UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA Human papillomavirus HPV

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1 UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA Human papillomavirus HPV

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3 Due generi: 1) Papillomavirus (HPV) (verruche; carcinoma cervicale) 2) Polyomavirus BK virus (malattia renale) JC virus (PML, leucoencefalopatia multifocale progressiva) BK e JC causano malattia nei soggetti immunodepressi. HPV può causare infezioni litiche in cellule permissive, persistenti, latenti e trasformanti in cellule non permissive.

4 I papillomavirussono tutti classificati nei generi Alpha (mucosali) e Beta (cutanei). Nel genere alphala specie 7 comprendente HPV18 e altri genotipi mucosaliad alto rischio di trasformazione; la specie 9 con HPV16 ed altri genotipi ad alto rischio mucosali. La specie 10 (HPV6 e 11) appartengono i genotipi mucosalia basso rischio di trasformazione, responsabili di lesioni mucosalibenigne, quali i condilomi acuminati. Al genere beta appartengono genotipi di HPV associati a lesioni cutanee benigne, ma anche maligne. Classificazione

5 HPV Famiglia Papillomaviridae Genere Papillomavirus Morfologia virione nudo simmetria icosaedrica 72 capsomeri genoma: DNA circolare bicatenario dimensioni: 55 nm circa 100 tipi classificati in 16 gruppi virus epiteliotropo, può essere distinto in cutaneo e mucosale sulla base della suscettibilità tissutale. Replica nucleare

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7 Organizzazione del genoma Regione codificante proteine tardive E7 (L = Late) Regione codificante L2 Long control region (LCR) P97 E6 trasformazione (p53-prb) proteine precoci (E = Early) proteine capsidiche proteina tardiva, legame citocheratine E1 replicazione episomica L1 E4 E5 trasformazione E2 regolazione della trascrizione e replicazione DNA

8 HPV: la replica è nucleare a) Trascrizione dei geni virali precoci I geni precoci stimolano la crescita delle cellule e facilitano la replica del genoma virale, utilizzando la DNA polimerasi della cellula ospite quando le cellule si dividono ( E1,E2,E4,E5,E6, E7) b) Trascrizione dei geni virali tardivi I geni tardivi codificanti proteine strutturali sono espressi solo nello strato superiore che si differenzia in ultimo, distruggendo la cheratina, ed il virus è diffuso con le cellule dello strato superiore. Di conseguenza l espressione dei geni virali è correlata all espressione di specifiche cheratine (L1 e L2).

9 Proteine precoci (non strutturali) Proteina maggiore E1 E coinvolta nella replicazione del DNA. Contribuisce al mantenimento del genoma in forma episomale Proteina regolatrice E2 La trascrizione di E2 permette di inibire l E6 e l E7. Questa proprietà viene persa quando il genoma virale si integra nel genoma dell ospite. Questo dà via libera alla soppressione dell inibizione di E6 e E7 che agiscono sui geni oncosoppressori bersaglio p53 e prb

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11 Proteina E4 è importante nella maturazione del virus nella infezione produttiva: è espressa nelle fasi tardive dell infezione durante l assemblaggio del virione. Non sembra avere proprietà trasformanti Nei cheratinociti umani sembra intaccare l integrità del citoscheletro cellulare (coilocitosi) favorendo la fuoriuscita delle particelle virali neoformate. Proteina E5 si inserisce nella membrana della cellula infetta (proteina 16K), alterando l attività delle proteine di membrana coinvolte nei segnali di proliferazione cellulare (EGF, PDGF2). Rende le cellule resistenti all apoptosi. Favorisce la formazione dei condilomi

12 E6 e E7 E6 e E7 interagiscono con molte proteine, influenzando l evoluzione di una infezione. E6 e l E7 agiscono come oncoproteine virali negli HPV ad alto rischio, non si conosce la funzione in HPV a basso rischio.

13 Proteina E6 L interazione con la p53 interferisce sia con i segnali di trascrizione e traduzione della p53 che con quelli che portano all apoptosi. L interazione con IRF-1 (Interferon Regulatory Factor 1) blocca la trascrizione di geni codificanti per proteine immunitarie indotta da IFN e contribuisce all evasione immunitaria del virus.

