SUPPORTO DIAGNOSTICO IN APICOLTURA, INDAGINI DI LABORATORIO PER LA DIAGNOSI DI VIROSI E NOSEMA SPP. -(DATI PRC )-

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1 SUPPORTO DIAGNOSTICO IN APICOLTURA, INDAGINI DI LABORATORIO PER LA DIAGNOSI DI VIROSI E NOSEMA SPP. -(DATI PRC )- Brisighella, 13 settembre 2013 Frasnelli Dr. Matteo IZSLER Sezione di Ravenna

2 VIROSI e NOSEMA SPP. Introduzione - Campionamento, Strumenti diagnostici PRC Obiettivi -Risultati -Osservazioni CONCLUSIONI RICERCA Senotainia tricuspis

3 Conosciuti 19 tipi di virus. Virus Più importanti e conosciuti (es. DWV, ABPV,CBPV, SBV, BQCV). Manifestazione cliniche scarse, forme inapparenti e latenti. Disordini di varia natura rottura dell'equilibrio di forza delle famiglie, sintomatologia e mortalità. -PMS ParasiticMite Syndrome (quadro patologico ad eziologia virale associato all azione di Varroadestructorsulla covata).

4 Nosema spp. Malattia dell ape adulta causata da un microsporidio(fungo unicellulare). Apis mellifera: è interessata da 2 diverse specie di Nosema: - N. apisen. ceranae. La sintomatologia nelle famiglie colpite dai 2 patogeni è completamente diversa. La presenza di spore di N. ceranaenell intestino di api èevento frequente e non associato a malattia clinica. N.ceranae assenza di diarrea.

5 Campionamento/campioni Materiale Metodo di analisi Quantità Api Microscopico, microbiologico, M.E., biomolecolare api 300 api (30 g) Covata Microbiologico, M.E., biomolecolare 5-10 g Miele Microscopico, biomolecolare g Favo Microscopico, microbiologico, M.E., biomolecolare Intero o porzione di 20X20 cm

6 Conservazione del campione MATERIALE CONTENITORE ES.VIROLOGICI* ES.MICROBIOLOGICI/ PARASSITOLOGICI Api Plastica (barattolo, busta, provetta) Congelare -20 C Refrigerare* (24-48 ore) Congelare Favo/covata Plastica (barattolo, busta, provetta) Congelare -20 C Refrigerare* (24-48 ore) Congelare Parassiti Plastica (barattolo, busta, provetta) Congelare -20 C Refrigerare* (24-48 ore) Etanolo+glicerolo *Materiali/matrici prelevate in buono stato

7 Diagnosi Virosi e Nosema spp. Virus: M.E., ImmunoElettronMicroscopia(IEM) e sandwich MAb-ELISA Uso della PCR con sue varianti. (MultiplexPCR, RT-PCR Real time, qrt-pcr Real time, immunocapture PCR) Nosemaspp.: PCRper tipizzazionenosemaspp. Contaspore

8 RICERCA (PRC ) OBIETTIVI DEL PROGETTO MESSA A PUNTO DI METODICHE BIOMOLECOLARI (RT-PCR) PER LA RICERCA DI VIRUS DELLE API IN PARTICOLARE: -Virus delle ali deformate(dwv-defoemed wing virus) -Virus della paralisi acuta(abpv- Acute paralysis bee virus) -Virus della paralisi cronica(cbpv- Chronic bee paralysis virus) -Virus Kashmir( KBV-Kashmir bee virus) -Virus della cella reale nera (BQCV-Black queen cell virus) -Virus della covata a sacco (SBV-Sacbrood virus) -Virus israeliano della paralisi acuta (IAPV-Israeli acute paralysis virus) VERIFICA DELLA PREVALENZA DI VIROSI NEGLI APIARI DEL TERRITORIO. VALUTAZIONE DEI RISULTATI AL FINE DI CONOSCERE LA RILEVANZA DELLE VIROSI QUALE FATTORE DI RISCHIO PER GLI APIARI DEL TERRITORIO.

