Caratterizzazione della comunità microbica

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1 Caratterizzazione della comunità microbica Monitoraggio biologico annuale dell impianto Dipartimento di Biologia Università di Pisa Monitoraggio biologico del reattore Monitoraggio biologico del prototipo Action B.3 17 Novembre 2014 Cesira Giordano

2 2 Fissazione dei campioni 6 aliquote: tq 6 aliquote : etanolo 70% 6 aliquote: saline EDTA 3 aliquote: formaldeide 4% 1 aliquota: tetrossido di osmio 2 aliquote: glicerolo 50% -20 C

3 Monitoraggio annuale dell impianto nel 2013 Sono stati raccolti 97 campioni provenienti da più siti dell impianto (ingresso industriale/preaccumulo; uscita Preaccumulo; Fango Primario/ispessimento; Fango attivo Biologico). Lo schema di campionamento prevedeva il prelievo di 4 campioni, effettuato ogni 2 settimane. 12 campioni di fango attivo biologico sono stati processati per il Next Generation Sequencing (NGS)

4 4 Next Generation Sequencing-NGS PCR 1 amplificazione di V3 e V4 del 16S rrna e ligazione degli adattatori Illumina Purificazione del DNA PCR 2 amplificazione e ligazione degli indici Illumina Purificazione del DNA Quantificazione e pooling Sequenziamento 12 campioni Tot. sequenze Media per campione

5 Risultati preliminari Proteobacteria Planctomycetes Firmicutes Cloroflexi Bacteroidetes Actinobacteria Acidobacteria Risultati preliminari: dominanza relativa delle diverse classi di batteri nei campioni

6 Monitoraggio biologico del reattore Sono stati raccolti 79 campioni Per le prime 2 settimane il campionamento è stato effettuato 2 volte al giorno. Per i 2 mesi successivi 3 volte alla settimana Sono stati processati 30 campioni Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP Clonaggio genico Colture 14/01/14 al 11/04/14

7 T-RFLP Analisi dei polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione PCR con un primer fluorescente Digestione enzimatica Purificazione del DNA Elettroforesi capillare Elettroferogramma di un campione visualizzato con il programma GeneScan (Applied Biosystem ). In blu il tracciato relativo alla comunità microbica, in rosso il marcatore di peso molecolare

8 8 Non-metric Multi Dimensional Scaling - nmmds Metodo di ordinamento grafico che costruisce una mappa di configurazione dei campioni in uno spazio bidimensionale T-RFLP ph 2 ph 7-9 AluI ph 2 ph 7-9 BsuRI Analysis of Similarity - ANOSIM Procedura di permutazione non-parametrica utilizzata per comprendere se le differenze tra i campioni durante lo start up e la fase stazionaria fossero statisticamente significative. Disposizione spaziale nm-mds dei campioni durante la fase di start up (cerchi rossi) e durante la fase stazionaria (cerchi blu). R p AluI BsuRI

9 T-RFLP Canonical Correspondence Analysis CCA Metodo di ordinamento grafico utile per vedere come varia la disposizione dei campioni in base a specifici pattern ambientali: ph, temperatura, solfuri e cloruri somministrati. AluI BsuRI solfuri ph temperatura cloruri cloruri temperatura ph solfuri CCA durante la fase di start up (cerchi rossi) e durante la fase stazionaria (cerchi blu).

10 9 Costruzione delle librerie geniche 1 Clonaggio PCR del 16S rrna 2 3 Digestione enzimatica Screening delle colonie 4 PCR di controllo 5 Estrazione DNA plasmidico Sequenziamento 6

11 11 Librerie geniche Library FBP407 Cesira Giordano NOME TIPO CAMPIONE DATA STATO REATTORE CAMPIONE FBP407A Fango Biologico 21/01/2014 Inoculo FPP106A Fango Primario 21/01/2014 Inoculo NI29M Reattore 14/03/2014 Fase Stazionaria 131 cloni digeriti 28 OTUs 48% phylum Firmicutes

