Scheda tecnica TRI118

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1 TRI REAGENT - RNA / DNA / PROTEIN ISOLATION REAGENT Cat. No. TR 118/50 Cat. No. TR 118/100 Cat. No. TR 118/200 Produttore: Molecular Research Center Distributore: Bio-Optica Conservare a 4-25 C DESCRIZIONE DEL PRODOTTO TRI Reagent è un sistema completo e pronto all uso per l isolamento di RNA totale o la simultanea estrazione di RNA, DNA e proteine da campioni umani, animali, piante, funghi, batteri e virus. TRI Reagent è la versione migliorata del popolare metodo a single-step per l isolamento dell RNA totale (1,2). La migliore tecnica di realizzazione con piccole e grandi quantità di tessuti o culture cellulari per eseguire simultanee processazioni di un gran numero di campioni. TRI Reagent e il metodo a single-step sono soggetti al Patents US 4,843,155 e 5,346,994, ed i Patent internazionali. TRI Reagent combina il fenolo con l isotiocianato di guanidio in una soluzione mono-fase per facilitare l immediata ed la migliore inibizione dell attività RNAsi. Un campione biologico è omogenato o lisato in TRI Reagent e successivamente viene separato in fase acquosa, interfase e fase organica mediante l aggiunta di Bromocloropropano (BP 151)o cloroformio e successiva centrifugazione. RNA rimane esclusivamente nella fase acquosa, DNA nell interfase e le proteine nella fase organica. RNA viene fatto precipitare nella fase acquosa con isopropanolo, lavato con etanolo e solubilizzato. DNA e le proteine sono successivamente precipitate nell interfase e nella fase organica rispettivamente con etanolo e isopropanolo, lavati con etanolo e solubilizzati. STABILITÀ : TRI Reagent è stabile a 25 C per almeno due anni dalla data di acquisto (3). PRECAUZIONI SPECIALI: TRI Reagent contiene un veleno (fenolo) ed un irritante (Isotiocianato di guanidio). Causa ustioni. POTREBBE ESSERE LETALE. Quando manipolate TRI Reagent usate guanti e protezioni per gli occhi. Non versare sulla pelle o sui vestiti. Evitare di inalare i vapori. Leggere la scheda di sicurezza. In caso di contatto: Lavare immediatamente gli occhi o la pelle con abbondante acqua per almeno 15 minuti e contattate immediatamente un medico. I. ISOLAMENTO DELL RNA TRI Reagent è il più efficace metodo di estrazione dell RNA. Si isola uno spettro di molecole di RNA raramente osservate nelle estrazioni di RNA con altri metodi. Tipicamente, il sistema Column-Based può artificialmente cambiare la composizione dell mrna. L intera procedura può essere completata in 1 h ed il recupero di mrna non degradato è il % di più rispetto agli altri metodi. TRI Reagent isola un RNA di alta qualità da diversi materiali biologici, inclusi animali e piante ricchi di polisaccaridi e di proteoglicani. L RNA isolato può essere usato per analisi di Northern Blot, Dot Blot, Poly A +, clonaggi molecolari ed RT-PCR. La simultanea estrazione del DNA genomico può essere utile per gli studi di espressione genica. PROTOCOL Reagenti richiesti ma non forniti: Cloroformio o Bromocloropropano, isopropanolo ed etanolo. Raccomandiamo di usare provette di reazione monouso (PP ) prodotte da Molecular Research Center, Inc. Le provette fornite da altri potrebbero non essere testate a centrifugazioni di 12,000 g con TRI Reagent. Il protocollo include i seguenti passaggi: 1. OMOGENAZIONE: 1 ml TRI REAGENT mg di tessuto, 5-10 x 10 6 cellule o 10 cm 2 di cellule in coltura. 2. FASE DI SEPARAZIONE: Omogenato ml BCP o 0.2 ml di cloroformio. Pagina 1 di 5

