Valutazione degli effetti della terapia antiretrovirale combinata sulla produzione di nuovi linfociti B e T in pazienti infetti da virus HIV-1
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- Niccolina Liliana Lupi
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1 Valutazione degli effetti della terapia antiretrovirale combinata sulla produzione di nuovi linfociti B e T in pazienti infetti da virus HIV-1 relatore: Dr. Federico Serana medico specializzando presso: Laboratorio di Biotecnologie, Spedali Civili di Brescia Università degli Studi di Brescia (scuola aggregata a Università degli Studi di Milano)
2 Introduzione La caratteristica principale dell infezione da HIV-1 è la perdita dei linfociti CD4+ L infezione determina anche deficit di linfociti B memoria e alterata produzione anticorpale La terapia antiretrovirale combinata è molto efficace nel sopprimere la viremia, ma livelli normali di linfociti si ristabiliscono solo in una parte dei pazienti
3 Un efficace immunoricostituzione si basa sulla generazione di nuovi linfociti T o B naïve con un specificità recettoriali diverse
4 Un efficace immunoricostituzione si basa sulla generazione di nuovi linfociti T o B naïve con un specificità recettoriali diverse DNA linfociti progenitori V J C DNA linfociti maturi Soggetto sano T Cell Receptor a chain T Cell b chain
5 Diversità immunologica Repertorio linfocitario eterogeneo Espansioni clonali per output timico ridotto Ripristino della timopoiesi e della eterogeneità del repertorio Soggetto sano Paziente HIV in terapia antiretrovirale?
6 Scopo del lavoro Valutare con un unico test di laboratorio la produzione di nuovi linfociti B e T come marker di immunoricostituzione efficace in un gruppo di pazienti trattati con terapia antiretrovirale combinata da 7 anni La maggior parte degli studi sull immunoricostituzione T long-term sono follow up di durata 3 anni Pochi dati disponibili sulla ricostitutuzione B in pazienti trattati a lungo termine, anche per la mancanza di metodi adeguati
7 Metodi Real Time PCR per la quantificazione di TRECs e KRECs 5 Vk Vk-Jk Jk 3 Ek Ck iek KDE 3 Ig k-light chain gene sj Real Time PCR: amplification with primers and probe detecting the signal joint (sj) KREC episome cell death naive B cells Duplex Real Time PCR for the simultaneous differentiation/proliferation absolute quantification leading to: precursors/immature B cells KRECs/ml TRECs/ml
8 Metodi Curva standard con diluzioni di plasmide a tre inserti (Sottini et al., Clin Immunol. 2010) TREC KREC VANTAGGI del TRIPLO PLASMIDE: Diluizione di una sola curva standard e riduzione errori di quantificazione del DNA Gene target e gene di riferimento presenti in rapporto 1:1 Contemporanea amplificazione TRECs-KRECs
9 Metodi Analisi citofluorimetrica delle sottopopolazioni B e T KREC+/TREC+ Immature Memory switched Memory unswitched Cellule B immature: CD19+ CD10+ Naive Linfociti CD4+ naive: CD45RA+CCR7+ CM Naive RTE E M Recent Thymic Emigrants: Linfociti CD4+ naive CD31+
10 Pazienti 36 HIV+ trattati con terapia antiretrovirale T0 T6 T12 T72 22 HIV+ non trattati Males 32 (88.9) (77.3) - Age (years) 39 (35-45) (33-43) - Risk factors for HIV: Heterosexual 20 (55.6) (31.8) - P-value* Homo/bisexual 10 (27.8) (45.5) - IDVU 3 (8.3) (22.7) - Other/unknown 3 (8.3) (0) - CD4 + T cells (cells/µl) 258 ( ) 377 ( ) 419 ( ) 688 ( ) 538 ( ) < CD8 + T cells (cells/µl) 754 ( ) 781 ( ) 753 ( ) 707 ( ) 757 ( ) - CD4 + /CD8 + T-cell ratio 0.3 ( ) 0.5 ( ) 0.6 ( ) 0.8 ( ) 0.7 (0.5-1) < HIV RNA (copies/ml) ( ) < 50 (50-50) < 50 (50-50) < 37 (37-37) ( ) <0.01
11 logkrecs/ml logtrecs/ml Risultati 6 5 KRECs: produzione di nuovi linfociti B p < 0.01 p < 0.01 p < 0.05 p < 0.05 p < 0.05 p < 0.05 p < TRECs: produzione di nuovi linfociti T p < 0.01 p < p < p < 0.05 p < p < 0.05 p < Time T0 points: T6 Trattati T12 T72 HIV CTRL Non trattati 0 Time points: T0 T6 T12 T72 Trattati HIV CTRL Non trattati La terapia induce una riduzione dell output midollare (linfociti B) e un incremento di quello timico (linfociti T)
12 % of CD19 + cells % of CD4 cells % of CD4 + CD45 + CCR7 + cells Risultati Linfociti B Immaturi Linfociti CD4+ naive Recent Thymic Emigrants Trattati T72 Non trattati CTRL 0 Trattati T72 Non trattati CTRL 0 Trattati T72 Non trattati CTRL
13 CD4 + cells/ml p < logtrecs/ml p < Risultati Pazienti divisi sulla base del livello iniziale critico di CD4+ <200/uL Conta totale linfociti CD4+ TRECs: produzione di nuovi linfociti T T0 T6 T12 T72 1 T0 T6 T12 T72 Tempo di follow up in paz trattati Tempo di follow up in paz trattati
14 Risultati Regressione Multivariata Variabili indipendenti HIV RNA al T0 CD4/CD8 al T0 Durata dell infezione (anni) Variazione da T72- T0 KRECs/mL n.i. 22% minor diminuzione per ogni 0.10 in più di rapporto 23% diminuzione in più / ogni anno in più di malattia Variazione da T72- T0 TRECs/mL 38% minor aumento per ogni logaritmo in più di viremia n.s. 14% minor aumento / ogni anno in più di malattia Una maggior durata di malattia determina una più rapida diminuzione dei KRECs e un ridotto aumento dei TRECs
15 Conclusioni La terapia antiretrovirale combinata determina effetti opposti sulla ricostituzione B e T, che sembrano essere correlati alla durata di malattia prima del trattamento (iniziare più precocemente?) Il test combinato per la quantificazione simultanea di TRECs e KRECs è una metodica adatta alla valutazione della ricostituzione del sistema immunitario che potrebbe essere usata per il monitoraggio di routine dei pazienti HIV+
16 Spedali Civili di Brescia Laboratorio di Biotecnologie Grazie!
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