Primo modello:il Knock-out. Secondo modello:transgenico classico

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1 Il gene p53 è stato il primo oncosoppressore ad essere identificato e venne descritto per la prima volta nel Originariamente si credeva che si trattasse di un oncogene ma nei dieci anni successivi alla sua scoperta, tramite studi genetici e funzionali, si definì il suo ruolo di soppressore tumorale. Tale gene risulta non correttamente funzionale nella maggior parte dei tumori umani,nella metà dei quali si presenta direttamente inattivato da mutazioni e in molti altri indirettamente inattivato dal legame con proteine virali o da alterazioni di geni i cui prodotti interagiscono con l oncosoppressore. Tali risultati relativi al ruolo preponderante di p53,comune denominatore dei tumori umani,ha stimolato la ricerca dal 1989:ad oggi si contano circa pubblicazioni centrate su questo oncosoppressore e pare siano state identificate circa mutazioni associate al cancro in vari organismi. L analisi in vitro ha permesso di determinare le varie funzioni del gene e il suo coinvolgimento in eventi quali il controllo del ciclo cellulare,l induzione dell apoptosi e l induzione della senescenza,mentre le prime analisi in vivo risalgono ai primi anni 90. 1

2 Primo modello:il Knock-out Nel 1993 venne effettuato il primo Knock-out di p53 nel topo e, malgrado le grandi aspettative riversate in questo esperimento, i risultati furono deludenti:il tumore sorgeva successivamente a un lungo periodo di latenza, rivelava una bassa aggressività e uno spettro tumorale non corrispondente a quello umano. Il motivo di ciò risiede nella grande varietà di mutazioni a cui può essere sottoposto p53, con conseguente sviluppo di diverse funzioni.un metodo innovativo per lo studio di queste alterazioni e dei relativi effetti fenotipici consistette nello sviluppo di modelli alternativi. Secondo modello:transgenico classico Nel 1998 Li & Rosen promossero il modello del topo transgenico per studiare il ruolo dell oncosoppressore p53 nella carcinogenesi mammaria. Precedenti studi (Donehover 1992,1996;Harvey 1993) avevano rivelato che mutazioni missenso nel dominio di legame al DNA del gene p53 avvengono con alta frequenza nel tumore alla mammella influenzando prognosi e risposta alla chemioterapia.le mutazioni più frequenti risultano essere a carico dell Arginina 172 (il cui corrispondente umano è a livello del codone 175), la cui catena laterale, situata tra i loop 2 e 3 della proteina, partecipa alla formazione di ponti di legame tra i due domini e alla stabilizzazione del loop. Il 20% delle mutazioni presenta una Leucina sostituita all Arginina (Li,1994),il 6% un Istidina( Hainaut, 1997), perciò l idea di Li & Rosen fu quella di creare un transgene contenente il p53 di topo mutato sotto il controllo del promotore tessuto-specifico WAP. Utilizzando come controllo un omozigote p53 wt,l overespressione della proteina mutata p53-172l provocava un danneggiato sviluppo lobuloalveolare,una crescente sensibilità all apoptosi indotta da irradiazione e una marcata resistenza alla tumorigenesi indotta tramite carcinogeno chimico DMBA mentre, in parallelo, l overespressione della proteina p53-172h non provocò nessuna alterazione della proliferazione 2

3 né del normale sviluppo ghiandolare,si riscontrarono livelli apoptotici normali e una bassa incidenza di tumori spontanei però si determinò un aumento della suscettibilità a tumorigenesi indotta tramite DMBA e un alto grado d instabilità genomica nei tumori. L utilizzo di questi mutanti si rivelò fondamentale sia per la comprensione della cooperazione di p53 con oncogeni e altri oncosoppressori nello studio della carcinogenesi sia per l identificazione di nuove alterazioni genetiche causanti predisposizione al cancro alla mammella. Terzo modello:il cromosoma BAC Gli svantaggi dei transgenici classici, quali l assenza di sequenze regolatorie e la presenza di un promotore corto che causante una regolazione aberrante, cercarono di essere superati grazie all utilizzo di un nuovo modello:il BAC. Il BAC (cromosoma artificiale batterico) superava gli svantaggi del modello precedente grazie alla possibilità di contenere inserti più lunghi e fornire una regolazione pari a quella del gene endogeno. Nel 2002 Garcia-Cào e il suo gruppo di ricerca utilizzarono il Bac per generare i cosiddetti Super p53,ovvero topi portanti una copia supplementare e pienamente funzionale del gene p53. 3

4 Inserendo un transgene p53 all interno di un topo Knock-out per il gene stesso si otteneva una replica funzionale dell endogeno,mentre inserendo un vettore Bac contenente il gene p53 nel suo normale contesto genomico all interno di un background p53 wt si otteneva un aumentata risposta al danno del DNA. Nello stesso anno, Nature pubblicò il modello utilizzato da Tyner che consisteva in topi portanti una forma troncata di p53,precisamente una delezione di X geni e di una regione al 5, che provocava morte prematura rispetto ai controlli p53 wt. A differenza di tale modello, i topi Super p53 presentavano un normale invecchiamento, perciò si ipotizzò che la forma mutata di p53 rendesse la proteina costitutivamente attiva. Dalle analisi effettuate sulle Mef la senescenza dei Super p53 risultava simile a quella dei wt (A), l apoptosi era superiore(b) e,inoltre, in seguito a induzione chimica con DMBA, i Super p53 si dimostrarono maggiormente resistenti allo sviluppo di fibrosarcomi(c). A B C Le analisi in vivo fecero notare che a livello fenotipico (in particolare venne analizzata la pelle del dorso) il wt e il Super p53 risultarono indistinguibili. 4

