Estrazione delle microcistine: metodi a confronto

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Agostino Motta
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1 Applicazione in Italia della direttiva 2006/7/CE in materia di balneazione: quale il ruolo dei cianobatteri nel giudizio di balneabilità. Estrazione delle microcistine: metodi a confronto Tavola Elena Lecco, 21 ottobre 2011

2 Cianotossine Le tossine cianobatteriche riscontrate con maggior frequenza nelle acque dolci italiane sono nell ordine: 1) MICROCISTINE 2) NODULARINE 3) ANATOSSINE 4) SAXITOSSINE Epatotossine Neurotossine Le tossine sono presenti nei campioni sia in fase disciolta (extracellulare) che all interno delle cellule algali (endocellulare), quelle contenute all interno dei cianobatteri vengono rilasciate in acqua in seguito a lisi cellulare.

sono presenti nei campioni sia in fase disciolta (extracellulare) che all interno delle cellule algali

3 Dosaggio delle cianotossine Un rapido screening delle cianotossine può essere effettuato attraverso: Metodi biologici (saggi in vivo). Metodi immunoenzimatici (test ELISA). Metodi biochimici (biosaggio). La normativa non indica un metodo di elezione. Ogni laboratorio è tenuto ad eseguire le analisi adottando metodi che consentono di fornire risultati attendibili e che al tempo stesso che soddisfano le esigenze di rapidità di risposta.

La normativa non indica un metodo di elezione.

4 Gli esiti dei test dipendono strettamente dell estrazione ESTRAZIONE: fase più critica Ottimizzazione del processo con confronto di diversi metodi estrattivi tramite l esecuzione in parallelo dell analisi su un numero consistente di campioni reali. 4 diversi metodi di estrazione.

metodi estrattivi tramite l esecuzione in parallelo dell analisi su

5 Validazione del metodo di estrazione Estrazione 1 Prelevare 10 ml Sonicare Filtrare su membrane di nitrocellulosa Congelare over night Test ELISA

6 Estrazione 2 Prelevare 10 ml Sonicare Filtrare su membrane di nylon Congelare over night Test ELISA

7 Estrazione 3: metodo IRSA Filtrare su membrane in fibra di vetro (1.2 µm) Conservare distintamente filtrato e filtro Estrazione tossine citoplasmatiche Congelamento e scongelamento Aggiungere al filtro 10 ml di metanolo 90% e sonicare Evaporare fino a raggiungere il volume di 1 ml Aggiungere al filtro 9 ml di acqua ultrapura e sonicare Unire i due estratti e miscelare Test ELISA

Congelamento e scongelamento Aggiungere al filtro 10 ml di metanolo 90% e sonicare Evaporare

8 Estrazione 4: metodo biosaggio Filtrare su membrane di nylon (0.8 µm) Conservare distintamente filtrato e filtro Agitare al buio per 30 minuti Aggiungere al filtro 10 ml di metanolo 80%, 0.1 % di TFA e 0.1% di Tween 20 Centrifugare a 4000 giri per 5 minuti, prelevare il surnatante e diluirlo con acqua distillata 1:20 Test ELISA

Aggiungere al filtro 10 ml di metanolo 80%, 0.1 % di TFA e 0.

9 Valutazione dei metodi di estrazione I criteri per la scelta di un metodo sono: Proprietà analitiche Tempo di analisi Facilità di esecuzione Costi I tempi di preparazione dei campioni con metodo 3/4 sono superiori rispetto a quelli con metodo 1/2. Il metodo 4 utilizza reattivi piuttosto costosi. Il metanolo è una sostanza notoriamente tossica.

preparazione dei campioni con metodo 3/4 sono superiori rispetto a quelli con metodo

10 Risultati validazione Concentrazione di microcistine e nodularine nel filtrato sempre inferiore alla sensibilità del test. Metodo proposto dal kit biosaggio resa estrattiva notevolmente inferiore agli altri metodi.

11 Totale campioni Esiti concordanti 2 vs 1 % Sottostima di 2 vs 1 % Totale campioni Esiti concordanti 3 vs 1 % Sottostima di 3 vs 1 % Totale campioni Esiti concordanti 4 vs 1 % Sottostima di 4 vs 1 % Totale campioni Esiti concordanti 3 vs 2 % Sottostima di 3 vs 2 % Totale campioni Esiti concordanti 4 vs 2 % Sottostima di 4 vs 2 % Totale campioni Esiti concordanti 4 vs 3 % Sottostima di 4 vs 3 % Prestazione del metodo 1 superiore a quella del metodo 4, ma inferiore rispettivamente nel 83% e nel 90% dei casi ai metodi 2 e 3. I procedimenti 2 e 3 permettono entrambi un buon recupero delle tossine dal campione.

0 Totale campioni Esiti concordanti 4 vs 2 % Sottostima di 4 vs 2 % 40 7 17.5 33 82.5 Totale campioni Esiti concordanti 4 vs 3 % Sottostima di 4 vs 3 % 40 13 32.5 27 67.

12 Conclusioni del processo di valutazione del metodo estrattivo Metodo estrattivo di elezione: metodo 2 con filtri di nylon. Test ELISA preferito al BIOSAGGIO. Adozione del nuovo metodo di estrazione nell attività di routine e rivalutazione dello stesso con materiali di riferimento certificati.

13 Grazie per l attenzione

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