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1 Esperto in processi innovativi di sintesi biomolecolare applicata a tecniche di epigenetica Materiale Didattico Biologia applicata alla ricerca bio-medica immagine Docente: Di Bernardo

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3 Per animali transgenici si intendono quegli animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso ad altre specie.

4 Blastocele

5 Sono state sviluppate 3 metodiche per introdurre DNA esogeno in animali: - INIEZIONE NEL PRONUCLEO - CELLULE STAMINALI EMBRIONALI - TRASFERIMENTO NUCLEARE

6 INIEZIONE NEL PRONUCLEO

7 Prromotore del gene della Metallotioneina I di topo Gene dell ormone della crescita di ratto Il DNA iniettato nei pronuclei di uova di topo Fecondate. 21 nuovi nati sono portatori della fusione genica Molti di questi mostrano alti livelli di ormone nel loro siero A 74 giorni pesano 44 gr rispetto ai 29 gr

8 Nel 1991 l impresa scozzese PPL Therapeutics riuscì a creare una pecora transgenica che nel suo latte produce quantità abbastanza elevate della proteina umana alfa-1-antitripsina (AAT). L AAT viene prodotta tuttora con metodi tradizionali e usata per curare gravi malattie dei polmoni (fibrosi cistica). Si è calcolato che sarebbero sufficienti 2000 pecore transgeniche per coprire il fabbisogno mondiale di AAT. Questo tipo di produzione di farmaci è chiamato "genepharming". Finora sul mercato non ci sono medicine prodotte con questo metodo.

9 VANTAGGI NELL INIEZIONE NEI PRONUCLEI: - IL DNA ESOGENO NON DEVE, NECESSARIAMENTE, ESSERE CLONATO IN UN VETTORE FRAMMENTI DI DNA, CONTENENTI IL GENE D INTERESSE, ANDRANNO AD INTEGRARSI NEL GENOMA DELL ANIMALE IN COPIE MULTIPLE IN TANDEM (DIV. CENTINAIA) IN MODO CASUALE. SVANTAGGI NELL INIEZIONE DEI PRONUCLEI: - L INTEGRAZIONE RANDOM NON SOSTITUISCE GENI MALATI ESISTENTI - L INTEGRAZIONE RANDOM NON E CONTROLLABILE - I LIVELLI DI ESPRESSIONE GENICA SONO VARIABILI - L INIEZIONE NEL PRONUCLEO PUO ORIGINARE ANIMALI MOSAICO E QUINDI L ESPRESSIONE GENICA è LIMITATA SOLO A DETERMINATI TESSUTI O ORGANI

10 CELLULE Reece Analisi STAMINALI dei geni e dei EMBRIONALI genomi Capitolo (ES 13 POSSONO ESSERE COLTIVATE IN VITRO SU UNA PIASTRA RICOPERTA CON CELLULE EMBRIONALI DELLA PELLE DI TOPO IN MODO DA NON POTERSI DIVIDERE. POSSONO ESSERE MANTENUTE IN COLTURA PER MOLTE GENERAZIONI SENZA DIFFERENZIARSI POSSONO ESSERE INDOTTE A DIFFERENZIAMENTO IN OPPORTUNE CONDIZIONI PERTANTO SONO CELLULE CHE SI PRESTANO A MANIPOLAZIONI GENETICHE

11 VANTAGGI NELL USO DELLE ES : - CELLULE DOTATE DI UNA ELEVATA EFFICIENZA DI RICOMBINAZIONE OMOLOGA. PERTANTO LA RICOMBINANZIONE TRA SEQUENZE DI DNA OMOLEGHE PRESENTI NEL VETTORE E NEL GENOMA CONSENTE DI INTRODURRE IL FRAMMENTO DI DNA ESOGENO IN UNA SPECIFICA POSIZIONE DEL GENOMA. TUTTAVIA, POSSONO VERIFICARSI EVENTI DI RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA. E IMPORTATANTE, ALLORA, POTER DISTINGUERE I DUE EVENTI.

12 STESSO METODO USATO PER GENERARE TOPI KNOCK-OUT: - METODO ADOPERATO PRINCIPALMENTE PER STUDIARE LA FUNZIONE DI UN GENE. POSSIBILI FENOTIPI: LETALE FENOTIPO PARTICOLARE: esempio p53 deleto conferisce suscettibilità ai tumori NESSUN FENOTIPO

13 QUALORA SIA RICHIESTA Reece L ESPRESSIONE Analisi dei geni DI UN e dei TRANSGENE genomi Capitolo IN UNO 13 SPECIFICO TESSUTO O SOLO IN PARTICOLARI TITPI DI CELLULE, IL GENE DI INTERESSE DEVE ESSERE SOTTO IL CONTROLLO DI UN PROMOTORE TESSUTO-SPECIFICO PROMOTORE TESSUTO-SPECIFICO GENE BERSAGLIO

14 TRASFERIMENTO NUCLEARE IL GENOMA CONTENUTO ALL INTERNO DEL NUCLEO CONTIENE TUTTA L INFORMAZIONE GENETICA RICHIESTA PER DARE ORIGINE AD UN INTERO ORGANISMO. SE IL NUCLEO DI UNA CELLULA DIFFERENZIATA VIENE INTRODOTTO ALL INTERNO DI UNA CELLULA UOVO PRIVATA DEL SUO NUCLEO, IL NUOVO ORGANISMO PUO ESSERE PROGRAMMATO PER GENERARE UN ORGANISMO INTERO. A QUALE SCOPO? PRODURRE GROSSE QUANTITA DI PROTEINE RICOMBINANTI. CONSERVAZIONE DI SPECIE ANIMALI IN VIA DI ESTINZIONE L ESPERIMENTO FU CONDOTTO PER LA PRIMA VOLTA SU RANE.

15 Reece GURDON Analisi dei geni E e XENOPUS dei genomi Capitolo 13

16 CAMPBELL AND DOLLY

17 PROBLEMATICHE DEL TRASFERIMENTO NUCLEARE: BASSA EFFICIENZA PRESENZA DI ANORMALITA NEGLI ANIMALI LA PROLE DI DOLLY NASCE CON UN PESO ELEVATO E LUNGA GESTAZIONE IL PROBLEMA DEI TELOMERI NEL NUCLEO PRELEVATO DA UNA CELLULA ADULTA ALTERAZIONI NELLA METILAZIONE DEL DNA OCCORRE CONDURRE ANCORA MOLTI STUDI PROCEDURA POTENZIALMENTE UTILE PER XENOTRAPIANTO

18 TERAPIA GENICA: LA TERAPIA GENICA CONSISTE IN UN APPROCCIO SPERIMENTALE INNOVATIVO CHE OFFRE LA POSSIBILITA DI SOSTITUIRE, IN UN INDIVIDUO MALATO, IL GENE ALTERATO CON UN GENE SANO. LE CELLULE BERSAGLIO POSSONO ESSERE: GERMINALI E SOMATICHE GERMINALI: CAMBIAMENTO INTRODOTTO ANCHE ALLA PROGENIE (non consentito) SOMATICHE: MODIFICA CIRCOSCRITTA AL SINGOLO INDIVIDUO (limitata solo ad alcuni tipi cellulari) Tentativi attualmente in corso: Emofilia B: gene per il fattore IX Cancro: geni per la risposta immunitari e Geni suicida Hiv: virus HIV modificato

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