Elucigene CF-EU2v1 Istruzioni per l uso

Transcript

1 Elucigene CF-EU2v1 Istruzioni per l uso Cod. catalogo: CF2EUB2 50 test CF2EUBX 10 test Per uso diagnostico in vitro Prodotto da: Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ Vendita, assistenza clienti e assistenza tecnica: T: +44 (0) F: +44 (0) E: enquiries@elucigene.com E: techsupport@elucigene.com Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered in England and Wales, registration number CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 1 di 23

2 Elucigene CF-EU2v1 Utilizzo previsto Per la rilevazione qualitativa simultanea in vitro delle seguenti mutazioni del gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) umano nel DNA estratto da campioni di sangue intero (conservato in EDTA) e gocce di sangue essicate su carta da filtro: Tradizionale Secondo le linee guida HGVS * cdna name Protein name CFTRdele2,3 c _ del Protein (c _ del21080) name E60X c.178g>t p.glu60x P67L c.200c>t p.pro67leu G85E c.254g>a p.gly85glu 394delTT c.262_263del (c.262_263deltt) p.leu88ilefsx22 444delA c.313del (c.313dela) p.ile105serfsx2 R117C c.349c>t p.arg117cys R117H c.350g>a p.arg117his Y122X c.366t>a p.tyr122x 621+1G>T c.489+1g>t 711+1G>T c.579+1g>t L206W c.617t>g p.leu206trp 1078delT c.948del(c.948delt) p.phe316leufsx12 R334W c.1000c>t p.arg334trp R347P c.1040g>c p.arg347pro R347H c.1040g>a p.arg347his A455E c.1364c>a p.ala455glu I507del c.1519_1521del (c.1519_1521delatc) p.ile507del F508del c.1521_1523del (c.1521_1523delctt) p.phe508del 1677delTA c.1545_1546del (c.1545_1546delta) p.tyr515x V520F c.1558g>t p.val 520Phe G>A c g>a G542X c.1624g>t p.gly542x S549R(T>G) c.1647t>g p.ser549arg S549N c.1646g>a p.ser549asn G551D c.1652g>a p.gly551asp R553X c.1657c>t p.arg553x R560T c.1679g>c p.arg560thr kbA>G c a>g G>A c g>a 2143delT c.2012del (c.2012delt) p.leu671x 2184delA c.2052del (c.2052dela) p.lys684asnfsx delG c.2215del (c.2215delg) p.val739tyrfsx16 W846X c.2538g>a p.trp846x G>A c g>a Q890X c.2668c>t p.gln890x G>A c g>a CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 2 di 23

3 Tradizionale Secondo le linee guida HGVS * A>G c A>G cdna name Protein name R1066C c.3196c>t p.arg1066cys Y1092X(C>A) c.3276c>a p.tyr1092x M1101K c.3302t>a p.met1101lys D1152H c.3454g>c p.asp1152his R1158X c.3472c>t p.arg1158x R1162X c.3484c>t p.arg1162x Protein name 3659delC c.3528del (c.3528delc) p.lys1177serfsx kbC>T c c>t S1251N c.3752g>a p.ser1251asn 3905insT c.3773dup (c.3773dupt) p.leu1258phefsx7 W1282X c.3846g>a p.trp1282x N1303K c.3909c>g p.asn1303lys * with reference to Mutation Nomenclature in Practice: Findings and Recommendations from the Cystic Fibrosis External Quality Assessment Scheme. Berwouts S, Morris M, Girodon G, Schwarz M, Stuhrmann M and Dequeker E. Human Mutation, Vol.00, No. 0, 1-7 (2011) CF-EU2v1 è in grado di distinguere tra individui eterozigoti e omozigoti per le suddette mutazioni e varianti ad eccezione di S549R(T>G) (consultare la sezione sulla reattività crociata nel presente documento). Riepilogo e spiegazione La fibrosi cistica (FC) è la malattia autosomica recessiva con morte precoce più comune nella popolazione caucasica. L incidenza della malattia è di 1 su 3200 nati vivi tra individui di razza caucasica (1). Nella popolazione caucasica, la frequenza tra gli eterozigoti è circa di 1 su 25. La fibrosi cistica colpisce il tessuto epiteliale di diversi organi determinando una complessa patologia multisistemica che riguarda il pancreas esocrino, l intestino, il tratto respiratorio, il tratto genitale maschile e le ghiandole sudoripare esocrine. L espressione della malattia varia in base alla gravità delle mutazioni del gene CFTR (2), ai modificatori genetici (3) e ai fattori ambientali (4). L intervallo di variabilità va dalla morte nella prima infanzia a causa di malattia polmonare ostruttiva progressiva con bronchiectasia, all insufficienza pancreatica accompagnata da malattia polmonare ostruttiva gradualmente progressiva durante l adolescenza e crescente frequenza di ospedalizzazione per malattia polmonare all inizio dell età adulta, a ricorrente sinusite e bronchite o infertilità maschile in giovane età adulta. Nella maggior parte dei casi, la diagnosi di fibrosi cistica viene stabilita in individui con uno o più fenotipi caratteristici della FC oltre all evidenza di un anomalia nella funzione del CFTR in base a una delle seguenti condizioni: presenza di due mutazioni responsabili della malattia nel gene CFTR o due valori quantitativi anomali del cloro nel sudore ottenuti mediante iontoforesi alla pilocarpina (>60 meq/l) o misure della differenza di potenziale transepiteliale nasale caratteristiche della FC. Il tasso di rilevazione della mutazione del CFTR varia in base alla metodica di analisi e alla razza. In alcuni individui sintomatici, è rilevabile solo una o nessuna mutazione patologica; in alcuni portatori la mutazione patologica non è rilevabile. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 3 di 23

