AcroMetrix Oncology Hotspot Control
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- Nicola Riva
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1 AcroMetrix Oncology Hotspot Control -20 C o inferiore Codice catalogo Rischio biologico Uso previsto Il controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control è destinato all'uso con i dosaggi di sequenziamento di nuova generazione (NGS, next generation sequencing) concepiti per identificare mutazioni somatiche nel DNA di campioni umani. Il controllo costituisce un mezzo per valutare le variazioni dei test tra una giornata e l'altra e può essere d'ausilio nell'identificare l'aumento di errori casuali o sistematici, come il cambio di lotto dei reagenti, deviazioni imputabili agli operatori e malfunzionamenti degli strumenti. Questo prodotto è destinato all'uso diagnostico in vitro. Riassunto e spiegazione L'adozione dei metodi NGS nei laboratori clinici si sta diffondendo, con la conseguente necessità di standardizzare procedure, protocolli e materiali per garantire coerenza nei risultati delle analisi tra laboratori, strumenti, piattaforme di test e tecnici di laboratorio. Vari organismi normativi, associazioni professionali e iniziative pubbliche hanno risposto alla rapida crescita delle analisi cliniche NGS divulgando linee guida sui diversi aspetti del controllo qualità (QC) delle analisi cliniche di laboratorio. Ad esempio, la checklist del CAP (College of American Pathologists) per le analisi di patologia molecolare prevede che i laboratori clinici usino controlli positivi in ogni sessione analitica 1. Altre direttive, come le linee guida fornite dallo stato di New York, specificano l impiego di controlli a bassa frequenza contenenti diverse varianti di ogni tipo 2 mentre il gruppo di lavoro Nex-StoCT del CDC consiglia l'uso di materiali contenenti la maggior parte delle varianti, se non tutte 3. In quanto controllo di qualità proprietario altamente multiplexato per la determinazione del DNA, il controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control è stato progettato per consentire ai laboratori di controllare le centinaia di ampliconi target dei pannelli NGS. Contiene oltre 500 mutazioni provenienti dal database COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer), oltre a cinque tipi di varianti con nucleotidi di lunghezza variabile. I 53 geni rappresentati nel controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control sono: ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, EZH2, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FOXL2, GNA11, GNAQ, GNAS, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MAP2K1, MET, MLH1, MPL, MSH6, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RB1, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53, VHL
2 Principi della procedura Document Number MAN Effective Date 18 Aug 14 Rev A.00 Language: IT Il controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control è composto da una miscela di DNA sintetico e DNA genomico in soluzione tampone stabilizzante. Il DNA genomico proviene dalla stessa linea cellulare (GM24385) usata per lo sviluppo di un materiale di riferimento del consorzio Genome in a Bottle del NIST. Il DNA sintetico, presente a basse frequenze, introduce centinaia di varianti spesso osservate come mutazioni somatiche nel cancro. Queste 521 varianti sono state tutte confermate con il metodo di sequenziamento Sanger. Tabella 1. Distribuzione dei tipi di varianti nel controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control Varianti sintetiche Varianti genomiche Range di frequenza target 5-15% 15-35% N.p. Varianti di singolo nucleotide (SNV) * Varianti di più nucleotidi (MNV) Delezioni Inserzioni 9 8 2* Varianti complesse * Le varianti rilevate nel DNA genomico sono state confermate usando informazioni di pubblico dominio sul sequenziamento dell'intero genoma per la linea GM Le varianti genomiche saranno aggiornate non appena saranno disponibili informazioni dal materiale di riferimento del Genome in a Bottle. Reagenti di controllo Codice catalogo Nome controllo Quantità AcroMetrix Oncology Hotspot Control 3 x 25 µl Precauzioni Avvertenza Il controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control contiene DNA non incapsulato. Benché il DNA non incapsulato non sia ritenuto pericoloso, si consiglia di manipolare il controllo come prodotto a potenziale rischio biologico. Pertanto, durante la manipolazione di tali materiali, rispettare le misure precauzionali universalmente stabilite per prevenire la trasmissione di agenti infettivi 4,5,6. Non pipettare con la bocca. Servirsi di mezzi di protezione personale, quali camici, guanti e occhiali protettivi. Non mangiare, bere o fumare nelle aree dove vengono manipolati i campioni. Disinfettare eventuali zone di dispersione di liquidi, materiali o schizzi con una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5%. Smaltire tutti i materiali e i liquidi usati nella procedura come se contenessero agenti patogeni. Questo prodotto contiene ProClin 950 allo 0,0095% come conservante. Le schede dei dati di sicurezza dei materiali (MSDS) sono disponibili con il codice prodotto MSDS Istruzioni per la conservazione Conservare a temperature pari o inferiori a -20 C. Non usare questi prodotti oltre la data di scadenza stampata sull'etichetta. Per evitare la contaminazione, manipolare il prodotto seguendo tecniche standard e buone prassi di laboratorio.