9 Campione api CAMPIONE DI API PRELEVATE IN POOL E PREVALENTEMENTE MORTE E ALL ESTERNO DELL ALVEARE ESAMINATE ALMENO 30 API PER APIARIO DALL OMOGENATO E FILTRATO DEL CAMPIONE: - Nosema spp. - PA e PE - Virus

10 Schema operativo 30 api + 10 ml di soluzione fisiologica Omogeneizzazione in mortaio sterile Filtrazione con sacchetti per omogeneizzazione sterili con filtro 180x310 mm spessore 80 Um, Neomed Srl 230 µl: estrazione RNA con kit RNeasy QIAGEN Retrotrascrizione con kit GoScript Reverse Transcription System PROMEGA cdna PCR DWV SBV BQCV ABPV CBPV KPV IAPV

11 Schema operativo per altre tipologie di campioni nel caso di larve, pupe e propupeomogeneizzati 30 esemplari quando presenti; nel caso di tarma della ceraomogeneizzate dopo pesata delle tarme; nel caso divarroadestructoromogeneizzate possibilmente 20 Varroae, altrimenti almeno 5; nel caso sia campionato un favone preleviamo una porzione che viene omogeneizzata con soluzione fisiologica in sacchetti per omogeneizzazione sterili con filtro (180x310 mm spessore 80 UmNeomedSrl).

12 Titolazione del Virus Data l importanza del titolo virale nel determinare o meno i quadri clinici degli alveari (campioni con carica virale superiore a 10 milioni di copie dovrebbero indicare anche una infezione sintomatica) è stata inoltre sviluppata una RT-PCR Real time di tipo quantitativo (qrt-pcr Real time) che permette di rilevare e quantificare i virus presenti in campioni di Apis mellifera. È stata messa a punto per i seguenti virus: DWV, ABPV E CBPV.

13 RISULTATI Nosema ceranae % TOT. N. apiari controllati Apiari % pos. 51,5 (17/33) 53,2 (25/47) 81 (17/21) 58,4 (59/101) - Presenza solo di Nosema ceranae - Mai segnalata sintomatologia

14 Nosema ceranae Livelli di infezione APIARIO/2013 PERIODO PRELIEVO PCR NUMERAZIONE SPORE 3 7/2 P * 5 6/3 P * 8 28/3 P /4 P /4 P * 15 16/4 P * 16 19/4 P /4 P *

15 VIRUS IN APIARI PCR Numero di APIARI POSITIVI per Virus % Positivi POSITIVI per 2 o più virus % Positivi ,5 % 84 77,8%

16 N.APIARI Prevalenze Virus ricercati PCR % DWV % BQCV % SBV % ABPV % CBPV % IAPV % KBV ,3 (81/109) ,5 (32/105) ,7 (35/105) 22,4 (24/107) ,8 (57/108)

17 VIROSI - Prevalenze a confronto APENET NAZIONA LE (Moduli di rilevamento, in linea di massima uno per ciascuna Regione e Provincia Autonoma formati da 5 apiari di 10 alveari ciascuno) BQCV (72%) DWV (67%) SBV (36%) ABPV (19%) CBPV (8%) KBV (0,8%) IAPV (0,4%) APENET VENETO BQCV (85%) DWV (68%) SBV (28%), ABPV (13%), CBPV (6%) KBV (0%) IAPV (0%) PRC IZSLER DWV (74%) SBV (53%) BQCV (31%) ABPV (33%) CBPV (22%) KBV (0%) IAPV (0%)

18 Virus Boll. Bee-Net 2012

19 CONROLLO SU FAMIGLIE SORVEGLIANZA MORTALITA SU NUCLEI DI 2 APIARI CON PRELIEVI PROGRAMMATI IN 3 PERIODI DIVERSI (AUTUNNO/INVERNO-PRIMAVERA- ESTATE): Nosema spp. (PCR) VIROSI (PCR)

