Valutazione del test CMV IgM BLOT nella diagnosi della infezione da Cytomegalovirus in gravidanza. Gianna Mazzarelli

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1 Valutazione del test CMV nella diagnosi della infezione da Cytomegalovirus in gravidanza Gianna Mazzarelli 21/10/2014

2 Citomegalovirus (CMV) Famiglia Herpesviridae Sottofamiglia β Herpesvirinae Tipica morfologia delle cellule infettate in vivo (citomegaliche) Caratteristica saliente: capacità di indurre latenza Cellule citomegaliche

3 Tipi di infezione Infezione primaria Infezione ricorrente (secondaria) Riattivazione endogena Reinfezione esogena

4 Epidemiologia Infezione endemica molto diffusa nella popolazione umana Soggetti che acquisiscono infezione 40-80% nei paesi industrializzati la quasi totalità, nei paesi in via di sviluppo Prevalenza in Italia 70-80%

5 Trasmissione Contatto interumano diretto con secrezioni infette Trasfusioni di sangue (o trapianti di midollo / organi) Rapporti sessuali Trasmissione verticale Intraparto Allattamento materno Transplacentare

6 Trasmissione transplacentare INFEZIONE CONGENITA CMV: principale causa di infezione congenita nei paesi sviluppati con incidenza tra lo 0.3 e il 2.3% di tutti i nati vivi In Italia incidenza di neonati infetti congenitamente: % Kenneson A. and Cannon M.J. 2007

7 Trasmissione transplacentare Infezione materna Viremia materna Infezione placenta Eliminazione virus nel liquido amniotico (Diuresi fetale) Infezione orofaringe Infezione endotelio fetale Viruria fetale Viremia fetale Replicazione virale in organi bersaglio (rene )

8 Donne immuni in gravidanza (40-80%) Donne sieronegative in gravidanza (20-60%) Infezione secondaria Infezione primaria (1-4%) Rischio di trasmissione (1-2.2%) Rischio di trasmissione (~ 40%) Sintomatici (~ 1%) In genere malattie lievi e rare sequele tardive Asintomatici (~ 99%) Sintomatici (10-15%) Trasmissione più frequente nelle ultime settimane di gravidanza (Bodèus et al. 1999, Bodèus et al. 2010, Enders et al ) Mortalità perinatale: 10% Gravi sequele neurologiche: 70-80% Danni feto-neonatali più significativi se infezione primaria contratta nel I trimestre (Pass et al. 2006) Asintomatici (85-90%) Sequele tardive (8-15%) Deficit sviluppo motorio difetti uditivi Stagno et al. 1986, Fowler et al. 1992, Adler 2011.

9 Inquadramento infezione materna Stato sierologico materno Epoca gestazionale di acquisizione della infezione

10 Il Decreto ministeriale DPR del 1998 e le Linee guida sulla gravidanza (Linee guida: NON prevedono l offerta dello screening sierologico per CMV a tutte le donne in gravidanza ma solo a quelle in condizioni di rischio Esiste di fatto uno screening spontaneo e disomogeneo nelle varie realtà regionali

11 Diagnosi sierologica nella gestante Esami di I livello Screening per IgG e IgM Esami di II livello Test di Avidità per IgG Test Immunoblot

12 Test di Avidità IgG Maturazione delle IgG: settimane Bassa <35% Moderata 35% - 45% Alta > 45% Lazzarotto et al Bassa Avidità: Alta Avidità: infezione primaria acuta o recente assenza di infezione primaria in atto o recente L efficacia diagnostica del test di avidità per escludere una infezione primaria nella prima parte della gravidanza è ottimale qualora il test sia effettuato entro le S.G.

13 Diagnosi infezione primaria acuta/recente Documentata SIEROCOVERSIONE (Gold Standard) Presenza di IgM specifiche e bassa Avidità delle IgG Diagnosi di infezione secondaria Incremento del titolo anticorpale delle IgG (in presenza o meno di IgM) e alta avidità delle IgG in soggetto precedentemente IgG positivo e IgM negativo SOGC Clinical Practice Guideline Cytomegalovirus Infection in Pregnancy N 240, JOGC April 2010

14 Infezione primaria acuta/recente Infezione secondaria IgM POSITIVE IgM residue / persistenti False positività Interferenze / Reattività aspecifica Cross-reazioni con altre infezioni (EBV, Toxoplasma gondii, HHV6, Parvovirus b19 ) Problemi metodologici Lazzarotto at al., 2004 Hum. Immunol. Lazzarotto et al., 1998 Journal of Clinical Microbiology

