EDI Kit ELISA Cromogranina A umana ELISA Kit per la valutazione della Cromogranina A umana nel siero

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1 EDI Kit ELISA Cromogranina A umana ELISA Kit per la valutazione della Cromogranina A umana nel siero EPI-KT 812 Italiano US: Per determinazioni in vitro FINALITA D USO kit ELISA per la determinazione quantitativa dei livelli di cromogranina A umana su siero. Il dosaggio misura esclusivamente la cromogranina A ed esclude l effetto hook sui livelli alti sopra ng/ml. Il test è d ausilio per identificare i pazienti con feocromocitoma e tumori neuroendocrini. SOMMARIO E FISIOLOGIA La cromogranina A è una proteina acida di 49kDa composta da 439 aminoacidi e codificata sul cromosoma 14. La cromogramina A si ritrova nei tessuti endocrini normali e neoplastici. E però dimostrato che un livello elevato di cromogranina A circolante può essere indicatore di tumore di origine neuroendocrina. Tuttavia, l uso clinico più significativo del dosaggio della cromogranina A è correlato alla procedura diagnostica in pazienti con feocromocitoma. Principali utilizzi del dosaggio della cromogranina A. 1. marker altamente sensibile (83%) e specifico (96%) per la valutazione del feocromocitoma. I farmaci comunemente usati in questo trattamento influenzano minimamente i livelli plasmatici di cromogranina A, è pertanto preferibile dosare questo analita invece delle catecolamine. 2. per accertare la provenienza del tumore: alti livelli di cromogranina A indicano che il tumore è di origine neuroendocrina. 3. Tumori neuroendocrini che non producono I loro specifici ormoni, per esempio, carcinoma a cellule C calcitonina negativo ma cromogranina A positivo; carcinoma cellule zero; carcinoma a cellule beta e carcinoma paratiroideo. PRINCIPIO DEL DOSAGGIO Il test ELISA determina quantitativamente la cromogranina A umana nei campioni di siero. Questo dosaggio utilizza la tecnica sandwich con due anticorpi specifici che si legano a due differenti epitopi della cromogranina A umana. Gli standard, I controlli e I campioni vengono aggiunti sulla micropiastra, i cui pozzetti sono rivestiti da un anticorpo policlonale anti-cromogranina A. La prima incubazione permette all anticorpo che si trova sulla parete dei pozzetti di catturare la cromogranina A presente nel campione; successivamente tutto quello che non si è legato viene lavato via. Segue l aggiunta di un anticorpo monoclonale anti-cromogranina A, marcato con la perossidasi di rafano (HRP), che si legherà all antigene bloccato al pozzetto, formando un sandwich. Tutto quello che non si lega viene eliminato durante la fase di lavaggio. Per la rivelazione di questo immunocomplesso si aggiunge un substrato che svilupperà una colorazione valutabile al lettore spettrofotometrico. La densità ottica dell attività enzimatica è direttamente proporzionale alla quantità di cromogranina A presenta nel campione. La curva standard si può calcolare con una curva 4 parametri, cubica oppure manualmente con una curva punto per punto. La concentrazione della cromogranina A umana presente nei campioni viene estrapolata dalla curva standard. Composizione del kit: preparazione e mantenimento Il kit deve essere mantenuto a 2-8 C. Per la data di scadenza fare riferimento all etichetta presente sulla scatola. Tutti i componenti del kit sono stabili fino alla data di scadenza. Prima di usare I reagenti portarli a temperatura ambiente. Reagenti con diverso numero di lotto non possono essere usati insieme 1. Micropiastra con anticorpo Anti-CgA (Cat. No ) Una micropiastra con 12 striscie da 8 pozzetti (totale 96 pozzetti)ricoperti con un policlonale anti-cromogranina A umana. La piastra è all interno di un contenitore Zipfoil con essiccante. La piastra deve essere mantenuta a 2-8 C ed è stabile 2. CgA Anticorpo di rivelazione (Cat. No ) Un flacone contenente 0,6 ml di anticorpo anti-cromogranina A umana, marcato con HRP. Questo reagente deve essere mantenuto a 2-8 C ed è stabile fino alla data di scadenza riportata sul kit. 3. Diluente anticorpo di rivelazione(tracer Antibody Diluent - Cat. No ) Un flacone contenete 12 ml di tampone pronto all uso. Il buffer deve essere usato solo per la diluizione dell anticorpo di rivelazione seguendo le indicazioni del dosaggio. 4. CgA tampone del dosaggio (Cat. No ) Un flacone contenete 30 ml di tampone fosfato con albumina sierica bovina. 5. ELISA soluzione di lavaggio concentrata (Cat. No ) Un flacone contenete 20 ml di soluzione concentrata 30X. Diluire prima dell uso con 580ml di acqua distillata e agitare con cura. La soluzione diluita può essere mantenuta a temperatura ambiente ed è stabile Page 1 of 5