20 APIARIO 1 Nosema ceranae STAGIONE FAMIGLIE AUT./INV PRIM. - + (1,8 mil.) EST. - orf ( ) AUT./INV. : 0% nuclei PRIM. : 11,1% nuclei EST. : 11,1% nuclei (+) in tutte le stagioni: 0% nuclei

21 APIARIO 2 Nosema ceranae STAGIONE FAMIGLIE AUT./INV PRIM EST. - nd - + (1,4 mil.) (1,6 mil.) ( ) AUT./INV. : 0% nuclei PRIM. : 0% nuclei EST. : 27,3% nuclei (+) in tutte le stagioni: 0% nuclei

22 Nosema ceranae Nosemaspp.: positività evidenziata solo in un arnia (n.2) nel secondo prelievo (primaverile) e solo in apiario 1. La conta è risultata pari a spore/ape. Tale arnia verrà eliminata perché orfana. Nel prelievo estivo in apiario 1 presenza di positività in arnia n.5 con conta di spore/ape, in arnia n.10 con conta di spore/ape ed in arnia n.11 con conta di spore/ape. Nell apiario n.2 compare per la prima volta positività in estate in 3 arnie (4 (conta spore 1,4 mil.),7(conta spore 1,6 mil.),11(conta spore )), infestazione di livello medio con percentuale quindi di positività che passa dallo 0 al 27,3%

23 Virus APIARIO 1 Coinfezioni STAGIONE FAMIGLIE AUT./INV PRIM EST. + nd AUT./INV. : 44,4% nuclei PRIM. : 22,2% nuclei EST. : 100% nuclei (+) in tutte le stagioni: 22,2% nuclei

24 Virus APIARIO 2 Coinfezioni STAGIONE FAMIGLIE AUT./INV PRIM nd + EST. - nd AUT./INV. : 27,3% nuclei PRIM. : 54,5% nuclei EST. : 80,0% nuclei (+) in tutte le stagioni: 9,1% nuclei

25 COINFEZIONI DA VIRUS IN APIARI APIARIO 1: per i seguenti virus (DWV, SBV e BQCV) APIARIO 2: per i seguenti virus (DWV, SBV, BQCV, ABPV, CBPV).

26 PREVALENZE DI DWV, SBV, BQCV /stagione %VIRUS-APIARIO AUT./INV. PRIM. ESTATE DWV DWV SBV SBV BQCV BQCV

27 Titolazione virale DWV APIARIO 1: LA % DI FAMIGLIE CON TITOLAZIONI DI VIRUS ELEVATE NEL PERIODO INVERNALE E DELL 11,1% (1/9) (ARNIA N.8) CON TITOLAZIONE DI COPIE GENOMA/APE APIARIO 2: LA % DI FAMIGLIE CON TITOLAZIONI DI VIRUS ELEVATE NEL PERIODO INVERNALE E DEL 41,7%(5/12) (ARNIE N ) CON TITOLAZIONE > FINO A > COPIE GENOMA/APE.

28 ABPV E CBPV Apiario 1-2 (ABPV) La prevalenza di infezione evidenziata in Real-time (7/9) è del 77,8%. (CBPV) La prevalenza di infezione evidenziata in Real-time (5/9) è del 55,5%. APIARIO 1 (ABPV) La prevalenza di infezione evidenziata in Real-time (1/12) è del 8.3%. (CBPV) La prevalenza di infezione evidenziata in Real-time (6/12) è del 50%. APIARIO 2

29 Apiario 1 NUCLEI PCR DWV BQCV SBV IAPV KBV CBPV ABPV P19282 N N N N N N103 P N N N N N3390 N0 orf orf orf N N N N N N0 N36 N6030 N N N N N309 N0 p p p n n n n P P P N N N1340 N69 P N N N N N N p> p p n n P 530 P 3450 P P P N N N0 N225 P N P N N N N p40000 p p n n P 490 P 9350