14 Interazione della proteina E6 di HPV con la p53 Il sito di integrazione nel genoma virale è compreso tra il 3 di E1 e il 5 di E2, dando origine alla rottura o all inattivazione dell ORF di E2. La perdita funzionale dell E2 determina una aumentata espressione delle proteine oncogene E6 ed E7. L attività oncogena delle proteine E6 ed E7 dei genotipi 16,18, interferiscono con la normale crescita cellulare, con i sistemi di controllo del ciclo cellulare e con la regolazione della stabilità dei cromosomi. L E6 interferisce con la funzione della p53 inducendo la sua degradazione ubiquitina-dipendente che è mediata dalla ubiquitina-ligasi E6-AP. La perdita funzionale di p53 a opera di E6 inattiva uno dei più importanti sistemi di controllo per evitare l instabilità genomica e l abnorme crescita cellulare.

15 Interazione della proteina E6 di HPV con p53 La proteina p53 sopprime la crescita cellulare attivando trascrizionalmente la proteina p21, che inibisce le chinasi del ciclo cellulare cruciali per la progressione del ciclo in G1 p53 bassi livelli M Infezione virale Danneggiamento DNA Stress cellulare G1 S E6 HPV alto rischio: complessa e induce degradazione ubiquitinodipendente della p53 p53 bassi livelli (passaggio in fase S e accumulo p53 alti livelli arresto del ciclo in G1 mutazioni) G2 porta alla degradazione e alla down regolazione delle vie implicate nell arresto del ciclo e apoptosi

16 Proteina E7 si lega alla proteina retinoblastoma (prb), proteina soppressoria della crescita cellulare. interferisce con la regolazione del ciclo cellulare (induce trasformazione) Reprime la trascrizione dei geni implicati nell apoptosi. Inoltre, l interazione con ISGF-3 (Interferon- Stimulated Gene Factor 3) e IRF-1 (Interferon Regulatory Factor 1) causa l evasione delle cellule trasformate dalla risposta immunitaria innata.

17 Interazione della proteina E7 di HPV con prb E2F è un attivatore del ciclo cellulare che è regolato dal legame con prb, un soppressore della crescita della cellule tumorali La proteina E7 di HPV può legare prb In seguito a ciò prb non è più in grado di legare E2F e di regolarlo E2F-1 E7 + E2F-1 prb Repressione della trascrizione G1 E2F-1 E7 prb Complesso inattivo Attivazione della trascrizione e passaggio in fase S pprb inattiva M S pprb inattiva G2 Il risultato è che E2F può liberamente attivare il ciclo cellulare

18 Interazione della proteina E7 di HPV con prb L interazione di E7 con prb determina il rilascio della proteina E2F1 che, in assenza di E7, è legata alla forma ipofosforilata di prb che inibisce la crescita cellulare. E2F1 cosi rilasciato può funzionare come attivatore trascrizionale di geni cellulari coinvolti nella sintesi del DNA cellulare e nella progressione in fase S del ciclo cellulare.

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21 Proteine strutturali L1 e L2 sono proteine tradotte tardivamente che si assemblano spontaneamente formando il capside icosaedrico. L1 (proteina capsidica maggiore) rappresenta l 80% delle proteine capsidiche. È responsabile dell attacco del virus alle cellule suscettibili ed inoltre media la risposta umorale e cellulo-mediata all infezione L2 (proteina capsidica minore) rappresenta il restante 20% delle proteine capsidiche

22 Patogenesi: verruche I papillomavirus infettano e si replicano nelle cellule dell epitelio squamoso della cute (verruche) e delle membrane mucose (papillomi genitali, orali e congiuntivali) ed inducono proliferazione epiteliale. I tipi di HPV sono tessuto-specifici, causando diverse malattie. La verruca è il risultato della stimolazione della crescita cellulare da parte del virus e dell ispessimento degli strati basale, spinoso e granuloso. I coilociti sono cheratinociti ingranditi con aloni chiari attorno a nuclei raggrinziti. Le verruche si manifestano in 3-4 mesi. L infezione virale rimane localizzata e a volte regredisce spontaneamente, ma può essere ricorrente.

23 Il potenziale oncogeno degli HPV il DNA virale è stato ritrovato sia in tumori benigni che maligni. l HPV 16 e 18 causano displasia e papillomi cervicali: almeno l 85% dei carcinomi cervicali contiene HPV integrato. l integrazione porta all inattivazione dei geni E1 e E2, limitando la replica virale e permettendo l espressione dei geni E6 e E7. E6 e E7 sono riconosciuti come oncogeni e si legano alla p53 (E6) e alla prb (E7). in assenza di queste due proteine che controllano la crescita cellulare, la cellula diventa più suscettibile a mutazioni, aberrazioni cromosomiche e subisce la trasformazione oncogena.