3 Istruzioni per l'uso Document Number MAN Effective Date 18 Aug 14 Rev A.00 Language: IT Decongelare il controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control a temperatura ambiente, vortexarlo delicatamente e centrifugarlo in modalità pulse-spin (4-6 secondi) per raccogliere il contenuto al fondo della provetta. Introdurre il DNA di controllo come campione indipendente nella fase del flusso di lavoro NGS che prevede la preparazione della libreria. Il controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control deve essere manipolato in modo analogo al DNA genomico estratto da campioni di routine e analizzato in parallelo con tali campioni. Il controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control può essere sottoposto a un massimo di cinque cicli di congelamento e decongelamento. Inoltre, può essere conservato a temperature comprese fra 2 C e 8 C per 6 giorni per un massimo di quattro utilizzi. Interpretazione dei risultati I risultati di rilevazione delle varianti del controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control possono differire in base al metodo di preparazione della libreria, al metodo di sequenziamento e alla pipeline bioinformatica. Al fine di determinare le prestazioni di base, l'utilizzatore deve includere risultati di più sessioni in condizioni diverse (ad es., operatori, sessioni analitiche, giornate differenti) per creare un elenco di varianti attese che sia specifico per il laboratorio di pertinenza. Una volta compreso il range di prestazioni, l'elenco di varianti attese può essere usato per confrontare i risultati del controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control per ciascuna sessione successiva. Risultati attesi Per verificare quante varianti del controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control possono essere rilevate dal metodo NGS, sono stati usati tre pannelli di test per la preparazione della libreria: il pannello Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 (CHPv2) su Personal Genome Machine (PGM ), il pannello TruSeq Amplicon Cancer Panel (TSACP) su MiSeq e il pannello TruSight Tumor Panel (TSTP) su MiSeq. In ciascun pannello di test per la preparazione della libreria sono stati usati i seguenti volumi di input del controllo: Pannello di test per la preparazione della libreria Volume di AcroMetrix Oncology Hotspot Control Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 2,5 µl TruSeq Amplicon Cancer Panel 5 µl TruSight Tumor Panel 10 µl (in ogni preparazione della libreria)
4 Per ciascun pannello, sono stati analizzati in duplicato due lotti di controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control in almeno due centri. Altri centri hanno analizzato uno solo dei lotti almeno due volte o entrambi i lotti una volta. Le variabili tra i centri possono essere riconducibili a differenze in strumenti, operazioni e flussi di lavoro generali. Inoltre, variazioni nelle pipeline bioinformatiche possono aver contribuito significativamente alla diversità dei risultati prestazionali. Figura 1. Differenze prestazionali tra i diversi centri e pannelli Il numero medio di varianti dei diversi tipi rilevate con il controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control è indicato per centro e raggruppato per pannello. Nota Il numero totale di varianti per ciascun tipo è diverso in ciascun pannello.