30 Apiario 2 PCR DWV BQCV SBV IAPV KBV CBPV ABPV P N N N N N0 N0 n0 / /. nd P 2380C n0 p n p N N n n P N N N N N0 N0 P P P N N N N p n p N N n41700 n6160

31 Osservazioni Tecniche biomolecolari utilizzate: PCR buona sensibilità per DWV BCQV, SBV. In caso di casi clinici la ricerca eseguita per Virus sospettato ha dato esito positivo con conferma poi in qrt-pcr Real time (es. ABPV >10 mil. copie genoma/individuo; es. CBPV sola positività evidenziata tra tutte le virosi analizzate) Tra Nosemaceranaee Virus non si sono evidenziate particolari correlazioni negative, del resto le conte sui campioni positivi è risultata molto bassa. Nel periodo estivo sia le prevalenze di infezioni che le coinfezioni aumentano sensibilmente pur in apiari con tassi di infestazione da Varroa molto bassi in autunno. Da approfondire e valutare il significato delle titolazioni virali (DWV, ABPV, CBPV) eseguite nel periodo autunnale, relativamente allo stato sanitario/tasso di mortalità stagionale della famiglia.

32 CONCLUSIONI MESSA A PUNTO TECNICHE BIOMOLECOLARI IN PARTICOLARE L APPLICAZIONE DELLA qrt-pcr Real time UTILIZZO PER CONFERMA SOSPETTO DIAGNOSTICO POSSIBILE SVILUPPO IN CAMPO DIAGNOSTICO PER ALTRE VIROSI SIGNIFICATIVE E STUDI EPIDEMIOLOGICI PRC Nosema ceranae e N.apisSTRUMENTO PER DIAGNOSI DIFFERENZIALE

33 SENOTAINIA TRICUSPIS Mosca parassita delle api mellifiche Ricercata già dal 1997 in diverse Regioni italiane (Giusti M., Felicioli A., Apicoltore italiano n.2 febbraio-marzo 2012) La femmina del dittero depone in volo una larvettasul dorso dell ape quindi la larva penetrerà nel corpo dell ape colpita si ciberà di questa portandola a morte Una mosca di Senotainiatricuspiscontiene nel suo utero bilobato più di 600 piccole larve

34 DATI PRELIMINARI RICERCA S.T. Inizio monitoraggio 5/2013 in corso 9/2013 Conferimenti n.18 (cioè 18 APIARI) Campioni esaminati 22 CAMP.POSITIVI 7 (APIARI POS. 6) LIVELLI DI INFESTAZIONE: MINIMO 0.8%, MASSIMO 42% LARVE PUPE E MOSCHE IN TIPIZZAZIONE!!!!

35 Apiari positivi rilevati e % infestazione N. Località data api larve % infestazione 1 Faenza Corso Europa 2 Russi Via Cacciaguerra 3 Faenza Via Rinaldi 4 RA S.Antonio 25/ ,7 6/ , ,3 13/ ,8 6/ RA Mezzano 6/ RA Mezzano 6/

36 Larve Senotainiaspp.?

42 Pupe Senotainiaspp.?

43 Pupe Senotainiaspp.?

44 Pupe Senotainia spp.?

45 Pupe Senotainia spp.?

46 Adulto Senotainiatricuspis

47 Elenco U.O. PRC ) U.O.: 1 IZSLER SEZ. Ravenna 2) U.O.: 2 IZSLER Reparto Virologia Brescia 3) U.O.: 3 IZSVE CENTRO DI REFERENZA NAZIONALE PER L APICOLTURA Un Grazie particolare alla Dr.ssa Corazzari Valentina e Magrini Marco (BORSISTI DEL PROGETTO)