2 3. RNA PRECIPITAZIONE: Fase acquosa ml isopropanolo. 4. RNA LAVAGGIO: 1 ml 75% etanolo. 5. RNA SOLUBILIZZAZIONE: Formazol, 0.5% SDS, o acqua. La procedura è studiata a temperatura ambiente. 1. OMOGENAZIONE A. TESSUTI. Omogenare i campioni di tessuto in TRI Reagent (1 ml/ mg di tessuto) usando un omogenizzatore o una piastra di vetro-teflon. Il volume del campione non deve eccedere il 10% del volume del TRI Reagent usato per omogenare. B. CELLULE. Cellule cresciute in monostrato devono essere lisate direttamente nel piatto di cultura. Eliminare il media, aggiungere il TRI Reagent e passare il lisato in una pipetta. Usare 1 ml di TRI Reagent per 10 cm 2 di coltura cellulare. Cellule cresciute in sospensione devono essere prima sedimentate, e poi lisate in TRI Reagent con pipettate ripetute. Usare 1.0 ml di TRI Reagent per 5 10 X 10 6 cellule animali, piante o lieviti oppure 10 7 batteri. Evitare di lavare le cellule prima di aggiungere il TRI Reagent; questo potrebbe contribuire alla degradazione dell mrna. 2. FASE DI SEPARAZIONE Tenere l omogenato per 5 minuti a temperatura ambiente per permettere la completa dissociazione di nuleoproteine complesse. Poi, aggiungere all omogenato 0.1 ml di BCP o 0.2 ml di cloroformio per ogni ml di TRI Reagent, coprire i campioni e agitare vigorosamente per 15 secondi. Tenete la mix a temperatura ambiente per 2-15 minuti e centrifugare a 12,000 g per 15 minuti a 4 C. Dopo la centrifugazione, la mix si separa in una fase rosa con fenolo-cloroformio, una interfase ed una fase incolore (fase acquosa). RNA rimane esclusivamente nella fase acquosa mentre il DNA e le proteine sono nell interfase e nella fase organica. Il volume della fase acquosa è circa il 60% del volume del TRI Reagent usato per l omogenazione. BCP è meno tossico del cloroformio ed il suo impiego riduce la possibilità di contaminazione tra RNA e DNA(4). Cloroformio usato nella fase di separazione non deve contenere alcool isoamilico o qualsiasi altro additivo. Questo è importante per migliorare la separazione durante la centrifugazione al freddo (4 10 C). A temperature maggiori un residuo di DNA potrebbe essere sequestrato nella fase acquosa. 3. PRECIPITAZIONE DELL RNA Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta di reazione e conservare l interfase e la fase organica a 4 c per seguenti isolamenti di DNA e Proteine. Precitare RNA dalla fase acquosa miscelandolo con isopropanolo. Usare 0.5 ml di isopropanolo per 1 ml di TRI Reagent usato nella fase iniziale di omogenazione. Conservare i campioni a temperatura ambiente per 5 10 minuti e centrifugare a 12,000 g per 8 minuti a 4 25 C. L RNA precipitato (spesso invisibile prima della centrifugazione) forma un filo di gel o un pellet bianco nel fondo del tubo. Quando si isola RNA da fonti ricche in polisaccaridi e proteoglicani, occorre modificare la precipitazione. 4. LAVAGGIO DELL RNA Rimuovere il supernatante e lavare il pellet di RNA con etanolo 75% e seguente centrifugazione a 7,500 g per 5 minuti a 4 25 C. Aggiungere almeno 1 ml di etanolo per ciascun ml di TRI Reagent usato nella fase iniziale di omogenazione. Se il pellet di RNA non si deposita sul fondo della provetta, sedimentare con una centrifugata a 12,000 g. 5. SOLUBILIZZAZIONE DELL RNA Rimuovere l etanolo di lavaggio e far asciugare all aria brevemente il pellet di RNA per 3 5 minuti. Non asciugare l RNA con centrifugazione sotto vuoto. Disciogliere l RNA in FORMAzol, acqua o 0.5% SDS ed incubare per minuti a C. L acqua o SDS usato per la solubilizzazione deve essere RNAsi free mediante trattamento DEPC. RNA deve essere precipitato con etanolo dal FORMAzol prima di essere usato per RT-PCR. 6. RISULTATI TRI Reagent isola un ampio spettro di molecole di RNA raramente osservate nell isolamento con altri metodi. L etidio bromuro colora l RNA separato su gel di agarosio o il metilene blu colora su membrana di ibridazione dopo Pagina 2 di 5