4 Le malattie correlate al gene CFTR sono ereditate in modalità autosomica recessiva. I fratelli o sorelle di un probando con fibrosi cistica hanno una probabilità del 25% di essere affetti, una probabilità del 50% di essere portatori asintomatici e una probabilità del 25% di non essere né affetti né portatori. L analisi genetica molecolare volta all individuazione delle mutazioni che causano la malattia (s) nel gene CFTR viene utilizzata per la rilevazione dei vettori in programmi di screening della popolazione. È disponibile l analisi prenatale per gravidanze a maggiore rischio di malattie correlate al gene CFTR se sono note in ambito famigliare mutazioni patologiche. Dalla scoperta del gene CFTR nel 1989 (5), sono state descritte più di 1700 mutazioni e varianti (6). Molte di queste mutazioni sono private, nel senso che sono state descritte in un solo paziente e/o in una sola famiglia. Analisi di routine per tutte le mutazioni possibili non sono né fattibili né economicamente convenienti e ci si limita pertanto all analisi delle mutazioni più comuni. CF-EU2v1 è un kit di analisi della fibrosi cistica concepito espressamente per studiare le mutazioni più comuni presenti nelle popolazioni di origine europea. L analisi identifica un totale di 50 mutazioni e analizza inoltre il tratto poly T (politimidina) dell introne 9 con una misurazione accurata della ripetizione TG adiacente. Il tratto di timidina polimorfica alla giunzione dell introne 9 e dell esone 10 influenza la trascrizione. Il numero di residui di timidina (5T, 7T o 9T) influisce sull efficienza di splicing dell esone 10; se è presente l allelo 5T, sarà assente una proporzione di trascritti dell esone 10 dando luogo a una proteina non funzionale e a sintomi di FC variabili. È stato segnalato che il numero di ripetizioni TG dal 5 al tratto della politimidina può influire anche sullo splicing dell esone 10 (7). Se presente sullo stesso allelo della variante 5T, quanto più a lungo sarà il numero delle ripetizioni TG, tanto più elevata sarà la proporzione di trascritti CFTR nei quali manca l esone 10. Il numero di ripetizioni TG può essere determinato utilizzando CF-EU2v1 mediante la valutazione delle dimensioni dei picchi degli ampliconi 5T. Principi della procedura La metodica utilizzata dal kit Elucigene CF-EU2v1 si avvale della tecnologia di amplificazione allelespecifica a fluorescenza basata sul sistema delle mutazioni refrattarie all amplificazione (Amplification Refractory Mutation System, ARMS), che rileva mutazioni puntiformi, inserzioni o delezioni nel DNA (8). La tecnologia ARMS si basa sul principio che, in determinate condizioni, gli oligonucleotidi con un residuo non appaiato in corrispondenza del 3 non funzionano come primer nella reazione a catena delle polimerasi (PCR). La selezione di oligonucleotidi appropriati rende possibile l amplificazione e la rilevazione di specifiche sequenze di DNA mutanti o normali. Le sequenze amplificate (ampliconi) vengono separate mediante elettroforesi capillare utilizzando un analizzatore genetico Applied Biosystems. Il software di analisi permette l identificazione e la marcatura degli ampliconi in base alle loro dimensioni e al tipo di colorante. Elucigene CF-EU2v1 è un test multiplex ad ampio spettro che prevede due reazioni di PCR (A e B). Cinquanta sequenze mutanti per il gene CFTR vengono rilevate nella miscela A e visualizzate come picchi di ampliconi blu. Le corrispondenti sequenze normali non mutate (genotipo selvatico o wild-type) vengono rilevate nella miscela B e visualizzate come picchi di ampliconi verdi. La miscela A permette inoltre di rilevare la sequenza normale per le mutazioni più comunemente osservate che causano fibrosi cistica nelle popolazioni caucasiche, denominata F508del e visualizzata come un picco di ampliconi verde. Nella miscela A vengono rilevate altre sequenze ripetute poly T, visualizzate come picchi di ampliconi neri. I marker di controllo interno dell amplificazione (non fibrosi cistica) sono inclusi sia nella miscela A che nella miscela B per monitorare l efficienza dell amplificazione dei campioni e vengono visualizzati come picchi di ampliconi rossi. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 4 di 23

5 Avvertenze e precauzioni 1. Il DNA di controllo fornito con questo kit, di origine umana e testato indipendentemente con un analisi basata sulla PRC, è risultato negativo per il virus dell epatite B (HBV), dell epatite C (HCV) e per il virus dell immunodeficienza umana 1 (HIV1). 2. Si consiglia di maneggiare con cautela il materiale di origine umana. Tutti i campioni devono essere considerati potenzialmente infettivi. Nessun metodo di analisi può offrire la certezza assoluta dell assenza dei virus HBV, HCV e HIV 1 o di altri agenti infettivi. 3. La manipolazione dei campioni e dei componenti del test, il loro utilizzo, la conservazione e lo smaltimento devono avvenire in conformità con le procedure definite dalle rispettive linee guida o regolamenti nazionali in materia di sicurezza in ambito biologico. 4. In osservanza delle buone pratiche di laboratorio correnti, i laboratori devono analizzare i propri campioni di controllo di qualità interno contenenti un genotipo noto in ciascuna analisi, in modo da poter valutare la validità della procedura. 5. Se la scatola del kit è danneggiata, anche il contenuto potrebbe essere danneggiato; non utilizzare il kit e contattare l assistenza clienti. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 5 di 23

6 Simboli usati sulle etichette I simboli utilizzati su tutte le etichette e le confezioni sono conformi allo standard armonizzato ISO15223 Produttore Numero di test Vedere le istruzioni per l uso X C Conservare al di sotto della temperatura indicata Utilizzare prima della data indicata Codice catalogo Numero di lotto o partita Dispositivo medico-diagnostico in vitro CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 6 di 23

