells you don t want to use, and exclude them from analysis selecting OMIT WELLS (check that only the wells you wish to exclude from analysis are selected by a red cross. This operation speeds up the session as shortens the time for reading the fluorescence; only the wells of interest are read and not the whole plate). Assign a name to your samples selecting Sample Name. For Task, indicate the type of sample that is analyzed in that particular position: e.g. for a negative control select the NTC; for the samples, leave Unknown. Pagina 7 di 10

8 B) THERMAL PROFILE Select Instrument (always at the right top of the page). There are three sub pages: Thermal cycler, Real Time and Queue. Select Thermal cycler, and then mode, choose standard and add 25μl to sample volume. Under Thermal rofile set the RT-PCR profile as follows: For Auto Increment leave 0, leave the ramp Rate to 100% for all steps excluding Melting Curve where you have to set 5% at 80 C. For Data Collection set the acquisition of the fluorescence at the annealing step of PCR cycles and at the Melting Curve (deselecting any other acquisition option, selected by default). Select Real-Time. If the Instrument Status is disconnected, click Connect to Instrument and wait for the connection. Once in Idle mode, click Open/close and wait for the opening of the door and the release of the mechanical support for introducing the plate (if not, re-select Open/close until the escape of the support). The instrument is now ready to work. Leave it in Standby mode (Idle) and prepare the plate with samples and mix. When the plate is ok, seal the plate with the specific adhesive film (Micro Amp Optical Adesive Film PCR Compatible della Applied Biosystem); avoid leaving air bubbles under the film. Centrifuge the plate few seconds to remove any bubbles in the wells, that could inhibit the detection. Place the pad Applied Biosystem (with the gray side down and direct contact with the plate) over the plate and then both on the support of the instrument (with position A1 in the upper left). Press start to begin. Save the session in a workbook. The session will take about 2 hours. Pagina 8 di 10

9 C) DATA ANALYSIS Click on Analysis Analysis Setting and set Automatic CT. Click Apply and OK. Go to Analysis of data: the Amplification Plot appears on the Results page Select Fret as Detector and Rn vs. Cycle as Plot Pagina 9 di 10

10 The Melting Curve appears on the page Dissociation Curve Analyze the Melting Curve for each sample selecting the wells of the plate. For each sample mark the correct genotype based on the number and temperature of peaks as reported in the assay manual. This operation has to be done manually for each sample. Download these instructions for use from the NLM website: Pagina 10 di 10