3 trasferimento dell RNA visualizzando 2 bande predominanti una piccola (2 kb) ed una grande (5 kb) costituite da RNA ribosomiale. La preparazione finale di RNA totale è essenzialmente libera da DNA e proteine ed ha una Ratio per analisi di RT-PCR, DNAsi trattamento può essere necessario per risultati ottimali. II. ISOLAMENTO DEL DNA Il DNA è isolato dall interfase e dalla fase contenente fenolo separata dall omogenato iniziale come descritto nell isolamento dell RNA. Seguendo una precipitazione ed una serie di lavaggi, il DNA è solubilizzato in 8 mm di NaOH ed usato per l analisi. Il DNA isolato può essere usato per PCR, restrizioni, digestioni, Southern blotting. In più il pieno recupero di DNA dai tessuti e dalle colture cellulari permette l uso del TRI Reagent per la determinazione di DNA nei campioni trattati. PROTOCOLLO Reagenti richiesti ma non forniti : etanolo, sodio citrato e idrossido di sodio. Il protocollo include i seguenti passaggi: 1. PRECIPITAZIONE DEL DNA: Fase con fenolo ed interfase ml etanolo (1 ml TRI Reagent). 2. LAVAGGIO DEL DNA: 1 ml 0.1 M citrato di sodio in 10% etanolo x 2; 2 ml 75% etanolo. 3. SOLUBILIZZAZIONE DEL DNA: 8 mm NaOH. La procedura è effettuata all aperto a temperatura ambiente. 1. PRECIPITAZIONE DEL DNA Rimuovere la rimanente fase acquosa presente sopra l interfase. Precipitare il DNA dall interfase e dalla fase organica con etanolo. Aggiungere 0.3 ml di etanolo 100% per ciascun ml di TRI Reagent usato nella fase di omogenazione, miscelare. Poi conservare a temperatura ambiente per 2 3 minuti e sedimentare il DNA con centrifugazione a 2,000 g per 5 minuti a 4 C. Prestare attenzione a rimuovere ogni residuo della fase acquosa. 2. LAVAGGIO DEL DNA Rimuovere il supernatante contenente fenolo-etanolo e conservare a 4 C per il seguente isolamento delle proteine. Lavare il pellet di DNA due volte in una soluzione contenente 0.1 M di sodio citrato in 10% di etanolo. Usare 1 ml di soluzione per ogni ml di TRI Reagent usato nella fase iniziale di omogenazione. Ad ogni lavaggio, conservare il pellet di DNA nella soluzione di lavaggio per 30 minuti a temperatura ambiente con periodiche miscelazioni e centrifugare a 2,000 g per 5 minuti a 4 25 C. Poi sospendere il pellet di DNA in etanolo 75% (1,5 2 ml di 75% etanolo per ciascun 1 ml di TRI Reagent), conservare per minuti a temperatura ambiente con periodiche miscelazioni e centrifugare a 2,000 g per 5 minuti a 4 25 C. Questo lavaggio con etanolo rimuove il colore rosa dal pellet di DNA. In aggiunta un lavaggio in 0.1 M di sodio citrato-10% di etanolo è richiesto per larghi pellets contenenti più di 200µg di DNA 3. SOLUBILIZZAZIONE DEL DNA Rimuovere l etanolo di lavaggio e asciugare brevemente il pellet di DNA tramite apertura delle provette di reazione per 3 5 minuti a temperatura ambiente. Dissolvere il DNA in 8 mm di NaOH tramite passaggi lenti in pipette. Aggiungere un adeguata quantità di 8 mm di NaOH per circa µg/µl di DNA. Tipicamente, aggiungere ml di 8 mm di NaOH per DNA isolato da mg di tessuto. L uso di una soluzione gentile alcalina assicura la piena solubilizzazione del DNA. A questo punto, la preparazione del DNA (specialmente da tessuto) ancora contiene materiale insolubile (frammenti di membrane ); rimouvere questo materiale con centrifugazione a 12,000 g per 10 minuti e trasferire il supernatante contenente DNA in una nuova provetta di reazione. Una elevata presenza di viscosità indica presenza di DNA ad elevato peso molecolare. QUANTIFICAZIONE DEL DNA Per un ottima misura spettrofotometrica, le aliquote di DNA devono essere diluite con acqua o tampone con ph> 7.5. L acqua distillata con ph<7.0 falsa la Ratio 260/280 ed impedisce la determinazione delle proteine. Pagina 3 di 5

4 AMPLIFICAZIONE DEL DNA TRAMITE PCR Dopo solubilizzazione in 8 mm NaOH, aggiustare il ph del campione di DNA a 8.4 usando HEPES. Aggiungere una aliquota di campione (tipicamente µg di DNA) in un tubo di reazione. DIGESTIONE DEL DNA TRAMITE RESTRITTASI Aggiustare il ph della soluzione del DNA ad un valore richiesto usando HEPES. Alternativamente dializzare il campione con 1 mm EDTA, ph 7 ph 8. Trasportare fuori il DNA per la restrizione per 3 24 h in condizioni ottimali per la specifica restrittasi usando 3 5 unità per ogni µg di DNA. In tipiche analisi l % del DNA preparato è ristretto. III. ISOLAMENTO DELLE PROTEINE TRAMITE TRI REAGENT Le proteine sono isolate dal supernatante fenolo-etanolo ottenuto dopo precipitazione del DNA con etanolo (PRECIPITAZIONE DEL DNA). Il risultato può essere analizzato per la presenza specifica di proteine tramite Western Blotting. PROTOCOLLO Reagenti richiesti ma non forniti: guanidine hydrochloride, SDS, etanolo and isopropanolo, urea, DTT. Il protocollo include i seguenti steps: 1. PRECIPITAZIONE DELLE PROTEINE: fenolo-etanolo supernatante ml isopropanolo ( 1 ml TRI REAGENT). 