7 Materiali forniti I reagenti devono essere conservati in un area esente da prodotto DNA o PCR contaminante. Tutti i reagenti devono essere forniti pronti per l uso. Sia i reagenti sigillati che quelli aperti devono essere conservati a -20 C. I reagenti aperti possono essere conservati per un massimo di 3 mesi. Sono forniti materiali sufficienti per 50 (10) test: 2 fiale da 120µl (50µl) di miscela di primer A CF-EU2v1, contenente primer per amplificare i seguenti alleli mutanti: R347H, R347P, G>A, G>A, 711+1G>T, R334W, I507del, F508del, kbC>T, 1677delTA, 1078delT, V520F, L206W, W1282X, R560T, 2347delG, Q890X, R553X, G551D, S549N, M1101K, G542X, 3905insT, Y1092X(C>A), S1251N, 444delA, kbA>G, G>A, R117H, R117C, N1303K, Y122X, 394delTT, G85E, R1066C, G>A, W846X, 2184delA, D1152H, CFTRdele2,3, P67L, 2143delT, E60X, 3659delC, A>G, 621+1G>T, A455E, R1162X e R1158X. Questa miscela contiene anche primer wild-type per il rilevamento dell allele F508del normale, primer per il rilevamento delle varianti della politimidina, IVS8-5T, IVS8-7T, IVS8-9T e primer per l identificazione di 2 marker STR (ripetizioni in tandem brevi, short tandem repeat) ipervariabili (450043). 2 fiale da 120µl (50µl) di miscela di primer B CF-EU2v1, contenente primer wild-type per amplificare gli alleli normali dei mutanti amplificati dalla miscela di primer A, ad eccezione di F508del, l allele normale amplificato dai primer inclusi nella miscela di primer A. Questa miscela contiene anche primer per l identificazione di 2 marker STR ipervariabili (450044). 2 fiale da 400µl (75 l) di miscela master per PCR contenente HotStart Taq DNA polimerasi e deossinucleotidi trifosfati in tampone (450045). 1 fiala da 50 µl di DNA di controllo in concentrazione di 6 ng/μl, normale per le mutazioni rilevate da Elucigene CF-EU2v Materiali necessari ma non forniti Materiale di consumo di laboratorio: guanti; provette per microcentrifuga con tappo a vite; fiale per PCR da 0,2 ml o piastre di microtitolazione consigliate dal produttore del termociclatore utilizzato; puntali per pipette. Preparazione del DNA Minikit per DNA QIAamp (Qiagen GmbH, n. cat /51306) o un prodotto equivalente. Elettroforesi capillare GeneScan 600 LIZ, size standard (ABI, n. cat ) o GeneScan 600v2 LIZ, size standard (ABI, n. cat ), multicapillare DS-33 (set colorante G5) matrix standard (ABI, n. cat ), polimero POP-7 (ABI, n. cat ), tampone per analizzatore genetico 10x (ABI, n. cat ) e formamide Hi-Di (ABI, n. cat ). Nota Assicurarsi che tutti i materiali utilizzati rientrino nella data di stabilità indicata dal produttore. Apparecchiatura necessaria Apparecchiature di laboratorio: pipette di precisione (2 set: 1 per la pre-amplificazione e 1 per la manipolazione post-amplificazione); indumenti di protezione; agitatore vortex; microcentrifuga; centrifuga con piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Amplificazione mediante PCR: termociclatore adatto a contenere piastre per microtitolazione a 96 pozzetti o fiale da 0,2 ml, con accuratezza di temperatura minima di +/-1 C tra 33 C e 100 C e uniformità di temperatura statica di +/-1 C. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 7 di 23

8 Nota Il termociclatore deve essere sottoposto a regolare manutenzione in base alle istruzioni del produttore e tarato per garantire un ciclo di PCR accurato e un rendimento ottimale. Il test Elucigene CF- EU2v1 è stato sviluppato su termociclatori Applied Biosystems Altre marche e modelli devono essere completamente testati e valutati dall operatore per garantire un rendimento ottimale, prima di riportare i risultati ottenuti con il test CF-EU2v1. Elettroforesi capillare: analizzatore genetico ABI 3130/3500 (con software di analisi dei frammenti GeneMapper), array di capillari di 36 cm o 50 cm (ABI3500), 96 piastre ottiche a 96 pozzetti, setti per 96 pozzetti, cassette per 96 pozzetti. Nota Le apparecchiature per elettroforesi capillare devono essere sottoposte a regolare manutenzione in base alle istruzioni del produttore e tarata per garantire un rendimento ottimale. Prelievo e conservazione dei campioni Campioni di sangue intero (in EDTA) e gocce di sangue essiccate su carta da filtro sono stati giudicati compatibili con questo test. È stato segnalato che talvolta i dispositivi di prelievo dei campioni hanno influito in modo negativo sull integrità di determinati analiti e che potrebbero interferire con alcune tecnologie metodologiche (9). Si raccomanda a ciascun operatore di assicurarsi che il dispositivo selezionato sia usato secondo le istruzioni della ditta produttrice e che i dispositivi di prelievo dei campioni siano compatibili con questo test. I campioni di sangue devono essere conservati a -20 C prima della preparazione del DNA. Evitare di congelare e scongelare ripetutamente il campione. Preparazione di DNA da campioni di sangue intero (trattato con EDTA) Si ottengono sempre risultati con DNA estratto con kit di sangue per DNA da 96 QIAamp (o il minikit per DNA QIAamp con Proteinasi K) seguendo il protocollo descritto nel manuale QIAamp partendo con 200 μl di sangue intero liquido e procedendo all eluizione in 200 μl di acqua per biologia molecolare. Preparazione di DNA da gocce di sangue essiccate su carta da filtro Si ottengono sempre risultati con DNA estratto con il minikit per DNA QIAamp seguendo il protocollo descritto nel manuale QIAamp, ma partendo con 2 dischi da 3 mm di un campione di sangue secco e procedendo all eluizione in 100 μl di acqua per biologia molecolare. Prima di usare i risultati a scopo diagnostico, si raccomanda di valutare accuratamente con il test Elucigene CF-EU2v1 metodi e tipi di campioni alternativi per l estrazione del DNA. Considerazioni importanti Quantitativo di DNA In condizioni ottimali e con l utilizzo delle configurazioni raccomandate per l iniezione dei campioni impostate nei moduli di analisi per la colonna capillare (vedere la nota nella sezione Elettroforesi capillare), sono stati ottenuti sistematicamente risultati accettabili da DNA estratto con i suddetti metodi a concentrazioni comprese tra 1,5 ng/μl e 25 ng/μl. La quantificazione del DNA è molto importante: per garantire risultati ottimali, è necessario misurare la concentrazione di ogni campione di DNA da analizzare. Sono accettabili tecniche quali la fluorescenza PicoGreen o l assorbanza UV. Data la varietà di tecniche per la quantificazione del DNA, l operatore dovrebbe adottare i seguenti accorgimenti. Quantitativi molto elevati di DNA di input aumenteranno la probabilità che i picchi di fondo vengano marcati dal software di analisi. Per ridurre la probabilità che i picchi di fondo vengano marcati, è possibile seguire la procedura riportata di seguito: diluire il campione di DNA e ripetere l amplificazione; ridurre il tempo di iniezione (vedere la sezione Elettroforesi capillare); aumentare la soglia di ampiezza minima dei picchi (vedere la Guida al software di analisi Elucigene CF-EU2v1). Bassi quantitativi di DNA di input aumenteranno la probabilità di ottenere picchi diagnostici deboli che non vengono marcati dal software di analisi. Per aumentare il segnale, è possibile seguire la procedura riportata di seguito: portare il tempo di iniezione a 36 secondi, opzione fortemente consigliata per le estrazioni da gocce di sangue essiccate su carta filtro (vedere la sezione Elettroforesi capillare); CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 8 di 23