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17 CMV 3.0 (Dosaggio Western Blot) Dosaggio qualitativo immunoenzimatico per il rilevamento in vitro degli anticorpi IgM anti-cmv specifici, nel siero o nel plasma umano Anti-IgM controllo p 38 p 52 Antigeni utilizzati Nuove proteine di fusione ricombinanti costituite da polipeptidi immunogeni di 3 delle principali proteine del CMV (pp38 pp52 e pp150) p38 (43Kd) p52 (38kd) p150 (22Kd) P 150 Ditta produttrice: MP Diagnostics (MPD)

18 pp150 (proteina fosforilata del tegumento virale) pp52 (proteina nucleare DNA-binding) pp38 (proteina del capside virale)

19 Interpretazione raccomandata Nessuna banda presente o tutte le bande in assenza della p52 Presenza della sola p52 Presenza di 2/3 bande specifiche, inclusa la p52 NEGATIVO INDETERMINATO POSITIVO Anti-IgM controllo p 38 p 52 Interpretazione consigliata: indicazione diagnostica Solo p52 + p38 p52 + p150 (con o senza p38) Solo p52 INFEZIONE PRIMARIA p52 > p150 INFEZIONE PRIMARIA p52 < p150 INFEZIONE SECONDARIA p52 = p150 INDIFFERENZIATA POSSIBILE INFEZIONE PRIMARIA (Ripetere entro giorni) p150

20 Scopo Valutare se il test CMV è in grado, oltre che confermare le IgM specifiche, di fornire al clinico una informazione diagnostica aggiuntiva, nella interpretazione di una infezione da CMV in gravidanza, grazie alla differenziazione tra infezione primaria e secondaria, sulla base del diverso profilo anticorpale

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23 Studio: periodo giugno settembre 2014 Analizzati 87 campioni di siero con presenza di IgM Algoritmo diagnostico IgG assenti IgM presenti Test screening: CLIA Liaison (Diasorin) Test IgG Avidity: ELISA Chorus (Diesse)

24 Risultati 1 Interpretazione raccomandata 87 campioni 23 NEGATIVI Nessuna banda presente o tutte le bande in assenza della p52 4 INDETERMINATI Presenza della sola p52 60 POSITIVI Presenza di 2/3 bande specifiche, inclusa la p52

25 Risultati 2 60 POSITIVI Presenza di 2/3 bande specifiche, inclusa la p52 Interpretazione consigliata: indicazione diagnostica 27 INFEZIONI PRIMARIE p52 + p38 p52 > p INFEZIONI SECONDARIE p52 < p INDIFFERENZIATE p52 = p150

26 Riferimento per confrontare i risultati (consenso) Sierologia convenzionale: risultati test di screening e test di avidità per IgG (inclusi quelli relativi ad esami precedenti/successivi) (Eventuali risultati PCR Real Time per CMV DNA) (Eventuali dati clinici)

27 23 NEGATIVI per CMV Nessuna banda presente o tutte le bande in assenza della p52 CONFRONTO con CONSENSO 10 Falsi positivi al test di screening 13 Code di infezioni primarie??

28 10 FALSI POSITIVI SCREENING K- K+ pz Paziente 19/07/2013: 25 S.G. Anti-IgM contr. Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) CMV interpretazione p 38 p 52 17/06/2013 N 23 19/07/2013 N 22 NEG p 150 S.G. * : Settimane di Gestazione CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22

29 10 FALSI POSITIVI SCREENING K+ pz Anti-IgM contr. Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) CMV interpretazione p 38 19/06/2014 N 124 NEG p 52 26/06/2014 N >140 20/07/2014 N >140 p 150 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22

30 13 IgM RESIDUE ( Code )???? K+ pz Anti-IgM contr. Paziente 03/02/14 10 S.G. p 38 p 52 Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) CMV interpretazione 03/02/ NEG p 150 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40

31 27 INFEZIONI PRIMARIE per CMV p52 + p38 p52 > p150 CONFRONTO con CONSENSO 9 10 Infezioni Infezioni primarie primarie acute/recenti acute / recenti Infezioni Infezioni passate primarie (oltre non recenti weeks)?? 3 4 Cross-reazioni Cross-reazioni (EBV) (EBV)?? 1 3 Interpretazione Interpretazione discordante discordante