2 6. ELISA HRP substrato (Cat. No ) Un flacone contenete 12mL di tetrametilbenzidina (TMB) con perossido di idrogeno. Questo reagente deve essere mantenuto a 2-8 C ed è stabile 7. ELISA soluzione Stop (Cat. No ) Un flacone contenente 12 ml di acido solforico 0.5 M.Questo reagente deve essere mantenuto a 2-8 C o a temperatura ambiente ed è stabile 8. Chromogranin A Standards (Cat. No ) Cinque flaconi, ciascuno contenente cromogranina A in una matrice sierica bovina con conservanti non-azide. Fare riferimento ai flaconi per le concentrazioni egli standards. 9. Chromogranin A Controlli (Cat. No ) Due flaconi ciascuno contenente cromogranina A umana in una matrice sierica bovina con conservanti non-azide. Fare riferimento ai flaconi per il range di concentrazione di ciascun controllo. Mantenere i controlli a 2-8 C, stabili fino alla data di scadenza riportata sul kit. PRECAUZIONI E AVVERTENZE Questo kit deve essere usato nei laboratori di ricerca ed è utilizzabile solo a tale scopo. Il siero bovino contenuto nei reagenti proviene dagli Stati Uniti. Il siero bovino è ottenuto da animali sani sotto supervisione veterinaria e liberi da malattie contagiose.indossare guanti durante il dosaggio e maneggiare i reagenti come se fossero potenzialmente infetti. Evitare il contatto con i reagenti che contengono TMB, perossido di idrogeno o acido solforico. Il TMB può causare reazioni allergiche e irritazioni sulla pelle e sulle mucose. Il TMB è un sospetto cancerogeno. L acido solforico può causare severe irritazioni al contatto con la pelle; evitarne pertanto il contatto su pelle, occhi e abiti. Non ingerire e non inalarne i vapori. In caso di contatto,lavare con abbondante acqua per almeno 15 minuti. Manipolare come suggerito dalle Good Laboratory Practices. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. pipette di precisione da 10 µl, 50 µl, 100 µl, and 1000 µl etc. 2. dispensatore automatico da 100 µl. 3. puntali per pipette. 4. provette di vetro 12 x 75 mm or 13 x vetreria da 100 ml e 1000 ml. 6. foglio di alluminio. 7. acqua distillata o deionizzata. 8. foglio di plastica per ricoprire la piastra. 9. lavatore di micropiaste ELISA automatico o semiautomatico 10. lettore spettrofotometrico di micropiastre in grado di leggere a 450nm. RACCOLTA DEI CAMPIONI Sono necessari solo 50μl di siero umano per il dosaggio in duplicato.non sono necessari accorgimenti prima del prelievo. Il sangue deve essere raccolto e mantenuto per almeno 30 minuti a temperatura ambiente, poi centrifugato ( xg per 10 ). Il siero deve essere separato entro tre ore e trasferito in provette pulite. I campioni possono essere mantenuti a 2-8 C per 72 ore o a 20 C per periodi superiori. Evitare di scongelare e ricongelare più di tre volte. PROCEDURA 1. Preparazione dei Reagenti (1) Prima di utilizzare I reagenti portarli a temperatura ambiente. Reagenti da kit con lotti diversi non vanno mescolati tra loro. (2) La soluzione di lavaggio deve essere preparata prima dell uso. Vedere la sezione REAGENTI per la diluizione 3. Dosaggio (1) Prendere un numero sufficiente di pozzetti per il dosaggio, considerando gli standard, I controlli ed I campioni in duplicato. (2) Schema del test Fila Striscia 1 Striscia 2 Striscia 3 A STD 1 STD 5 CAMPIONE 2 B STD 1 STD 5 CAMPIONE 2 C STD 2 C 1 CAMPIONE 3 D STD 2 C 1 CAMPIONE 3 E STD 3 C 2 CAMPIONE 4 F STD 3 C 2 CAMPIONE 4 G STD 4 CAMPIONE1 H STD 4 CAMPIONE1 (3) Aggiungere 25 µl di standard, controlli e campioni nei pozzetti designati (4) Aggiungere 100 µl di tampone del dosaggio in ciascun pozzetto (5) Ricoprire la piastra con plastica sigillante ed incubare su un agitatore orbitante a 170 rpm ed a temperatura ambiente per 2 ore. (6) Preparare la soluzione dell anticorpo rivelazione (Cat. No )diluendo 1:21 con il diluente del