9 estrarre nuovamente il campione costituito da gocce di sangue essiccate su carta da filtro ed eluirlo in un volume di acqua ridotto (50 μl); aumentare il numero di campioni per l estrazione, costituti da gocce di sangue essiccate su carta da filtro, portandolo a 4 dischetti da 3 mm. Considerazioni importanti Qualità del DNA CF-EU2v1 è un test multiplex ad ampio spettro e per funzionare in maniera ottimale richiede un efficace amplificazione mediante PCR. La qualità del DNA può determinare l efficienza del processo di PCR. Gli inibitori estratti in concomitanza ai campioni di DNA possono dar luogo a un amplificazione non ottimale con conseguenti picchi deboli e scarsamente bilanciati. Elucigene ha convalidato l uso del kit QIAmp da 96 per l estrazione del DNA da campioni di sangue e del mini kit QIAmp per l estrazione del DNA (QIAGEN GmbH) con il kit CF-EU2v1. Altri kit o metodi di estrazione del DNA devono essere convalidati e ottimizzati per l uso con CF-EU2v1. Nota Per maggiori informazioni, consultare la Guida alla risoluzione dei problemi Elucigene CF-EU2v1. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 9 di 23

10 Protocollo del test Controllo della contaminazione nella PCR Il processo di PCR genera un gran numero di prodotti amplificati (ampliconi) e porta con sé un alto rischio di contaminazione che può causare falsi risultati. La contaminazione può derivare da due fonti: Contaminazione crociata: contaminazione del campione con materiale non amplificato proveniente dall ambiente circostante o con altri campioni contenenti la sequenza bersaglio. Contaminazione da prodotto finale: contaminazione del campione con ampliconi di precedenti PCR che determinano l amplificazione sia dell amplicone bersaglio sia dell amplicone contaminante. I laboratori in cui si esegue la PCR sono tenuti a conoscere l esistenza di queste fonti di contaminazione e a mettere in atto delle procedure per ridurre in modo significativo il rischio di contaminazione. I metodi per controllare la contaminazione sono ben documentati (10) e includono l architettura dei laboratori, il flusso di lavoro, le procedure di manipolazione dei campioni e gli approcci chimici ed enzimatici. Procedure di laboratorio efficaci e ben definite sono fondamentali per controllare la contaminazione nella PCR e devono essere implementate prima di analizzare i campioni clinici. Procedura di amplificazione Nota Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione, i passaggi 3-5 devono essere eseguiti in un area priva di prodotti della PCR, preferibilmente in una cabina a flusso laminare. 1. Programmare il termociclatore per un singolo passaggio per attivare la (polimerasi) HotStart Taq a 94 C per 20 minuti collegata ad un programma ciclico di amplificazione di 1 minuto a 94 C (denaturazione), 2 minuti a 58 C (annealing) e 1 minuto a 72 C (estensione) per 30 cicli. Questo procedimento deve essere collegato ad un file di ritardo di 20 minuti a 72 C (estensione) sul ciclo finale. 2. Ciascun ciclo di PCR deve includere un controllo negativo. 3. Scongelare le miscele di primer e la miscela master per PCR e centrifugare brevemente le fiale per raccoglierne il contenuto sul fondo. Miscelare leggermente con vortex e centrifugare di nuovo brevemente le fiale. Preparare una miscela di reazione sufficiente per il numero di campioni e controlli da analizzare (Tabella 1). Nota La miscela master per PCR è viscosa e occorre prestare attenzione per far sì che vengano manipolati i volumi corretti. Si consiglia di aggiungere la miscela master per PCR alle miscele di primer precedentemente dispensate per far sì che tutto il liquido passi dalla pipetta alla miscela di primer. Nota Non usare miscele diverse o componenti appartenenti a lotti diversi del kit CF-EU2v1. Attivazione enzimatica Programma ciclico Estensione finale 94 C 94 C 20 min. 1 min. 72 C 72 C 58 C 1 min. 20 min. Temperatura ambiente 2 min. 30 cicli CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 10 di 23

11 Tabella 1 Formulazione delle miscele di reazione Numero dei campioni da analizzare Miscela di primer (μl) 4, ,5 225 Miscela master per PCR (μl) 7, ,5 375 Totale (μl) Pipettare 10 μl di ciascuna miscela di reazione sul fondo delle fiale per PCR da 0,2 ml, a cui è stata applicata un apposita etichetta. 5. Usare puntali per pipette separati per aggiungere 2,5 μl di campione di DNA per il test a ciascuna fiala e chiuderla con il tappo. Non aggiungere DNA nella fiala per il controllo negativo; sostituire con 2,5 μl di acqua sterile deionizzata. 6. Centrifugare brevemente le fiale per PCR per raccoglierne il contenuto sul fondo. 7. Posizionare le fiale nel blocco del termociclatore in modo che siano stabili. Avviare il ciclo a passaggio singolo d 94 C seguito dal programma ciclico di amplificazione. 8. Al termine del programma ciclico di amplificazione, i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente per tutta la notte oppure a una temperatura compresa tra 2 C e 8 C per un massimo di 7 giorni al buio prima dell analisi con elettroforesi capillare. Elettroforesi capillare Si raccomanda a ciascun operatore di assicurarsi che l apparecchiatura per elettroforesi capillare selezionata venga usata secondo le istruzioni del produttore e che sia compatibile con questo test. In questo contesto, i parametri chiave sono il polimero e l array di capillari. È possibile ottenere risultati ottimali utilizzando le seguenti condizioni di elettroforesi capillare. 1. Combinare 6,8 μl di GS600v2 LIZ size standard con 250 μl di formamide Hi-Di e miscelare accuratamente (miscela sufficiente per 16 pozzetti). Dispensare 15 μl di miscela in ciascun pozzetto di una piastra per PCR a 96 pozzetti. 2. Aggiungere 3 µl di prodotto di PCR da ciascuna delle miscele A e B amplificate in pozzetti separati contenenti la miscela di size standard/formammide (ottenuta con il passaggio 1) già dispensata nella piastra. 3. Denaturare il prodotto di PCR dispensato nella piastra per PCR su un termociclatore utilizzando i seguenti parametri: 94 C per 3 minuti seguiti da 4 C per 30 secondi. 4. Centrifugare brevemente la piastra per raccogliere il contenuto sul fondo delle fiale e per eliminare eventuali bolle presenti nei pozzetti, e caricare immediatamente sull analizzatore genetico. Nota È possibile modificare le impostazioni di iniezione dei campioni in funzione della quantità di ampliconi prodotti durante la PCR, che può variare a seconda della quantità di DNA di input genomico aggiunto. Riducendo il tempo o la tensione di iniezione è possibile applicare una minore quantità di ampliconi alla colonna di analisi. Aumentando invece il tempo o la tensione di iniezione è possibile applicare una maggiore quantità di ampliconi alla colonna di analisi. I campioni precedentemente amplificati possono essere reiniettati più volte per ripetere le analisi (per maggiori informazioni, consultare la Guida alla risoluzione dei problemi Elucigene CF-EU2v1). Strumenti ABI 3130 È necessario creare un modulo di analisi CF-EU2 che può successivamente essere usato per ciascuna analisi CF-EU2. Creare il modulo di analisi CF-EU2 nell Module Manager (editor dei moduli) del software di acquisizione dati Assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci. Type (Tipo): Regolare CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 11 di 23