12 12 Librerie geniche Library FPP106A Cesira Giordano NOME TIPO CAMPIONE DATA STATO REATTORE CAMPIONE FBP407A Fango Biologico 21/01/2014 Inoculo FPP106A Fango Primario 21/01/2014 Inoculo NI29M Reattore 14/03/2014 Fase Stazionaria 145 cloni digeriti 64 OTUs

13 13 Librerie geniche Library NI29M Cesira Giordano NOME TIPO CAMPIONE DATA STATO REATTORE CAMPIONE FBP407A Fango Biologico 21/01/2014 Inoculo FPP106A Fango Primario 21/01/2014 Inoculo NI29M Reattore 14/03/2014 Fase Stazionaria 110 cloni digeriti 8 OTUs 65% Halothiobacillus neapolitanus EU662299

14 Prove di isolamento dal reattore Ceppo Risultati BLASTN % di similiarità PFBC1 Acinetobacter venetianus AB ,00% RFPSC3 PFPC2b BYPFP YPFP WPFP Cα18S Corynebacterium variabile NR Halothiobacillus neapolitanus NR Escherichia coli HG Ochrobactrum pseudogrignonense GU Brevundimonas sp. JF Yarrowia lipolytica JQ ,00% 99,00% 100,00% 99,00% 100,00% 99,00% Ceppo Cα18S, Yarrowia lipolytica JQ698926

15 Isolati del reattore Cesira Giordano Ceppo PFPC2b, Halothiobacillus neapolitanus NR Ceppi PFPC2b, Halothiobacillus neapolitanus NR e YPFP, Ochrobactrum pseudogrignonense GU991856

16 Foto al microscopio ottico H. neapolitanus, blu di metilene, 40X Halothiobacillus neapolitanus, 100X H. neapolitanus, blu di metilene, 40X

17 Monitoraggio biologico del prototipo Sono stati raccolti 66 campioni dal liquido di ricircolo della vasca; 38 campioni dal supporto e 3 campioni di biofilm Il campionamento prosegue ad oggi bisettimanalmente sia con la raccolta del liquido dalla vasca che di un pezzo di supporto Sono stati processati 20 campioni del supporto e 24 campioni del liquido di ricircolo della vasca T-RFLP NGS Colture

18 Next Generation Sequencing DATA CAMPIONE 08/04/2014 Fango Biologico 08/04/2014 Fango Primario 19/06/2014 Supporto 9 24/06/2014 Supporto 10 04/07/2014 Supporto 13 29/07/2014 Supporto 20 Popolazione batterica iniziale Test su velocità e frequenza di rotazione dei biodischi ph

19 Prove preliminari di isolamento dal prototipo Ceppo Risultati BLASTN % di similiarità BMJ Penicillium sp. 99,00% KF BL18S Pyxidiophora arvernensis 96,00% FJ MJW Acidithiobacillus sp. KJ ,00% Ceppo BL18S, Pyxidiophora arvernensis FJ Cesira Giordano Ceppo BMJ, Penicillium sp. KF Medium a base di tiosolfato, blu di bromofenolo, amfotericina B

20 20 Biofilm e supporto del prototipo Crescita batterica attorno al biofilm raccolto dal prototipo Crescita batterica attorno al supporto raccolto dal prototipo

21 17 Semina da coltura liquida pura del supporto del prototipo Isolati del prototipo Ceppo MJW, Acidithiobacillus sp. KJ Piastre completamente virate al giallo per l abbassamento del ph Ceppo MJW, Acidithiobacillus sp. KJ473429

22 Prospettive future Conclusione delle analisi sul prototipo Effettuare prove di crescita in laboratorio su campioni di supporto forniti dal personale di UniFi e Cuoiodepur Osservare mediante microscopia elettronica il biofilm prodotto sui supporti Usare i dati sulle sequenze, ottenuti mediante clonaggio genico, isolamento in coltura e NGS, per costruire primers da utilizzare in PCR diagnostiche e sonde oligonucleotidiche specifiche per i batteri di interesse. Grazie per l attenzione