24 Replicazione Penetrazione del virus, scapsidazione, il genoma virale si mantiene in forma episomalea basso n di copie di DNA ( copie per cellula). Nello strato basale vengono espressi i geni E6 e E7, che stimolano la proliferazione delle cellule infettate aumentando il n delle cellule contenenti il genoma virale. A mano a mano che le cellule infettate migrano negli strati superiori (spinoso e granuloso) vengono espressi gli altri geni (E1,E2, E4, E5) che controllano la sintesi del DNA virale. Negli strati superficiali (granuloso e corneo) si osserva la sintesi delle proteine tardive/strutturali L1 e L2 ed il successivo assemblaggio di virioni maturi infettivi che vengono rilasciati dallo strato corneo. Il virus viene rilasciato con la desquamazione dello strato corneo.

25 Il ciclo vitale degli HPV si è evoluto per evadere la risposta immune cheratinizzazione rilascio strato corneo strato granuloso strato spinoso strato basale INFEZIONE Maturazione dei virioni Espress. geni tardivi Replicazione genoma (DNA pol cellulare) Proliferazione cellulare Replicazione del DNA Espressione dell E6/E7 Persistenza dell HPV e trasformazione maligna

26 Replicazione Nel caso in cui insorga una compromissione del sistema immunitario, le lesioni cutanee o mucosali, non regrediscono, l infezione produttiva persiste per molto tempo, favorendo una serie di cambiamenti nel ciclo riproduttivo dei genotipi ad alto rischio (HPV16, 18,31), che hanno come risultato finale l immortalizzazione delle cellule infettate e la trasformazione neoplastica. L evento chiave del processo è il passaggio dalla fase episomale del genoma virale alla fase d integrazione, che causa un forte aumento di espressione delle proteine oncogene E6 e E7.

27 Replicazione Infatti durante l integrazione viene inattivato il gene repressore E2, che normalmente regola negativamente la trascrizione di E6 e E7, per cui i geni che codificano per queste due proteine vengono attivamente trascritti con conseguente aumento dei livelli delle due proteine. L attività oncogena delle due proteine si basa sulla capacità da un lato, di inattivare proteine cellulari quali il retinoblastoma Rb e p53 deputate al controllo della proliferazione cellulare e, dall altro, di stimolare l attività di fattori trascrizionali (E2F) ed enzimi che regolano in senso positivo la proliferazione. Questi eventi determinano una aumentata proliferazione dell epitelio cervicale con comparsa di alterazioni citologiche valutabili tramite il test di Papanicolau

28 Patogenesi I papillomi sono lesioni epiteliali benigne che si sviluppano dopo un periodo variabile di settimane o mesi dal momento dell infezione. I papillomi si sviluppano su epiteli squamosi stratificati, coinvolgendo la cute dove prendono il nome di verruche, o le mucose, detti condilomi a livello genitale. Essi sono caratterizzati da un ispessimento dello strato spinoso (acantosi), dello strato granuloso (parachetosi) e dello strato corneo (ipercheratosi). Le cellule degli strati superficiali dell epidermide possono presentare tipiche anomalie nucleari con nuclei eccentrici e picnotici circondati da un alone chiaro. Queste cellule sono dette coilociti.la presenza di queste cellule coilocitiche è fortemente indicativa di una infezione da HPV.

29 Patogenesi Ipotesi sui meccanismi utilizzati dal virus per indurre questi processi patologici: a) le proteine E5, E6, E7 possono stimolare la proliferazione cellulare b) produzione di citochineche inducono la proliferazione dei cheratinociti. Oltre alla replicazione attiva, l infezione da HPV può evolversi verso la latenza e la trasformazione maligna. L integrazione del genoma HPV in quello della cellula ospite è associata alla progressione della lesione da displasia grave a carcinoma in situ ed infine a carcinoma invasivo.

30 Genoma di HPV e sua espressione nell epitelio

31 L acido nucleico virale si mantiene nelle cellule degli strati basali dove si replica in sincronia col ciclo cellulare (strato spinoso e strato granuloso) L espressione delle proteine del capside avviene solo nello strato più esterno (strato corneo) Le particelle virali sono evidenziabili solo nel nucleo delle cellule degli strati più superficiali dell epidermide.

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33 L infezione da HPV promuove la proliferazione delle cellule spinose (acantosi) che causa un ispessimento della cute e produzione di cheratina (ipercheratosi) portando alla formazione di escrescenze epidermiche.