12 Template (Modello): FragmentAnalysis36_POP7 Immettere le impostazioni illustrate in dettaglio nella tabella seguente. Modulo per capillare da 36 cm # Nome del parametro Valore Intervallo 1 Oven Temperature (Temperatura forno) 60 int C 2 Poly_Fill_Vol. (Volume riempimento poly) passaggi 3 Current Stability (Stabilità corrente) 5,0 int uamp 4 PreRun_Voltage (Tensione pre-analisi) 15, kvolt 5 Pre_Run_Time (Tempo pre-analisi) s 6 Injection_Voltage (Tensione iniezione) 3, kvolt 7 Injection_Time (Durata iniezione) 12,0** s 8 Voltage_Number_Of_Steps nk (Tensione numero di passaggi) 9 Voltage_Step_Interval s (Intervallo passaggio tensione) 10 Data_Delay_Time (Tempo di ritardo dati) s 11 Run_Voltage (Tensione analisi) 15, kvolt 12 Run_Time (Tempo di analisi) s ** Portare il tempo di iniezione a 36 secondi per l analisi del DNA estratto da gocce di sangue essiccate su carta da filtro. Nota Il tempo di analisi necessario varia a seconda della temperatura ambiente del luogo in cui è stato installato l analizzatore genetico. Per maggiori informazioni sulla creazione di moduli di analisi, consultare il Manuale dell operatore dell analizzatore genetico Applied Biosystems Creare il protocollo CF-EU2 nell Protocol Manager (editor dei protocolli) e assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci: Type (Tipo): Regolare Run Module (Modulo di analisi): CF-EU2 (vedere modulo di analisi sopra) Dye Set (Set colori): G5 Per analizzare i campioni, creare una scheda campioni utilizzando il Plate Manager (editor della piastra); assicurarsi che sia stato selezionato il protocollo per CF-EU2v1 adatto al protocollo dello strumento (vedere sopra). Nota Per maggiori informazioni sulla configurazione, sul funzionamento e sulla risoluzione dei problemi dello strumento, consultare il Manuale dell operatore dell analizzatore genetico Applied Biosystems Strumenti ABI 3500 È necessario creare un Instument Protocol (protocollo dello strumento) per CF-EU2 che possa essere usato successivamente per ogni sessione analitica CF-EU2v1. Creare il Instument Protocol (protocollo dello strumento) per CF-EU2 attraverso la libreria dei protocolli dello strumento Assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci. Run Module (Modulo di analisi): FragmentAnalysis50_POP7. Immettere le impostazioni illustrate in dettaglio nella figura seguente. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 12 di 23

13 ** ** Portare il tempo di iniezione a 36 secondi per l analisi del DNA estratto da gocce di sangue essiccate su carta da filtro. Per analizzare i campioni, creare una piastra campione facendo clic su Create Plate from Template (crea piastra da modello) nel Dashboard ; assicurarsi che sia stato assegnato il protocollo dello strumento corretto per CF-EU2v1 (vedere sopra). Scheda campione impostata per GeneMarker Il software GeneMarker consente il confronto diretto tra i dati A e B dello stesso individuo. Per facilitare questo confronto è importante che la denominazione del file di output dei dati non elaborati (FSA) sia coerente per tutti i campioni e le miscele. La scheda campione deve contenere il nome del campione univoco per ogni campioni analizzato seguito dal suffisso _A o _B a seconda delle miscela che sarà analizzata. Se nel nome FSA si deve includere l ID piastra occorre usare ogni volta un formato fisso, ad esempio CFEU2 GGMMAAAA. Sullo strumento 3130, occorre configurare i parametri per Results Destination (destinazione risultati) in modo che il nome del file FSA includa il nome del campione, ad esempio CFEU2 GGMMAAAA_1234,5_A_A01. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 13 di 23