5 Per valutare la rilevazione di specifiche varianti tra pannelli differenti, sono state selezionate 22 varianti clinicamente significative che erano state il target di tre pannelli. Figura 2. Rilevazione di 22 varianti selezionate tra pannelli L'analisi è stata condotta con i dati provenienti dai centri che avevano analizzato due lotti di controllo almeno una volta o un lotto almeno due volte. La presenza delle varianti è indicata in blu scuro e l'assenza in grigio chiaro. Le differenze tra i centri sono evidenti, anche tra quelli che hanno utilizzato lo stesso metodo di preparazione della libreria, e ciò indica la probabilità che la pipeline bioinformatica abbia influito fortemente sulle prestazioni. Panel CHPv2 TSACP TSTP Site # Lot # Run/Prep# A B A B Target Gene Mutation CDS Mutation AA Frequency H11H11H11H11H00 H00 H00H00H00H00H00H00H00H00H00H00H00H00H00H00H00H00H00H11 H11 H11 H11 H11 H11 H00H00H00H00H00H00H00H00H00 H00 H00 H00 H00 H00 H11 H11 H11H11H11 H11 H11H11 NRAS c.182a>g p.q61r ALK c.3522c>a p.f1174l CTNNB1 c.121a>g p.t41a CTNNB1 c.134c>t p.s45f PIK3CA c.1624g>a p.e542k PIK3CA c.1633g>a p.e545k PIK3CA c.3140a>g p.h1047r PDGFRA c.2525a>t p.d842v % KIT c.2558g>a p.w853* FGFR2 c.755c>g p.s252w KRAS c.183a>c p.q61h KRAS c.35g>a p.g12d AKT1 c.49g>a p.e17k TP53 c.818g>a p.r273h TP53 c.743g>a p.r248q GNAS c.601c>t p.r201c EGFR c.2235_2249del15 p.e746_a750delelrea EGFR c.2573t>g p.l858r EGFR c.2582t>a p.l861q % MET c.3757t>g p.y1253d BRAF c.1799t>a p.v600e PTEN c.202t>c p.y68h Un riepilogo delle prestazioni ottenute con i diversi metodi per tutte le varianti è disponibile nella pagina del prodotto sul sito Web di Life Technologies: I risultati forniti dal produttore hanno esclusivamente scopo informativo. L'utilizzatore finale ha la responsabilità di stabilire i propri criteri prestazionali.
6 Per valutare la coerenza tra i lotti di produzione del controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control, presso quattro centri sono stati preparati e analizzati due lotti di controllo con il pannello Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2. Ogni lotto è stato analizzato 1-2 volte in ciascun centro. Figura 3. Coerenza tra i lotti I diagrammi a scatola e baffi relativi alle requenze osservate con il metodo NGS sono raggruppati per frequenza del target e tipo di variante. La similarità tra quartili superiori, quartili inferiori e valore mediano (indicato in rosso) tra il lotto 1 e il lotto 2 per ciascun tipo di variante dimostra la coerenza della rilevazione tra i diversi lotti dello stesso controllo Frequency Control Lot Complex DEL INS MNV SNV DEL INS SNV INS 15-35% 5-15% genomic SNV Variant Type Target Frequency Limitazioni Il controllo AcroMetrix Oncology Hotspot Control è destinato all'uso diagnostico in vitro. Non è finalizzato alla sostituzione dei controlli interni forniti dalle ditte produttrici di kit diagnostici in vitro. Bibliografia 1. College of American Pathologists (CAP) Laboratory Accreditation Checklist 2. New York State Clinical Laboratory Evaluation Program (CLEP) Laboratory Standards. 3. Gargis AS, et al. Nature Biotechnology. 30, (2012). 4. Centers for Disease Control (CDC). Recommendations for prevention of HIV transmission in health care settings. MMWR 1987; 36 (supplement no. 2S). 5. Centers for Disease Control (CDC). Update: Universal precautions for prevention of transmission of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, and other bloodborne pathogens in health-care settings. MMWR 1988; 37: Centers for Disease Control (CDC). Guidelines for prevention of transmission of human immunodeficiency virus and hepatitis B virus to health-care and public-safety workers. MMWR 1989; 38(S-6): 1-36.