32 3 SIEROCOVERSIONI K+ pz Paziente 21/02/2014: 10 S.G. Anti-IgM contr. Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) (bande) interpretazione indicazione diagnostica p 38 21/02/14 N 53 p52 > p150 POS Infezione Primaria p 52 28/02/ p 150 CMV DNA (PCR Real Time) su sangue: POS CMV DNA (PCR Real Time quantitativa) su sangue: 4016 gen/ml CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40

33 7 PRIMARIE RECENTI K+ pz Anti-IgM controllo Paziente 02/12/2013: 32 S.G. Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) (bande) interpretazione indicazione diagnostica p 38 p 52 02/12/ p52 > p150 + p38 POS Infezione Primaria p 150 CMV DNA (PCR Real Time) su sangue: POS CMV DNA (PCR Real Time quantitativa) su sangue: 3397 gen/ml CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40

34 10 PRIMARIE NON RECENTI???? K+ pz Anti-IgM contr. Paziente 23/04/2014: 16 S.G. Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) (bande) interpretazione indicazione diagnostica p 38 p 52 23/04/ p52 > p150 POS Infezione Primaria p 150 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40

35 4 CROSS-REAZIONI CON EBV???? K+ pz CMV Anti-IgM contr. Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) (bande) interpretazione indicazione diagnostica 07/07/ p52 > p150 POS Infezione Primaria p 38 p 52 EBV Data Monotest IgG (U/ml) IgM (D.O.) VCA IgM EBNA IgG 07/07/ POS POS NEG p 150 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40 EBV IgG (ELISA) Negativo <25 Dubbio POS Deb Positivo >100

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37 3 CASI DISCORDANTI K+ pz Anti-IgM contr. Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) (bande) interpretazione indicazione diagnostica p 38 10/10/13 71 NEG p 52 26/03/ p52 > p150 + p38 POS Infezione Primaria p 150 Fattore reumatoide Negativo IgM EBV Negative CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40

38 16 INFEZIONI SECONDARIE per CMV p52 < p150 CONFRONTO con CONSENSO 11 Infezioni secondarie??? 5 Interpretazione discordante

39 11 SECONDARIE???? K+ pz Anti-IgM contr. Paziente 20/03/14: 13 S.G. p 38 Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) (bande) interpretazione indicazione diagnostica p 52 20/03/ p52 < p150 POS Infezione Secondaria p 150 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40

40 11 SECONDARIE???? K+ pz Anti-IgM contr. Paziente 31/12/13: 20 S.G. p 38 Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) (bande) interpretazione indicazione diagnostica p 52 31/12/ p52 < p150 + p38 POS Infezione Secondaria p 150 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40

41 5 CASI DISCORDANTI K+ pz Paziente 05/08/13 18 S.G. Anti-IgM contr. p 38 Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) (bande) interpretaz indicazione diagnostica p 52 05/08/ p52 < p150 POS Infezione Secondaria p 150 Stessi dati nel 07/2013 in altra sede CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40

42 5 CASI DISCORDANTI K+ pz Anti-IgM contr. Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) (bande) interpretazione indicazione diagnostica p 38 01/07/14 NEG 78 p52 < p150 + p38 POS Infezione secondaria p 52 14/07/14 19 >140 NC* p52 < p150 + p38 POS Infezione secondaria NC * : non calcolabile per basso titolo di IgG p 150 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40

43 5 CASI DISCORDANTI K+ pz Paziente 08/03/14 25 S.G. Anti-IgM contr. Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) (bande) interpretaz indicazione diagnostica 08/03/ p52 < p150 POS Secondaria p 38 + p38 p 52 19/03/ p52 < p150 POS Secondaria + p38 02/04/ p 150 CMV DNA (PCR Real Time) su sangue: NEG CMV DNA (PCR Real Time) su urina: POS <748 gen/ml Gennaio: sintomi CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40

44 17 INDIFFERENZIATE per CMV p52 = p150 CONFRONTO con CONSENSO 9 Infezioni primarie acute/recenti 6 Infezioni primarie non recenti o secondarie?? 2 Cross-reazioni??