14 Sullo strumento 3500, occorre impostare la convenzione del nome file in modo che il nome del file FSA comprenda il nome del campione, ad esempio CFEU2 GGMMAAAA_1234,5_A_A01. Interpretazione dei risultati Durante l acquisizione dei dati, sull elettroferogramma dei dati non elaborati si osservano frammenti di PCR sotto forma di picchi di colore blu (mutante) o verde (wild-type). Un individuo possiede due copie del gene CFTR. Qualora queste copie presentino la stessa sequenza per un dato sito, un individuo viene descritto come omozigote per questo sito. Qualora le copie presentino una sequenza diversa per un dato sito, un individuo viene descritto come eterozigote per questo sito. Al termine dell acquisizione dei dati, i frammenti di PCR per CF-EU2v1 devono essere classificati in ordine di grandezza a fronte del size standard GS600v2 LIZ utilizzando il software di analisi dei frammenti. La Guida al software di analisi Elucigene CF-EU2v1 contiene ulteriori linee guida dettagliate per le impostazioni del software, l analisi e l interpretazione. Le procedure della guida al software di analisi sono disponibili per GeneMapper e GeneMarker sul sito web di Elucigene Diagnostics: Dai risultati della miscela A (mutante) è possibile stabilire se un individuo presenta una mutazione, evidenziata dalla presenza di un picco blu. La miscela mutante contiene anche i primer per l allele F508 normale, quindi tramite questa miscela è possibile stabilire se un individuo risulta normale per F508 (solo picco verde), omozigote per F508del (solo picco blu) o eterozigote per F508del (picco blu e verde). Se si osserva qualunque altra mutazione, è possibile analizzare i risultati della miscela B (wild-type) per stabilire lo stato omozigote o eterozigote. La presenza di un picco verde per il particolare allele nella miscela wild-type indica che l individuo è eterozigote e l assenza del picco verde indica che l individuo è omozigote per la particolare mutazione. In entrambe le miscele sono inclusi marker STR ipervariabili (rossi). Questo consente il confronto tra il campione amplificato con la miscela mutante e il campione amplificato con la miscela wild-type per ridurre il rischio di mescolamento dei campioni; un profilo STR diverso in ciascuna delle due miscele indica un mescolamento dei campioni. L assenza di questi marker STR indica un campione non riuscito. La presenza dei marker STR a livelli RFU molto bassi indica un campione debole che deve essere analizzato con cautela. Nota: Per maggiori informazioni, consultare la Guida alla risoluzione dei problemi. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 14 di 23

15 Marker rilevati La tabella in basso riepiloga i marker rilevati con la miscela CF-EU2v1. I marker sono elencati in base all intervallo dell entità di prodotto di PCR osservato. Marker (N. picco) Marker Marker rilevati Intervallo di dimensioni del prodotto in bp (dati 3130/POP7) 01 R347H R347P G>A G>A G>T R334W I507del F508del KbC>T delTA delT V520F L206W W1282X R560T delG Q890X R553X G551D S549R(T>G)* S549N M1101K G542X insT Y1092X(C>A) S1251N delA kbA>G G>A R117H R117C N1303K Y122X delTT G85E R1066C G>A W846X delA D1152H CFTRdel2, P67L delT E60X delC A>G G>T CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 15 di 23

16 N. marker Marker Intervallo di dimensioni del prodotto in bp (dati 3130/POP7) 48 A455E R1162X R1158X T** IVS8-5T T IVS8-7T T IVS8-9T *S549R(T>G) Il picco 20 è presente solo nella miscela A. ** Dimensioni alleli 5T Intervallo di Marker dimensioni del prodotto in bp (dati 3130/POP7) 5T (9) T (10) T (11) T (12) T (13) NOTA Le entità dei marker possono variare in base allo strumento e al polimero utilizzati. Esempi di interpretazione I507del Data la posizione della delezione I507del nel gene CFTR è possibile rilevare la presenza di questo marker tramite una variazione di 3 bp nella dimensione del picco F508del e del picco specifico mutante I507del. Laddove sia presente un singolo allelo mutante, si osserverà il picco mutante I507del come picco celeste a circa 159 bp. Si osserverà la presenza di un picco wild-type per F508, ma a un altezza di picco pari all incirca la metà di quella normalmente associata a un genotipo wild-type omozigote; questo viene osservato come un picco verde a circa 167 bp. Si osserverà anche un altro picco verde a circa 164 bp. Campione eterozigote I507del Un campione I507del/F508del produrrà un picco WT F508del verde spostato all incirca a 164 bp (3 bp in meno rispetto alla norma), un picco M F508del celeste a 166 bp e un picco M I507del celeste all incirca a 159 bp. Un campione I507del/I507del produrrà un picco blu all incirca a 159 bp e un singolo picco verde all incirca a 164 bp (3 bp in meno rispetto al picco F508del normale osservato quando non è presente I507del). CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 16 di 23

17 F508del La presenza di una mutazione F508del impedisce l azione del primer I507del WT. Quindi un individuo omozigote per F508del non presenterà un piccolo I507del WP nella miscela WT (vedere in basso). Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per F508del un picco I507del WT di altezza ridotta e 2 picchi distanti 3 bp l uno dall altro nelle posizioni 10 e 12 nella miscela WT (vedere sotto). Inserimenti e delezioni Per come è stato concepito il kit CF-EU2v1, la presenza di inserzioni o delezioni tra due primer opposti darà luogo a cambiamenti nelle dimensioni in tutti gli ampliconi prodotti tra questi due primer. Pertanto, oltre alle 50 mutazioni rilevate dal kit CF-EU2v1, ogni inserzione e delezione nell ambito delle sequenze bersaglio può essere rilevata dal cambiamento nelle dimensioni attese degli ampliconi nella miscela di wild-type (B). Questi sono stati classificati e sono disponibili in un documento separato sul sito web di Elucigene Diagnostics: Di seguito sono riportati esempi di inserzioni e delezioni rilevate dal kit e il loro impatto sul profilo della miscela B: F508del/1677delTA Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per le mutazioni F508del/1677delTA due picchi distanti 1 bp l uno dall altro nella posizione 12 (V520F WT). V520F Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote sarà osservato un picco wild-type di altezza ridotta nella posizione 10 (1677delTA WT) per la mutazione V520F poiché questa impedisce l azione del primer 1677delTA WT. I picchi 10 e 12 non saranno presenti nei risultati di un individuo omozigote per la mutazione V520F. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 17 di 23

18 394delTT Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per la mutazione 394delTT due picchi distanti 2 bp l uno dall altro nelle posizioni 35 (G85E WT), 42 (P67L WT) e 44 (E60X WT). Nei risultati di un individuo omozigote per la mutazione 394delTT il picco 34 non sarà presente e i picchi 35, 42 e 44 presenteranno l altezza prevista ma spostati di 2 bp e di dimensioni inferiori a quelle previste. F508del/CFTRdele2,3 Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per la mutazione CFTRdele2,3 picchi di altezza ridotta nelle posizioni 34 (394delTT), 35 (G85E WT), 41 (CFTRdele2,3 WT), 42 (P67L WT) e 44 (E60X WT). I picchi 34, 35, 41, 42 e 44 non saranno presenti nei risultati di un individuo omozigote per la mutazione CFTRdele2,3. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 18 di 23

