Analisi multitossina: potenzialità, problematiche, prospettive - prime esperienze

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1 Analisi multitossina: potenzialità, problematiche, prospettive - prime esperienze Mauro De Paoli Servizio fitosanitario, chimico-agrario, analisi e certificazione Laboratorio fitofarmaci e contaminanti

2 Perché multitossina 1 Semplificazione delle metodiche analitiche e dei tempi d analisi 2 Studio ad ampio spettro del campione e della possibile correlazione fra diverse micotossine 3 Monitoraggio dello stato igienico delle derrate su un ampia gamma di campioni e di matrici

3 Multitossina Si, No, ma Tecniche in uso: limiti e potenzialità Multitossina una sfida Problemi Soluzioni Prospettive

4 Metodi di rivelazione più comuni Test rapidi ELISA Fluorimetria Metodi analitici cromatografici HPLC GC

5 Test rapidi Basati su reazioni immunologiche Analisi su semplice omogenato Rivelazione con spettofotometro o fluorimetro

6 Caratteristiche test ELISA Test qualitativo o semi-qualitativo Semplicità e velocità di esecuzione Non richiede attrezzature complesse o personale specializzato Screening numero elevato di campioni Economico rispetto a sistemi cromatografici Suscettibile a false positività Non consente di discriminare fra metaboliti simili (Afla B1-B2, G1-G2)

7 Tecniche cromatografiche (HPLC) Separazione cromatografica Rivelatori UV/Vis PDA Fluorimetrici

8 Metodi cromatografici Determinazione e quantificazione della tossina basata su tecniche cromatografiche Analisi su un campione purificato di matrice Poche tossine Misura indiretta.

9 Conftonto tecniche tradizionali ELISA Alta specificità Adatta allo screening Semiquantitativa Una analisi una tossina Tec. Cromatografiche tradizionali Dati analitici quantitativi Minore specificità Una analisi più tossine e metaboliti

10 Verso nuove tecniche Quantitativa Selettività Sensibilità Conferma Spettrometria di massa Quantitativa HPLC (UV-Fluor.) Selettività ELISA

11 ABC - Spettrometria di massa CO 2 12+(18*2) = 44

12 Le cose si complicano CO 2 12+(18*2) = 44 C 3 H 8 (12*3)+8 = 44

13 Spettrometro di massa

14 Ci servono anche i frammenti

15 2002/657/CE metodi di conferma 2.3. METODI DI CONFERMA PER RESIDUI E CONTAMINANTI ORGANICI I metodi di conferma per i residui o i contaminanti organici forniscono informazioni sulla struttura chimica dell'analita. Di conseguenza, i metodi basati esclusivamente sull'analisi cromatografica senza l'uso della rilevazione spettrometrica non sono adeguati all'impiego come metodi di conferma senza il ricorso ad altri metodi.

16 Multitossina quasi un rebus Proprietà chimico-fisiche Estrazione Problemi separativi Matrici diverse Sensibilità diverse Requisiti legali

17 Alcuni lavori

18 Micotossine analizzate Tricoteceni A-B Nivalenol Deoxynivalenol 3-Acetyldeoxynivalenol 15-Acetyldeoxynivalenol T-2 Toxin HT-2 Toxin Aflatossine Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 Aflatoxin G2 (Aflatoxin M1) (Aflatoxin M2) Altri Fumonisina B1 Fumonisina B2 Fumonisina B3 Ocratossina Zeralenone

19 LC-MS Fumonisine FB1 FB3 FB2

20 LC-MS Tricoteceni NIV DON ADON

21 Micotossine LC-MS

22 Aflatossine MS

23 Metodo d analisi: requisiti Acuratezza Precisione Linearità METODO Sensibilità Specificità Robustezza

24 Incertezza di misura

25 Linearità

26 Effetto matrice AB AG2 AB ZEA Std Mtx 1: Std Mtx 1: Std Mtx 1: ,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25, ,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25, ,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 FB ,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 Std Mtx 1:5 FB ,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 Std Mtx 1: NIV Std Mtx 1: ,000 20,000 40,000 60,000 80, ,000 Std Mtx 1:4 Myx 1: OCRA DON Std Std Mtx 1:4 0, Mtx 1:5 5, ,000 15,000 20,000 25,000 Myx 1: , ,000 10,000 15,000 20,000 25,000 0,000 20,000 40,000 60,000 80, ,000

27 Riduzione effetto matrice Diluizione Partizioni liq/liq Colonne immunoaffinità SPE Std. Interni

28 Utilizzo di standard marcati C34H59NO15 PM= C34H59NO15 PM=755 34

29 Da ottimizzare Estrazione campione Purificazione Effetto matrice Separazioni critiche Ottimizzazione LC-MS

30 Work in progress IERI Test ELISA Campionamenti reali Risposte LC- MS Ottimizzazione strumentale OGGI Ottimizzazione separazione LC Estensione metodo a + tossine Primi dati Fumonisine DOMANI Validare metodo Ring-test Uso di IS marcati Matrici diverse Clean-up multitossina Ottimizzare alcune criticità

31 Grazie per l attenzione Mauro De Paoli Servizio Fitosanitario, Chimico-agrario e della Certificazione Via Sabbatini, Pozzuolo del Friuli (UD)

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