34 La risposta immune all HPV L immunità innata è la prima linea di difesa contro HPV. L interferone di tipo 1( alfa) esercita una effetto antivirale diretto. E6 e E7 dell HPV16 direttamente inibiscono il segnale dell IFN. L infiammazione è importante per l immunità innata e adattativa. Le proteine precoci dell HPV alterano l espressione dei geni dell MHC di classe I. Cellule NK e macrofagi. La risposta immune adattativa all HPV: La risposta delle cellule T di tipo Th1 è associata con la regressione del papilloma. La risposta immune umorale protegge contro la reinfezione.

35 Manifestazioni cliniche Infezioni anogenitali esterne I condilomi acuminati detti anche verruche anogenitali. Si presentano come papule caratterizzate da leggera ipercheratosidi colore grigiastro e tendono a distribuirsi a livello dell epitelio squamoso dei genitali esterni e delle aree perianali. Il 90% dei condilomi sono associati a HPV6 e 11. Spesso sono asintomatici, a volte sono accompagnati da prurito, bruciore e dolore. Nel 10-20% degli individui immunocompetenti, queste lesioni regrediscono spontaneamente nel giro di 3-4 mesi, mentre nella maggior parte dei casi la regressione è molto più protratta nel tempo.

36 Manifestazioni cliniche Infezioni dell apparato genitale femminile (vagina e cervice). Le verruche a livello vaginale possono presentarsi come condilomi acuminati o piatti, nel caso delle cervice le lesioni sono caratterizzate da condilomi piani, che in colposcopia, avvalendosi dell uso di acido acetico, si presentano come zone biancastre a margini irregolari. Lo sviluppo del cancro della cervice uterina èla conseguenza a livello cellulare causate da HPV ad alto rischio (16,18,31,45). La primaalterazione preneoplasticavalutabile citologicamenteèdetta displasia che regredisce nel 60-70% dei casi.periodo d incubazione tra le 6 settimane fino a 2 anni. Attraverso una serie di alterazioni cellulari progressive che vanno dalla displasia lieve (neoplasia intraepitelialecervicale,cin I), alla moderata (CIN Ia,Ib), alla displasia grave o carcinoma in situ (CIN III), si arrivaal carcinoma invasivo. L evento cruciale che definisce il passaggio dalla displasia a carcinoma èrappresentato dall integrazione del genoma virale nel DNA della cellula infettata, che può richiedere per la sua comparsa anche 10 anni dal momento dell infezione primaria.

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38 Manifestazioni cliniche Infezioni della cute E la verruca classica, una proliferazione benigna autolimitante della cute. Le verruche sono associate ai genotipi 1-4, ma anche 10,27,28, 41,57 e 65, tutti appartenenti al genere alfa. L infezione colpisce lo strato cheratinizzato delle superfici delle mani e dei piedi. Il periodo d incubazione varia dai 2-4 mesi dal momento dell infezione e le caratteristiche della lesione (verruca piana, arrotondata, vegetante) dipendono dal genotipo di HPV infettante. A livello cutaneo si riscontrano anche tutti i genotipi appartenenti al genere beta presenti come flora microbica normale ma anche associati con lo sviluppo di tumori cutanei soprattutto nei soggetti immunodepressi come i soggetti affetti da epidermodisplasia verruciforme (EV), HPV 5 e 8.

39 Manifestazioni cliniche Infezioni del distretto testa /collo I genotipi più frequentemente associati a infezioni del cavo orale sono causate da HPV 6 e 11, che causano la comparsa di piccoli papillomi benigni peduncolati con aspetto rugoso. Si presentano in genere isolati e non rendono a recidivare. Negli adolescenti, tuttavia, l infezione da HPV 6 e 11 può causare la cosiddetta papillomatosi respiratoria ricorrente, caratterizzata dalla comparsa di papillomi a livello della laringe nella zona di transizione tra l epitelio ciliato e l epitelio squamoso. Papillomi bronchiali nei bambini, possono compromettere la funzionalità respiratoria, richiedendo una pronta rimozione chirurgica. Sono recidivanti. I genotipi HPV 6,11, 16 possono essere associati allo sviluppo di carcinoma orofaringeo e tonsillare (HPV 16)