45 SIEROCOVERSIONE K+ pz Paziente 07/04/2014: 9 S.G. Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) (bande) interpretaz. indicazione diagnostica Anti-IgM contr. 17/04/12 N N 07/04/14 N 129 p52 = p150 + p38 POS Indifferenziata p 38 p 52 11/04/ p52 = p150 + p38 POS Indifferenziata 23/04/ p /04/2014: CMV DNA (PCR Real Time) su sangue: POS CMV DNA (PCR Real Time quantitativa) su sangue: 4016 gen/ml CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40

46 K+ Siero intero Siero Dil. 1:10 Anti-IgM controllo 07/04/ S.G. (bande) Interpretazione Indicazione diagnostica p 38 p 52 Siero intero p52 = p150 + p38 POS Indifferenziata Siero Dil 1:10 p52 > p150 + p38 POS Infezione primaria p 150

47 4 INDETERMINATI per CMV Solo p52 CONFRONTO con CONSENSO 2 Infezioni primarie non recenti o secondarie?? 2 Cross-reazioni??

48 CROSS-REAZIONE CON Toxoplasma gondii??? Paziente 16/05/14 11 S.G. K+ pz CMV Anti-IgM contr. Data IgG (U/ml) IgM (U/ml) IgG Avidity (%) IgM BLOT (bande) interpretaz indicazione diagnostica 16/05/ p52 INDETER MINATA TOXO Possibile Infezione primaria p 38 p 52 Data IgG IgM IFA (UI/ml) (UA/ml) Ig Tot 16/05/ :1024 (600 UI) IFA IgM IgA IgG Avidity (%) 1:400 Pos 6 p 150 CMV IgG (CLIA) Negativo <12 Dubbio Positivo >14 CMV IgM (CLIA) Negativo <18 Dubbio Positivo >22 Avidity IgG (ELISA) Avidity bassa <30 Avidity media Avidity alta >40 TOXO IgG (CLIA) Negativo <7.2 Dubbio Positivo >8.8 TOXO IgM (CLIA) Negativo <8 Dubbio 8-10 Positivo >10

49 Interpretazione raccomandata Nessuna banda presente o tutte le bande in assenza della p52 Presenza della sola p52 Presenza di 2/3 bande specifiche, inclusa la p52 NEGATIVO INDETERMINATO POSITIVO Anti-IgM controllo p 38 p 52 Interpretazione consigliata: indicazione diagnostica Solo p52 + p38 p52 + p150 (con o senza p38) Solo p52 INFEZIONE PRIMARIA p52 > p150 INFEZIONE PRIMARIA p52 < p150 INFEZIONE SECONDARIA p52 = p150 INDIFFERENZIATA POSSIBILE INFEZIONE PRIMARIA (Ripetere entro giorni) p 150

50 Come interpretare??? Anti-IgM contr. p 38 p 52 Cut-off di riferimento? Lettore automatico? p 150

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52 Scopo Valutare se il test CMV è in grado, oltre che confermare le IgM specifiche, di fornire al clinico una informazione diagnostica aggiuntiva, nella interpretazione di una infezione da CMV in gravidanza, grazie alla differenziazione tra infezione primaria e secondaria, sulla base del diverso profilo anticorpale

53 Conclusioni 1 Test CMV utile per confermare le IgM specifiche Test CMV non sempre in grado di fornire una informazione diagnostica aggiuntiva Limitarsi alla interpretazione raccomandata del profilo evitando di fornire l indicazione diagnostica sulla base della interpretazione consigliata

54 Conclusioni 2 Possibilità di datare una infezione solo grazie al valore della Avidità delle IgG

55 Test Avidity: ritenuto il test più affidabile in commercio per idendificare una infezione primaria in gravidanza se eseguito entro le 16 S.G.

56 Consigliato non usare solo test IgG Avidity per interpretazione IgM POS

57 Test Avidity: limiti Eterogeneità e mancanza di standardizzazione tra Kit commerciali Difficoltà di interpretare valori intermedi Problematiche su pazienti con IgG di basso titolo Ritardo maturazione avidità in donne in gravidanza Variabilità biologica nella maturazione della avidità

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60 Strategia diagnostica Utilizzo combinato di più test avanzati in epoca gestazionale corretta

61 Algoritmo diagnostico consigliato Test di screening per IgG e IgM CMV + CMV IgG Avidity

62 < 30% delle donne in gravidanza con IgM pos al test di screening hanno un profilo sierologico di infezione primaria acuta/recente

63 Grazie per l attenzione!!!

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