19 444delA Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per la mutazione 444delA due picchi distanti 1 bp l uno dall altro nelle posizioni 30 (R117H WT), 31 (R117C WT), 33 (Y122X WT) e 47 (621+1 WT). Nei risultati di un individuo omozigote per la mutazione 444delA il picco 27 non sarà presente e i picchi 30, 31, 33 e 47 presenteranno l altezza prevista ma spostati di 1 bp e di dimensioni inferiori a quelle previste. 2347delG Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per la mutazione 2347delG due picchi distanti 1 bp l uno dall altro nelle posizioni 39 (2184delA WT) e 43 (2143delT WT). Nei risultati di un individuo omozigote per la mutazione 2347delG il picco 16 non sarà presente e i picchi 39 e 43 presenteranno l altezza prevista ma spostati di 1 bp e di dimensioni inferiori a quelle previste. 3905insT Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote saranno osservati per la mutazione 3905insT due picchi distanti 1 bp l uno dall altro nella posizione 26 (S1251N WT). Nei risultati di un individuo omozigote per la mutazione 3905insT il picco 24 non sarà presente e il picco 26 presenterà l altezza prevista ma spostato di 1 bp e di dimensioni superiori a quelle previste. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 19 di 23

20 R1158X Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote sarà osservata per la mutazione R1158X un altezza di picco ridotta nella posizione 49 (R1162X WT). Il picco 49 non sarà presente nei risultati di un individuo omozigote per la mutazione R1158X. Polimorfismo rs (delat) nell introne 22 Nei risultati della miscela B di un individuo eterozigote per il polimorfismo rs (delezione di AT) nell introne 22 saranno osservati due picchi distanti 2 bp l uno dall altro nelle posizioni 45 (3659delC WT), 49 (R1162X WT) e 50 (R1158X WT). Nei risultati di un individuo omozigote per il polimorfismo rs i picchi 45, 49 e 50 presenteranno l altezza prevista ma spostati di 2 bp e di dimensioni inferiori a quelle previste. Altre osservazioni V520F Polimorfismo 1584G>A nell esone G>A è stato identificato come un polimorfismo che interferisce con l amplificazione del mutante V520F e della sequenza wild-type. In un individuo eterozigote per il polimorfismo 1584G>A, si osserverà un altezza ridotta del picco in posizione 12 (V520F). In un individuo omozigote per il polimorfismo 1584G>A, il picco 12 cadrà al di fuori della miscela B. Un individuo eterozigote per la mutazione F508del ed eterozigote per la mutazione 1584G>A mostrerà un solo picco 12 nella miscela B anziché i due picchi attesi in posizione 12 che si vedono normalmente in un eterozigote F508del (vedere esempio sotto). In un individuo eterozigote per la mutazione V520F e per il polimorfismo 1584G>A sullo stesso allele, il picco 12 cadrà al di fuori della miscela A; tale risultato non è ancora stato osservato e si tratta probabilmente di una combinazione rara. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 20 di 23

21 Reattività crociata Durante lo sviluppo del test, è stato fatto tutto il possibile per evitare che la presenza di altri polimorfismi e mutazioni segnalati nel gene CFTR interferisse con il funzionamento del test. La mutazione rara R1283M è stata analizzata per reattività crociata e non è stata rilevata dal kit Elucigene CF-EU2v1. Inoltre, sono stati rilevati dal test i seguenti polimorfismi: 1655T/G (F508C), 1651A/G. L analisi di mutazioni e polimorfismi noti nel gene CFTR ha evidenziato i seguenti effetti sui risultati del kit Elucigene CF-EU2v1: 1. Il primer mutante G551D nella miscela A rileverà anche la mutazione S549RT>G. Questa verrà marcata dal software di analisi come picco 20. La miscela B non presenterà un corrispondente picco wild-type. 2. Il primer mutante 2184delA nella miscela A produrrà reattività crociata con la sequenza di DNA mutante 2183AA>G generando un picco mutante nella posizione 2184delA. 3. Il primer mutante 1078delT nella miscela A produrrà reattività crociata con la sequenza di DNA mutante F316L generando un picco mutante nella posizione 1078delT. 4. Il primer mutante R347P nella miscela A produrrà reattività crociata con la sequenza di DNA mutante R347H generando un picco mutante nella posizione R347P di altezza ridotta rispetto al vero picco R347P. 5. La presenza del polimorfismo F508C (1655T>G) causerà la riduzione dell altezza del picco I507del nella miscela B di CF-EU2v1. 6. La presenza di R117H causerà la riduzione dell altezza del picco R117C nella miscela B di CF-EU2v1. In un campione omozigote per R117H il picco R117C sarà assente. 7. La presenza di G85E causerà la riduzione dell altezza del picco 394delTT nella miscela B di CF- EU2v1. In un campione omozigote per G85E il picco 394delTT sarà assente. 8. Talvolta si può osservare un piccolissimo picco artefatto nella posizione I507del dei risultati di un F508del eterozigote e in particolare in un campione omozigote F508del. 9. Le seguenti mutazioni, per le quali non è stata verificata la reattività crociata per mancata disponibilità di campioni pertinenti, possono interferire con il funzionamento del test: R117P, R117L, A>G, 621+2T>C, 621+2T>G, R553G, R553Q, R347L, I506T, I506S, I506V e la rara combinazione di I507del con il polimorfismo 1651A/G. Caratteristiche dell esecuzione del test Centodieci campioni di DNA estratto da sangue intero liquido (trattato con EDTA) sono stati analizzati in cieco utilizzando Elucigene CF-EU2v1. Cinque campioni non hanno prodotto risultati dopo la PCR a causa della bassa concentrazione di DNA (inferiore a 1,5 ng/μl). Di quelli che hanno prodotto risultati interpretabili 96 erano normali, 5 erano eterozigoti per F508del, 1 era eterozigote per G>A, 1 era eterozigote per G551D, 1 era eterozigote per 621+1G>T, 1 era eterozigote per G542X e 1 era eterozigote composto per G542X/F508del. Novantuno campioni di DNA estratto da gocce di sangue essiccate su carta da filtro sono stati analizzati in cieco utilizzando Elucigene CF-EU2v1. Per cinque campioni l amplificazione non è riuscita. Dei campioni amplificati, 20 non hanno soddisfatto i criteri di analisi per l interpretazione dopo essere stati iniettati per 12 secondi in un analizzatore genetico 3500; tutti i campioni che non hanno prodotto risultati erano correlati a una bassa concentrazione di DNA (inferiore a 1,5 ng/μl). I 20 campioni che non hanno prodotto risultati sono stati nuovamente iniettati nell analizzatore genetico 3500 per 36 secondi e analizzati; 7 campioni non hanno soddisfatto i criteri di analisi per l interpretazione. Dei 79 campioni che hanno fornito risultati interpretabili, 38 erano normali, 5 erano eterozigoti per F508del, 3 erano eterozigoti per G551D, 3 erano eterozigoti per W1282X, 2 erano eterozigoti per D1152H e 2 erano eterozigoti per G542X. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 21 di 23