40 Clinica verruche cutanee tumori benigni della testa e del collo verruche anogenitali displasie e neoplasie cervicali

41 Verruche Genitali e Verruche Nongenitali Verruche genitali (trasmissione sessuale) Condilomi acuminati - a cavolfiore Verruche genitali - verruche lisce Verruche piane genitali - verruche piane Papulosi bowenoide - piccole, rilevate Verruche non-genitali (non a trasmissione sessuale) Verruche comuni - mani, dita e ginocchi Verruche plantari - Piedi Verruche piane - mani e viso

42 Verruche mucosali non genitali Papilloma laringeo Papilloma congiuntivale Verruche non genitali Plantar warts

43 Verruche genitali

44 Infezione da HPV Infezione si ha in genere tra i 20 e i 30 anni di età L infezione di solito si risolve spontaneamente (nel 90% dei casi si risolve in 2 anni) Alcune infezioni si stabiliscono e si manifestano con anormalità microscopiche. Vengono risolte dal sistema immune dell ospite La persistenza virale può portare al tumore

45 Condizioni per la trasformazione Caratteristiche delle cellule (in relazione con l infezione virale) Proliferazione cellulare Inibizione dell apoptosi Evasione della risposta immune Ruolo di HPV Infezione persistente-replicazione virale Espressione di proteine virali Mutazioni cellulari nell infezione persistente: assenza delle risposte cellulo-mediate dell ospite Interazioni ormonali Cambi nella trasduzione del segnale

46 HPV PUO ESSERE PRESENTE NELLE CELLULE IN MODO: a) RESIDENZIALE minima quantità può persistere non rilevato per anni può essere a basso rischio o alto rischio b) EPISOMALE l HPV è attivo localizzato nel nucleo della cellula è separato dal DNA umano può essere a basso rischio o ad alto rischio può causare pap test anormali può essere visto colposcopicamente c) INTEGRATO HPV-DNA circolare: è aperto e s integra nel DNA umano solo tipi ad alto rischio causa Pap test anormali visti colposcopicamente possono essere trattati per prevenire il tumore

47 a) RESIDENZIALE Poche cellule basali infettate da HPV Limitata riproduzione di HPV

48 b) EPISOMALE Rilascio di particelle virali Virioni di HPV multipli per cellula 8 Settimane L1/ L2 proteine del capside assemblaggio. La replica del DNA virale continua rapidamente 6 Settimane Espressione geni precoci E6/E7 4 Settimane Espressione geni precoci E4/E5 HPV Cellula basale

49 c) INTEGRATO HPV DNA Integrato nel genoma CIN 3 CIN 3 Cancro

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51 HPV: epidemiologia HPV è resistente all inattivazione e può essere trasmesso per contatto con oggetti contaminati, superfici di banconi, o mobili, pavimenti del bagno asciugamani. L eliminazione asintomatica del virus può promuovere la trasmissione. Le infezioni da HPV vengono trasmesse: a) per contatto diretto e tramite piccole lacerazioni cutanee o delle mucose; b) durante rapporti sessuali c) durante il passaggio del neonato attraverso il canale del parto infetto.

52 Papillomavirus umani (HPV): classificazione Sono stati identificati più di 150 genotipi di HPV (35 genitali) [denominazione: HPV + numero] Un nuovo isolato per essere classificato come nuovo genotipo di HPV deve avere una omologia inferiore al 90% nella sequenza nucleotidica della regione L1 rispetto alla sequenza corrispondente del genoma dei tipi conosciuti Un sottotipo è classificato come tale quando l omologia è compresa tra 90% e 100% (tra 98% e 100% si parla di variante) DIVERSI GENOTIPI SONO ASSOCIATI A DIVERSE PATOLOGIE

53 Associazione tra lesioni cutanee e genotipi di HPV

54 Associazione tra lesioni mucose e genotipi di HPV VIE RESPIRATORIE: Papillomi Ca. laringo-bronchiali CONGIUNTIVA: Papillomi CAVITA ORALE: Iperplasia epiteliale focale Ca. oro-faringei TRATTO GENITALE: Condilomi acuminati Condilomi piani Papulosi bowenoide Ca. vulvari, penieni, anali Ca. cervice uterina 6, 11 16, 18 6, 11 13, 32 16, 18 6, 11 6, 11, 16, 18, , 18, 31, 33, 39, 40, 59, 68 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 67, 68, 71, 74

55 HPV e neoplasia cervicale HPV alto rischio: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 HPV basso rischio: HPV 6, 11, 26, 42, 43, 44, 53, 54, 55, 62, 66

56 Lesioni ano-genitali da HPV Condilomi acuminati e piani a livello dei genitali maschili (pene, scroto) e femminili (cervice uterina, vagina, vulva) e in regione perianale [HPV 6, 11, 16, 18, ecc.] Carcinomi cervicali, vulvari, anali e del pene (e lesioni intraepiteliali squamose [SIL] che li precedono) [HPV 16, 18, 31, 33, 39, 45, 52, 58, ecc.]