tracciante ( tracer Antibody Diluent - Cat. No ). Per ciascuna striscia è necessario mescolare in una provetta pulita, 1 ml di tampone con 50μl di anticorpo. (7) Rimuovere la pellicola sigillante, aspirare il contenuto di ogni pozzetto, lavare la piastra 5 volte, con 350μl di soluzione di lavaggio per volta. (8) Aggiungere 100 µl di anticorpo di rivelazione, diluito come sopra (9) Ricoprire la piastra con la pellicola sigillante ed incubare su un agitatore orbitale, a 170 rpm e a temperatura ambiente, per 1 ora. (10) Rimuovere la pellicola sigillante, aspirare il contenuto di ogni pozzetto, lavare la piastra 5 volte, con 350μl di soluzione di lavaggio per volta. (11) Aggiungere 100 µl di ELISA substrato HRP (Cat. No ) in ciascun pozzetto. (12) Ricoprire la piastra con la pellicola sigillante e anche con il foglio di alluminio, per evitare l esposizione alla luce. (13) Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. (14) Aggiungere 100μl di soluzione stop in ciascun pozzetto. Agitare delicatamente. (15) Leggere le assorbanze a 450 nm entro 10 minuti in su un lettore di micropiastre. Page 2 of 5

3 NOTA: per ridurre il fondo, leggere con una lunghezza d onda di correzione, ad esempio 450nm contro 620,630 o 595 nm. NOTE PER IL DOSAGGIO 1. Si raccomanda che tutti gli standard, i controlli ed i campioni siano eseguiti in duplicato. Usare la media delle assorbanze di ciascun duplicato per la determinazione dei risultati. 2. Mantenere I reagenti sensibili alla luce nei contenitori originali. 3. Mantenere I pozzetti non usati nel proprio contenitore con l essiccante. 4. Sono necessarie pipette ben calibrate per ottenere una buona riproducibilità. 5. Tempi di incubazione e temperature diverse da quelle indicate possono influire sui risultati. 6. Evitare la formazione di bolle all interno dei micropozzetti, possono diminuire la capacità del legame con l anticorpo e quindi aumentare il CV% delle letture in duplicato. 7. Tutti I reagenti devono essere agitati delicatamente prima dell uso, evitando la formazione di schiuma. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 1. Calcolare la media delle assorbanze di ciascuna coppia di risultati. 2. Sottrarre la media delle assorbanze dello standard 1 (0 ng/ml), dalla media delle assorbanze di ciascuna lettura. 3. La curva standard si ottiene ponendo tutte le assorbanze corrette sulle ordinate e le rispettive concentrazioni sulle ascisse, usando una carta millimetrata point to point o log/log. Può essere utilizzato un computer con un programma adeguato, in grado di disegnare la curva. Le concentrazioni di cromogranina A dei controlli e dei campioni, vengono estrapolate direttamente dalla curva standard. Le concentrazioni dei campioni che presenteranno una assorbanza compresa tra il secondo standard e l ultimo saranno calcolate con la seguente formula concentrazione= (campione) Assorbanze corrette (campione) assorbanze corrette (2 nd STD) x valore 2 STD ESEMPIO DI VALORI E CURVA STANDARD A titolo di esempio si riporta una curva standard ottenuta da un dosaggio di cromogranina A umana. Questa curva non deve essere usata al posto della curva standard che deve essere eseguita per ogni dosaggio. Pozzetto I.D OD 450 nm assorbanza letture media correzione risultati 830 Control 1 Control 2 OD 450 nm 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, Cromogranina A umana - ELISA cromogranina A-Standard(ng/ml) VALORI ATTESI E stato misurata la cromogranina A sul siero di 72 adulti considerati sani. L intervallo di normalità è risultato minore di 100 ng/ml. Cinque pazienti con feocromocitoma hanno riportato livelli di cromogranina A superiori a 100 ng/ml; uno dei pazienti ha evidenziato un valore di 330. I dati esposti sono indicativi,ogni laboratorio deve stabilire il proprio livello di normalità. LIMITI DEL TEST 1. Poiché non esiste un Gold Standard per la cromogranina A, i valori del dosaggio devono essere correlati con quelli degli standard (altamente purificato). 2. Per valori superiori a 830 ng/ml, si raccomanda di diluire il campione. 3. Contaminazioni batteriche o fungine dei reagenti e dei sieri, possono causare risultati non attendibili. 