7 Legenda dei simboli sulle etichette Codice lotto Data di scadenza Produttore Limiti di temperatura Rischio biologico Attenzione Codice catalogo Per uso diagnostico in vitro Marchio europeo di conformità Rappresentante autorizzato Licenza per uso limitato n. 524 AcroMetrix Oncology Hostspot Control (IVD) Avviso all'acquirente L'acquisto di questo prodotto concede all'acquirente il diritto limitato e non trasferibile di usare la quantità di prodotto acquistata esclusivamente a scopo di ricerca e solo in base ai brevetti posseduti e/o controllati da Life Technologies Corporation riguardanti in modo esplicito questo controllo Acrometrix Oncology Hotspot Control e i relativi metodi di utilizzo. Non vengono concessi, espressamente, implicitamente o per preclusione, diritti di alcun genere basati su altri brevetti (inclusi quelli necessariamente violati in virtù dell'uso del prodotto per lo scopo previsto), né diritti riguardanti altri utilizzi. Per informazioni sull'ottenimento di diritti ulteriori, rivolgersi a outlicensing@lifetech.com oppure Out Licensing, Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008, U.S.A. Licenza per uso limitato n. 451 Divieto di rivendita Avviso all'acquirente La rivendita del presente prodotto è espressamente proibita. Non viene concesso alcun diritto di rivendita del presente prodotto o dei suoi componenti, espressamente, implicitament o per preclusione. Per informazioni sull'ottenimento di diritti ulteriori, rivolgersi a outlicensing@lifetech.com oppure Out Licensing, Life Technologies, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008, U.S.A Life Technologies Corporation. Tutti i diritti riservati. I marchi di fabbrica citati in questo documento sono di proprietà di Life Technologies Corporation o dei rispettivi titolari. ProClin è un marchio di fabbrica di Rohm and Haas Company. TruSeq, MiSeq e TruSight sono marchi di fabbrica di Illumina, Inc.
8 Produttore: AcroMetrix Corporation, 6010 Egret Court, Benicia, CA 94510, U.S.A. Rappresentante per l'europa: Life Technologies LTD, 3 Fountain Drive, Inchinnan Business Park, Paisley PA4 9RF, Regno Unito ESONERO DA GARANZIE LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION E/O LE SUE AFFILIATE NON RICONOSCONO ALCUNA GARANZIA IN RELAZIONE AL PRESENTE DOCUMENTO, SIA ESSA ESPRESSA O IMPLICITA, COMPRESE, A TITOLO ESEMPLIFICATIVO, LE GARANZIE DI COMMERCIABILITÀ, DI IDONEITÀ A UNO SCOPO PARTICOLARE E DI NON VIOLAZIONE DI ALCUN DIRITTO. IN NESSUN CASO, NELLA MISURA CONSENTITA DALLA LEGGE, LIFE TECHNOLOGIES E/O LE SUE AFFILIATE SARANNO RESPONSABILI, PER CONTRATTO, TORTO, GARANZIA O IN VIRTÙ DI QUALSIASI REGOLAMENTO O QUALSIASI ALTRO FONDAMENTO, DI DANNI SPECIALI, INCIDENTALI, INDIRETTI, PUNITIVI, MULTIPLI O CONSEGUENTI CORRELATI A QUESTO DOCUMENTO O DA ESSO DERIVANTI, COMPRESO, A TITOLO ESEMPLIFICATIVO, L'USO DELLO STESSO. Garanzia limitata del prodotto Life Technologies Corporation e/o le sue affiliate garantiscono i propri prodotti come indicato nei Termini e condizioni generali di vendita (General Terms and Conditions of Sale) di Life Technologies, reperibili nel sito Web di Life Technologies all'indirizzo Per qualsiasi quesito, contattare Life Technologies all'indirizzo AcroMetrix Corporation è una sussidiaria di proprietà di Life Technologies Corporation Sede centrale di Life Technologies Corporation 5791 Van Allen Way Carlsbad, CA 92008, U.S.A. Tel.: Numero verde negli U.S.A.: Per assistenza, visitare il sito o inviare un' all'indirizzo techsupport@lifetech.com
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