57 Prevalenza delle infezioni genitali da HPV Infezione a trasmissione sessuale più frequente nell uomo (50% della popolazione attiva sessualmente è stata infettata da HPV) Correlata al numero e alla frequenza dei partner Correlata all età (massima tra i 15 e i 25 anni) Correlata allo stato immunitario (maggiore in pazienti HIV positivi, in donne in gravidanza) Correlata alle abitudini di vita (fumo, alimentazione, contraccettivi orali)

58 HPV e carcinoma della cervice Prevalenza del 97%-99.7% di DNA di HPV nei carcinomi della cervice (in PCR) I carcinomi della cervice correlati ad HPV sono associati: il 53% al 16 il 15% al 18 il 9% al 45 il 6% al 31 e il 3% al 33

59 Cofattori della progressione tumorale Fattori genetici (anormalità di struttura o numeriche dei cromosomi, riarrangiamenti o sovraespressione di oncogeni cellulari) Antigeni HLA (associazione HLA-cl.IID con carcinoma della cervice) Immunodepressione (infezione da HIV) Coinfezioni con altri virus o microrganismi (HSV-2, Chlamydia) Numero dei parti Fumo Contraccettivi orali Fattori ormonali Dieta (assenza di carotenoidi, vitamina C)

60 Storia naturale dell infezione di HPV L infezione persistente ha un ruolo importante per lo sviluppo della neoplasia cervicale.

61 Neoplasia cervicale: progressione della malattia Mesi Anni Dopo 30 anni Epitelio Normale Infezione HPV Coilocitosi CIN1 CIN2 CIN3 Carcinoma Screening Trattamento ASCUS / LSIL HSIL ASCUS: cellule squamose atipiche di significato non determinato SIL = Lesione intraepiteliale squamosa (low/high) CIN: Cervical Intraepithelial Neoplasia

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63 Persistenza dell infezione HPV In circa dell 1% dei casi il virus tende a persistere. L infezione attiva riemerge dalla latenza durante una immunodeficenza associata a: Gravidanza Radiazioni solari Stress emozionale Stress fisico HIV Chemioterapia antitumorale

64 Diagnosi Acido acetico al 4% (la papula diventa bianca) Verruca: al microscopio si osserva il caratteristico aspetto istologico che consiste in una iperplasia delle cellule spinose e in un eccesso di produzione di ipercheratosi. No Esame colturale No Test sierologici Si ai test di Papanicolau(Paptest) che consiste nel prelievo, tramite spazzolamentodi cellule esfoliate dalla parete della cervice e della vagina e successivo striscio colorato con eosina/ematossilina. All esame citologico questo test permette di individuare fino al 75% dei casi HPV positivi con lesioni da CIN I a CIN III, mettendo in evidenza la presenza di coilociti.

65 Diagnosi di HPV Tuttavia una percentuale intorno al 25% rimane di dubbia interpretazione, per cui oggi si ricorre a tecniche di ibridazione molecolare per la ricerca del genoma di HPV che hanno una maggiore sensibilità e specificità. Tecniche di ibridazione con sonde di DNA o RNA dirette contro genotipi specifici di HPV con la tecnica di PCR. Sequenza diagnostica: Pap test colposcopia PCR

66 Diagnosi microbiologica di infezione: tests molecolari esistono diversi sistemi basati sulla PCR per evidenziare genoma di HPV in campioni biologici (tamponi cervicali e in campioni istologici)

67 Trattamento Colposcopia LEEP (loop electrosurgical excision procedure: procedura di escissione con elettrocauterizzazione) In alternativa metodi chimici (podofillina dal 10-25%) Laser Crioterapia chirurgica (per rimuovere le verruche) Chirurgia generale Stimolatori della risposta innata o infiammatoria quali: IFN o l imiquimod (Aldara), Cidofovir Vaccini (Gardasil)

68 Vaccini I vaccini sono costituiti da subunità della particella virale, definite VLP (virus-like particles), rappresentate dalla proteina capsidica maggiore L1, che contiene gli epitopi virali immunodominanti per la neutralizzazione. Il successo profilattico delle VLP espressi nelle cellule è in grado di autoassemblarsi in strutture simili alla particella virale completa e può indurre alti livelli di anticorpi neutralizzanti.