4. L acqua deionizzata con resine di poliestere può inattivare la perossidasi di rafano. CONTROLLO DI QUALITA Per essere sicuri di avere un risultato attendibile ciascun dosaggio deve contenere I controlli; si consiglia di aggiungere anche i controlli del laboratorio oltre a quelli forniti dal kit. CARATTERISTICHE DEL DOSAGGIO Sensibilità La sensibilità del test (95% confidence limit) determinata su 20 duplicati dello standard zero è di circa 5 ng/ml. Effetto hook per dosi elevate. Questo dosaggio mostra che non c è effetto hook sopra ng/ml. Questo è importante perché pazienti con feocromocitoma possono avere valori di cromogranina A superiori a ng/ml. Precisione La precisione intra-assay calcolata misurando i due controlli per 20 volte nello stesso dosaggio è: Page 3 of 5

4 Media del valore di cromogranina A CV (%) (ng/ml) La precisione inter-assay calcolata misurando i due controlli in duplicato per 12 volte è; Media del valore di cromogranina A (ng/ml) CV (%) Linearità Due sieri sono stati diluiti con il tampone di diluizione e testati. I risultati sono riportati nella seguente tabella: # Diluizione osservato atteso RECOVERY % 1 nessuna : : : : nessuna : : : Test di recupero A due campioni di siero sono stati aggiunti quantitativi di cromogranina A (1 vol + 1 vol di miscela) e testati. I risultati sono i seguenti: # iniziale aggiunto osservato atteso Recovery % hyperparathyroidism and pituitary adenoma in comparison with catecholamine, parathyroid hormone and pituitary hormones. Endocr J 1997;44: Hendy GN, Bevan S, Mattei MG, Mouland AJ. Chromogranin A. Clin Invest Med 1995;18: Deftos LJ. Chromogranin A: its role in endocrine function and as an endocrine and neuroendocrine tumor marker. Endocrine Reviews: 1991;12: Sobol RE, Memoli V, Deftos LJ. Hormone-negative, chromogranin A-positive endocrine tumors. N Engl J Med 1989;320: Sommario della procedura : 1. Aggiungere 25μL di standard, controlli e campioni di siero nei rispettivi pozzetti 2. Aggiungere 100μL di tampone in ciascun pozzetto 3. Agitare, coprire ed incubare a temperatura ambiente su un agitatore orizzontale ( 170 rpm) per 2 ore. 4. Lavare 5 volte. 5. Aggiungere 100 μl dell anticorpo di rivelazione diluito. 6. Incubare 1 ora a temperatura ambiente su agitatore (170 rpm). 7. Lavare 5 volte. 8. Aggiungere 100μL di substrato in ciascun pozzetto. 9. Coprire ed incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. 10. Aggiungere 100μL di soluzione stop in ciascun pozzetto. 11. Leggere l assorbanza a 450nm. Assistenza tecnica e servizio clienti, contattare Li StarFISH S.r.l. Via S. Pellico, Carugate (MI), Italy Tel Fax Il kit è stato sviluppato e viene prodotto da: Epitope Diagnostics, Inc. San Diego, CA 92126, USA GARANZIA Il fabbricante garantisce per il suo prodotto esclusivamente la sua capacità di misurare l analita specifico, quando usato conformemente alle istruzioni scritte dal fabbricante stesso. L uso del kit diagnostico per qualunque altro scopo esula dall impiego previsto per il prodotto ed avviene ad esclusivo rischio dell utilizzatore. Il fabbricante declina ogni tipo di garanzia implicita di commerciabilità, convenienza d uso o utilità presunta a qualsiasi altro titolo. Qualsiasi indennizzo dovuto al mancato funzionamento o errore del kit diagnostico, usato conformemente alle istruzioni, si limita al valore di sostituzione del kit. La sola responsabilità di Epitope Diagnostics, Inc e dei propri distributori, si limita alla sostituzione del prodotto, oppure al rimborso della spesa di acquisto. Il fabbricante non è responsabile per danni materiali, lesioni personali o perdite di natura economica causati dai suoi prodotti. Produttore Codice prodotto Concentrato MDSS Burckhardtstrasse Hannover, Germany No. di test Tenere al riparo dalla luce e fonti di calore Conservare alla temperatura di REFERENCES 1. Pirker RA, Pont J, Pöhnl R, Schütz W, Griesmacher A, Müller MM. Usefulness of chromogranin A as a marker for detection of relapses of carcinoid tumours. Clin Chem Lab Med 1998;36: Kimura N, Miura W, Noshiro T, Mizunashi K, Hanew K, Shimizu K, et al. Plasma chromogranin A in pheochromocytoma, primary Per uso diagnostico in vitro leggere le istruzioni prima dell uso Usare entro Numero di lotto Page 4 of 5

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