22 Sono stati individuati anche quattro eterozigoti composti: G>A/F508del, R117H/F508del, R1162X/F508del e R553X/F508del. Inoltre, i seguenti campioni eterozigoti sono stati osservati una sola volta: E60X, G85E, 394delTT, Y122X, 621+1G>T, 1078delT, R334W, R347P, A455E, I507del, G>A, R553X, kbA>G, G>A, 2184delA, W846X, A>G, Y1092X, 3659delC, kbC>T, S1251N e N1303K. Quarantasei campioni di DNA, rappresentativi di tutte le 50 mutazioni, rilevati dal kit CF-EU2v1 sono stati amplificati in cinque momenti diversi. Tutti i campioni hanno prodotto i risultati attesi senza falsi negativi o falsi positivi, dimostrando una specificità e una sensibilità dal punto di vista clinico del 100%. Risoluzione dei problemi Queste istruzioni per l uso vengono fornite per garantire un rendimento ottimale del test. Gli operatori devono attenersi alle procedure fornite. Ogni deviazione dalle procedure può dar luogo a un rendimento non ottimale e a dati di scarsa qualità. Una Guida alla risoluzione dei problemi viene fornita su richiesta da Elucigene Diagnostics e contiene esempi e soluzioni per alcune delle più frequenti osservazioni relative a Elucigene CF-EU2v1, tra cui: Nessun picco diagnostico o STR Picchi diagnostici o STR deboli Picchi di fondo/di breakthrough in eccesso Picchi non marcati Picchi deboli FAM (mutanti) Profilo della miscela A non bilanciato Profilo della miscela B non bilanciato Picchi sdoppiati (split peaks) nel profilo della miscela B Per ottenere una copia della Guida alla risoluzione dei problemi Elucigene CF-EU2v1, rivolgersi al gruppo dell assistenza tecnica: T: +44 (0) F: +44 (0) E: enquiries@elucigene.com E: techsupport@elucigene.com Limiti della procedura 1. I risultati ottenuti da questo o qualsiasi altro test diagnostico devono essere usati e interpretati solo nel contesto del quadro clinico generale Elucigene Diagnostics non è responsabile delle eventuali decisioni cliniche adottate. 2. Il mancato rilevamento delle mutazioni da parte di questo kit non esclude la presenza di altre mutazioni nel gene CFTR. È possibile che siano presenti altre mutazioni non rilevate da questo kit. 3. La frequenza delle mutazioni varia tra popolazioni differenti. I dati sulla frequenza delle mutazioni nelle popolazioni sono disponibili presso il Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium (6). L operatore che ha utilizzato questo kit è tenuto a sottolineare l importanza di queste considerazioni nel riportare i risultati al medico o al consulente genetico che esegue la diagnosi. Dichiarazione di non responsabilità I risultati di questo e degli altri test diagnostici devono essere interpretati congiuntamente agli altri dati clinici e di laboratorio a disposizione del medico. Questi reagenti Elucigene vengono forniti per l esecuzione di test diagnostici in vitro. Ulteriori dettagli per l interpretazione dei dati sono disponibili nelle procedure descritte nella Guida al software di analisi Elucigene CF-EU2v1: CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 22 di 23

23 Bibliografia 1. Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement. Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr. 1998;132: De Braekeleer M, Allard C, Leblanc JP, Simard F, Aubin G. Genotype-phenotype correlation in cystic fibrosis patients compound heterozygous for the A455E mutation. Hum Genet. 1997;101: Drumm ML, Konstan MW, Schluchter MD, Handler A, Pace R, Zou F, Zariwala M, Fargo D, Xu A, Dunn JM, Darrah RJ, Dorfman R, Sandford AJ, Corey M, Zielenski J, Durie P, Goddard K, Yankaskas JR, Wright FA, Knowles MR. Genetic modifiers of lung disease in cystic fibrosis. N Engl J Med. 2005;353: Goss CH, Newsom SA, Schildcrout JS, Sheppard L, Kaufman JD. Effect of ambient air pollution on pulmonary exacerbations and lung function in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 2004;169: Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A, Buchwald M, and Tsui LC. Identification of the Cystic Fibrosis Gene: Genetic Analysis. Science 1989; 245 (4922): Cystic Fibrosis Mutation Database, 7. Joshua D. Groman et al. Variation in a Repeat Sequence Determines Whether a Common Variant of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene Is Pathogenic or Benign. Am J Hum Genet. 2004; 74(1): Newton CR et al. Analysis of any point mutation in DNA. The Amplification Refractory Mutation System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: (1989). 9. Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343: (1994). 10. PCR Primer: A Laboratory Manual, 2 nd edition. ColdSpring Harbour Laboratory Press: Section 1 ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics (UK) Ltd. ARMS è un marchio di AstraZeneca UK Ltd. QIAAMP è un marchio di Qiagen GmbH. PICOGREEN è un marchio di Molecular Probes Inc. GENEMAKER è un marchio di SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, NED, VIC, PET, POP-7, LIZ e HI-DI sono marchi di Life Technologies Corporation. AVVISO PER L ACQUIRENTE: LICENZA LIMITATA I polinucleotidi marcati con coloranti VIC, NED e PET e/o il rispettivo impiego possono essere coperti da uno o più brevetti di proprietà di Life Technologies Corp. Il prezzo di acquisto di questo prodotto include diritti limitati non trasferibili secondo specifiche rivendicazioni di alcuni brevetti appartenenti ad Life Technologies Corp, che prevedono l uso della sola quantità stabilita di prodotto esclusivamente per procedure condotte dall acquirente a scopo di rilevamento del/dei target nel settore della diagnostica umana. Non sono concessi altri diritti. Per altre informazioni sull acquisto di licenze relative ai coloranti sopra indicati, rivolgersi al Director of Licensing, outlicensing@lifetech.com. Copyright 2014 Delta Diagnostics (UK) Ltd. CF2EUBYIT 002 Sep-2014 Pagina 23 di 23