69 Proprietà delle proteine del capside del virus HPV L1 La proteina L1 può autoassemblarsi in particelle virus-simili (VLPs) che sono antigenicamente identiche ai virioni. Capside naturale: : L1+L2 +DNA Capside costituito solo da L1 GSK: il vaccino anti-hpv contiene HPV L1 virus-like particles (VLPs) non-infettante Proteina ricombinante L1 altamente immunogeno

70 Vaccini SOURCE: Merck and GSK. Science Magazine, Vol. 308, Issue 5722, pages , 29 April 2005

71 HPV L1 Virus-Like-Particle (VLP) Sintesi del vaccino L1 gene dell HPV DNA Inside HPV HPV Capside virale vuoto (VLP) Induce una risposta immune dell ospite L1 gene inserito nel plasmide Trascrizione mrna Traduzione Proteine del capside Cellula eucariotica

72 immunità aspecifica L1 Assemblaggio dei virus Infezione Immunità umorale Vaccini Preventivi per prevenire l acquisizione dei Papilloma Virus E4 E1, E2, E5, E6, E7 Replica del DNA virale Entrata del virione Immunità cellulomediata Vaccini Terapeutici per lesioni da Papilloma Virus già presenti

73 Vaccini Preventivi La protezione conferita dai vaccini è tipospecifica e specie-specifica. Non si conosce la durata della protezione. Tali vaccini non sono efficaci se somministrati dopo il contatto con il virus. Devono essere vaccini polivalenti. Devono essere somministrati prima dell inizio dell attività sessuale.

74 Il vaccino HPV Approvato per le femmine di età dai 9-26 anni 3 dosi a 0, 2, e 6 mesi, im Minimi intervalli: 4 settimane tra la prima e la seconda dose 12 settimane tra la seconda e la terza dose.

75 Vaccini Terapeutici Sono allo studio anche vaccini in grado di stimolare la risposta immunitaria nei confronti delle oncoproteine virali con lo scopo di indurre l eliminazione dei virus in replicazione o di eradicare tumori indotti dall'hpv. Studi su animali hanno fornito dati sull'efficacia dell'utilizzo di proteine virali (E2, E6 ed E7) come vaccini immunoterapeutici per verruche e tumori associati ai papillomavirus.

76 Vaccini terapeutici Recenti studi hanno mostrato il possibile uso di cellule dendritiche caricate con HPV E7 come vaccino in grado di stimolare una risposta immunitaria citotossica (CTL, NK) contro le cellule del cancro della cervice.

77 Polyomaviridae Tra i membri di questa famiglia sono patogeni per l uomo: il virus BK che causa affezioni renali in pazienti sottoposti a trapianto, e il virus JC (JCV), riconosciuto come agente eziologico della Leucoencefalite multifocale progressiva (PML). Inoltre, il virus della scimmia (SV40) sembra aver infettato accidentalmente l uomo con la somministrazione dei primi vaccini antipolio.

78 Polyomaviridae Molecola di DNA bicatenario, circolare (5kb) I virioni hanno il diametro di nm Virus nudi Simmetria icosaedrica, E composto da 72 capsomeri (12 pentoni e 60 esoni). Ogni capsomero è costituito da 5 copie della proteina virale principale (VP1) e da una copia delle proteine strutturali VP1 o VP3. I virioni maturi sono resistenti ai trattamenti con acidi, etere e al calore (50 C, per 1 ora).

79 Polyomaviridae Nel genoma si distinguono: una regione di 2.4kb codificante per le proteine precoci (antigeni T, tumorali, in quanto capaci di legare proteine oncosoppressorie cellulari, quali p53 e prb) e una di 2,3 kb per le proteine tardive (VP1, VP2, VP3 e agnoproteina), separate da una regione di controllo non codificante (NCCR) di circa 0.4kb. Nella NCCR si trovano l origine di replicazione del DNA virale, promotori, attivatori, siti di legame per l antigenet e numerosi fattori di regolazione della trascrizione e della replicazione.

80 Polyomavirus genome

81 Polyomavirus I Polyoma si replicano nel nucleo della cellula ospite. Attacco del virus alla cellula ospite mediante recettori specifici contenenti acido sialico. Endocitosi Trasporto nel nucleo, dove il DNA virale viene liberato dalle proteine Fase precoce e fase tardiva. Gli mrna virali subiscono modifiche post-trascrizionali (es. l aggiunta del cap al 5 e del polya al 3 ) e sono sottoposti a splicing differenziale che consente di utilizzare ORF sovrapposti.