2. LAVAGGIO DELLE PROTEINE: 2 ml 0.3 M guanidine hydrochloride in 95% etanolo, 3 x 20 min.; 2 ml etanolo, 1 x 20 min. 3. SOLUBILIZZAZIONE DELLE PROTEINE: 1% SDS or 10M urea/50 mm DTT. La procedura è effettuata all aperto a temperatura ambiente. 1. PRECIPITAZIONE DELLE PROTEINE Precipitare le proteine da supernatante fenolo-etanolo (volume approssimativo 0.8 ml)sopropanolo. Aggiungere 1.5 ml di isopropanolo per ciascun ml di TRI Reagent usato nella fase di omogenazione. Conservare i campioni per almeno 10 minuti a temperatura ambiente e sedimentare le proteine con precipitazione a 12,000 g per 10 minuti a 4 C. 2. LAVAGGIO DELLE PROTEINE Rimuovere il supernatante e lavare il pellet di proteine 3 volte in una soluzione contenente 0.3 M di guanidine hydrochloride in 95% etanolo. Aggiungere 2 ml di soluzione per ciascun ml di TRI Reagent usato nella prima fase. Ad ogni lavaggio, tenere il campione nella soluzione di lavaggio per 20 minuti a temperatura ambiente e centrifugare a 7,500 g per 5 minuti a 4 25 C. Poi, miscelate il pellet proteico con 2 ml di etanolo 100%, conservare per 20 minuti a temperatura ambiente e centrifugare a 7,500 g per 5 minuti a 4 25 C. Pagina 4 di 5

5 3. SOLUBILIZZAZIONE DELLE PROTEINE Il passaggio critico nell isolamento delle proteine è l estrazione dal pellet alla fine del protocollo. Opzione 1. Rimuovere l etanolo di lavaggio e asciugare il pellet per 5 10 minuti a temperatura ambiente. Dissolvere le proteine in 1% SDS tramite pipetta. Incubazione del campione a 50 C può essere richiesta per un efficace estrazione delle proteine dal pellet. Il pellet è composto da proteine solubili e materiale insolubile come membrane, matrice extracellulare, etc. Il sedimento di materiale insolubile si ottiene tramite centrifugazione a 10,000 g per 10 minuti a 4 C e trasferire il supernatante in un nuovo tubo. Usare una soluzione per proteine e conservare a 20 C. Opzione 2. Rimuovere l etanolo di lavaggio ed asciugare il pellet di proteine per 5 10 minuti a temperatura ambiente. Dissolvere il pellet di proteine in 10 M urea / 50 mm DTT. Aggiungere circa 50 µl di soluzione e tenete fermo il pellet con un ago. Il volume totale della soluzione aggiunta dovrebbe variare per ottenere l ottimale concentrazione proteica. Tenere il campione per 1 h a temperatura ambiente. Boil the sample for 3 minutes and sonicate on ice using 10 short bursts. All proteins should be in solution at this time. If not, the boiling and sonication steps may be repeated up to two more times. Dopo completa solubilizzazione, rimuovere il campione e fare una determinazione della concentrazione proteica. Conservare a 20 C. REFERENCES 1. Chomczynski P. and Sacchi N Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,162, Chomczynski P (1993) A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques, 15, Mackey K. and Chomczynski P Long-term stability of RNA isolation reagents. J NIH Res., 8, Chomczynski P. and Mackey K Substitution of chloroform with bromochloropropane in the singlestep method of RNA isolation. Anal Biochem, 225, Ausubel F., Brent R., Kingston R., Moore D., Seidman J., Smith J. and Struhl K Appendix 1, Current Protocols in Molecular Biology, 2, A.1.5, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY. 6. Chomczynski P. and Mackey K Modification of the TRI Reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide - and proteoglycan - rich sources. Biotechniques, 19, Wilfinger W., Mackey K. and Chomczynski P Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques, 22, Laemmli U Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, Pagina 5 di 5