5 Tale conclusione fece pensare alla possibilità di aumentare la resistenza al cancro tramite una semplice modifica genetica e in assenza di effetti indesiderati quali,ad esempio,l invecchiamento precoce. Quarto modello:il Knock-In La necessità e il desiderio di correlare i risultati ottenuti su modelli animali ad alterazioni umane stimolò la ricerca verso la generazione di un modello Knock-in. 5

6 Nel 2004 Cell pubblicò un importante studio, effettuato da un gruppo di ricercatori dell Università del Texas guidato da Lang & Lozano, connesso alla Sindrome umana di Li-Fraumeni (LFS),patologia caratterizzata dalla predisposizione a un precoce sviluppo tumorale e allo sviluppo di tumori multipli. A differenza di altre sindromi tumorali,gli affetti da LFS presentano grande varietà di tipi tumorali,i più comuni dei quali risultano essere sarcomi,tumori al seno e al cervello,leucemie e carcinomi adenocorticali. Denominatore comune nella LFS è la causa di insorgenza tumorale,ovvero l ereditarietà di mutazioni,nella maggior parte dei casi missenso, nella regione conservata del DBD nell oncosoppressore p53, mentre poche risultano essere mutazioni non-senso. Tra le mutazioni missenso le gain of function sono quelle in cui p53 mutante acquisisce funzioni addizionali assenti nel wild-type e un tipico esempio di tali mutazioni è rappresentato dalla forma mutante p53r175h, corrispondente umano della forma murina p53r172h. L overespressione di p53-172h in un background p53-/- non trasformante sviluppa tumori nei topi nudi ma non nella linea cellulare; i transgenici overesprimenti p53-172h nelle cellule epiteliali riportano aumentata suscettibilità a carcinogeni chimici e minore latenza allo sviluppo tumorale rispetto ai controlli p53-/-.tali esperimenti,però,non corrispondono alle reali mutazioni presenti nei tumori di pazienti affetti da LFS in quanto l overespressione,permessa dall uso di promotori forti, deforma la situazione fisiologica reale. Per simulare accuratamente la LFS ed esaminare la natura meccanicistica delle mutazioni missenso sulla tumorigenesi in vivo,il gruppo di Lang & Lozano aveva generato e caratterizzato un modello di topo con un alterazione da arginina ad istidina al nucleotide 515,corrispondente all aminoacido 172, attraverso ricombinazione omologa a livello del locus endogeno. L analisi delle Mef provenienti da p53+/515a e p53 omozigoti per la mutazione rivelava un aumento della proliferazione,della sintesi del DNA e del potenziale trasformante rispetto al controllo eterozigote p53+/-. Al contrario,le Mef provenienti da p53-/- mostravano dapprima una crescita minore e in seguito un blocco della sintesi del DNA rispetto agli eterozigoti e agli omozigoti per la mutazione. Proliferation and in MEFs Time course of DNA synthesis upon contact inhibition in MEFs as measured by incorporation of [ 3 H] thymidine. 6

7 I topi eterozigoti per la mutazione (p53+/515 A) sviluppavano tumori similmente agli eterozigoti di controllo p53+/- ma in più gli osteosarcomi e i carcinomi provenienti dai p53+/515a metastatizzavano a vari organi con alta frequenza. Metastatic phenotype of osteosarcoma and adenocarcinoma. (i) Osteosarcoma metastasis to the liver (arrows). (ii) p53 immunohistochemical staining of adenocarcinoma of the lung and (iii) its metastatic lesion in the brain I topi p53-/- sviluppavano tumore con latenza più lunga rispetto ai p53+/515a ma,inserendo un allele p53+/515a in un background p53-/- si otteneva la downstimolazione di altre due molecole appartenenti alla stessa famiglia di p53,p63 e p73, in quanto l allele mutato, legando tali molecole, ne inibiva la funzione provocando un aumento del potere trasformante. Per comprendere meglio il ruolo di p63 e p73 vennero generate due linee, rispettivamente p53+/-;p63+/- e p53+/-;p73+/- : entrambe svilupparono metastasi. Dai dati ottenuti in vitro e in vivo fu possibile affermare che p53 mutato lega e inibisce la funzione di p63 e p73 ma è l aploinsufficenza di p63 e p73 che riproduce la metastasi presentata dai p53+/515a. Questi ultimi risultati sono attualmente in fase di sperimentazione più dettagliata. 7

8 Bibliografia "Super p53" mice exhibit enhanced DNA damage response, are tumor resistant and age normally Garcia-Cao I, Garcia-Cao M, Martin-Caballero J, Criado LM, Klatt P, Flores JM, Weill JC, Blasco MA,Serrano M. EMBO J Nov 15;21(22): Gain of function of a p53 hot spot mutation in a mouse model of Li-Fraumeni syndrome. Lang GA, Iwakuma T, Suh YA, Liu G, Rao VA, Parant JM, Valentin-Vega YA, Terzian T, Caldwell LC, Strong LC, El-Naggar AK, Lozano G. Cell Dec 17;119(6): A transgenic mouse model for mammary carcinogenesis. Li B, Murphy KL, Laucirica R, Kittrell F, Medina D, Rosen JM. Oncogene Feb 26;16(8): Principles of Tumor Suppression Charles J. Sherr. Cell Jan 23;116(2): P53 is a Tumor Suppressor Gene Arnold J. Levine, Cathy A. Finlay, and Philip W. Hinds. Cell, Vol 116, 67-69, 23 January 2004 The p53 Proto-Oncogene Can Act as a Suppressor of Transformation C.A. Finlay, P.W. Hinds, and A.J. Levine. Cell, Vol 116, 67-69, 23 January 2004 Surfing the p53 network Vogelstein B, Lane D, Levine AJ. Nature Nov 16;408(6810):

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