82 Polyomavirus Le proteine precoci vengo trascritte in senso antiorario, sono necessarie per la replicazione virale e sono in grado di attivare enzimi cellulari e la sintesi del DNA. La duplicazione del DNA è operata dalla DNA polimerasi cellulare e inizia quando l antigene T si lega all origine di replicazione. La replicazione procede in modo bidirezionale e termina a 180 dall origine di replicazione, ma nelle fasi tardive dell infezione sono state osservate molecole in fase di replicazione secondo il modello del cerchio rotante. L antigene T, legandosi a siti specifici della NCCR, oltre alla replicazione del DNA attiva la trascrizione dei geni tardivi. Anche le proteine strutturali (VP1, VP2, VP3) e la piccola proteina detta agnoproteina o LP1 (proteina tardiva 1) vengono prodotte da mrna ottenuti per splicing di un trascritto primario. Questa proteina rimane localizzata nel citoplasma, intorno al nucleo della della cellula infetta, dove svolgerebbe un ruolo nel rilascio delle particelle virali o nel mantenimento della struttura del citoscheletro della cellula ospite.

83 Patogenesi dei Polyomavirus

84 Epidemiologia Le infezioni da Poliomavirus sono frequenti e la maggior parte della popolazione viene infettata sia dal virus BK che dal JC entro i 15 anni di età. La trasmissione avviene per via respiratoria. Le infezioni latenti possono essere riattivate in immunodepressi, quali malati di AIDS, trapiantati, o donne in gravidanza. Il 10 % dei pazienti con AIDS sviluppa PML, letale nel 90% dei casi.

85 Clinica L infezione primaria nei bambini è asintomatica. I virus BK e JC sono riattivati in pazienti immunocompromessi come dimostrato dalla presenza del virus nelle urine (cistiti, nefriti) nel 40% di questi pazienti. I virus sono riattivati anche durante la gravidanza, ma non sono stati riscontrati effetti sul feto. Sembra che il virus BK sia associato alla stenosi ureterale osservata nei trapiantati di midollo osseo. La leucoencefalopatia multifocale progressiva (PML) è una malattia demielinizzante subacuta causata dal virus JC che si manifesta nei soggetti ID e causa la distruzione degli oligodendrociti. I primi sintomi riguardano difficoltà di linguaggio, visione e memoria poi la malattia evolve portando alla paralisi, cecità e ad altri disturbi sensoriali. La morte si ha nel giro di 6mesi- 1 anno. Un altra categoria a rischio d infezione è rappresentata dai pazienti sottoposti a trapianto di rene o di midollo. Tra i trapiantati renali negli USA il 22% risulta infettato da BKV e l 11% da JCV. L escrezione urinaria può essere transitoria o persistere per settimane o mesi e, in quest ultimo caso, porta al rigetto dell organo trapiantato in più del 50% dei casi.

86 Clinica Polyomavirus umani e neoplasie Il BKV e il JCV sono in grado di indurre la formazione di tumori negli animali da laboratorio e di trasformare le cellule umane. Sequenze genomiche di BKV e JCV sono state trovate in diversi tipi di tumori, quali mesoteliomi, tumori cerebrali del bambino e dell adulto, nel carcinoma del colon, osteosarcomi e linfomi non- Hodgkin. Al presenza del DNA del SV-40 in tumori quali linfomi, osteosarcomi, tumori cerebrali e mesoteliomi.

87 Diagnosi di Laboratorio La PML viene diagnosticata tramite la PCR nel liquor e con la dimostrazione di lesioni mediante risonanza magnetica oppure la TAC. L esame istologico di tessuto cerebrale mostra focolai di demielinizzazione circondati da oligodendrociti con inclusioni adiacenti alle aree di demielinizzazione. Lesioni nella sostanza bianca. La risposta infiammatoria è minima. Il JC può essere identificato in campioni di urine, liquor o materiale bioptico mediante IFI, PCR,ELISA,IEM, PCR quantitativa o real-time PCR Esame citologico delle urine rilevano la presenza dei virus BK e JC con l osservazione di cellule ingrandite con inclusioni intranucleari basofile.

88 Terapia profilassi e controllo Nessuna terapia Terapia HAART ha ridotto i sintomi di PML. Vidarabina Leflunomide Difficoltà nella prevenzione