Verona, 23 maggio 2012

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1 Verona, 23 maggio 2012 Test sperimentali per la valutazione di end-point specifici ai fini della classificazione di pericolosità di prodotti di consumo (es. cosmetici, detergenti, biocidi) e rifiuti Federica Cattapan

2 La forte spinta etica nei confronti dei test sugli animali (3R Replacement, Reduction, Refinement) e l esigenza di ridurre il più possibile i costi di una registrazione hanno portato alla necessità di mettere a punto e validare metodi alternativi in vitro ed ex vivo

3 Valutazione del rischio e metodi alternativi Endpoints presi in considerazione: - Tossicità acuta - Corrosione cutanea - Irritazione cutanea - Irritazione oculare - Mutagenicità - Fototossicità

4 Argomenti Applicazione dei modelli di cute umana in vitro per la valutazione della irritazione e corrosione cutanea Metodi alternativi validati in vitro per la valutazione di Fototossicità e Irritazione oculare Metodi di valutazione della tossicità acuta e cronica ambientale (ecotossicologia)

5 Metodi in vitro - Metodi in vitro validati per corrosione cutanea - Metodi in vitro validati per irritazione oculare - Metodo in vitro validato per irritazione cutanea - Metodo in vitro validato per fototossicità

6 Modelli di cute umana in vitro alternativi a a

7 Corrosione cutanea Metodi validati TER (Transcutaneous Electrical Resistance) test OECD430 Misurazione dell impedenza cutanea Riduzione di TER danno 5 kω cut-off value

8 Corrosione cutanea Metodi validati Linea guida di riferimento Skin Corrosion:Corrositex OECD testing guideline no. 435 Synthetic Biobarrier & Chemical detection system Vantaggi e svantaggi Risparmio di tempo e riduzione costi Dominio di applicabilità ridotto (ph dependente): The ICCVAM and the ECVAM both concluded that CORROSITEX is valid for testing organic bases and inorganic acids Protocollo (1 Giorno) Trattamento con la sostanza Registrazione del tempo di attraversamento della biobarriera

9 Corrosione/Irritazione cutanea Metodi validati Corrosion Modelli di cute 3D (EpiDerm, EPISKIN EST 1000 ) OECD431 Irritation Modelli di cute 3D (EpiDerm, EPISKIN EST 1000 ) OECD431 End Point: Vitalità cellulare mediante MTT Corrosivo? Vitalità < 50% dopo 3 minuti Vitalità 50% dopo 3 minuti e < 15% dopo 1 ora Irritante? Irritante per la pelle (R38) se la vitalità media dopo 20 minuti di esposizione e 42 ore d recupero risulta <50% rispetto al controllo negativo.

10 Corrosione/Irritazione cutanea Metodi validati Il campione in esame è applicato ai tessuti. Dopo esposizione i tessuti sono risciacquati con del buffer salino (PBS) quindi asciugati e colorati. La riduzione del MTT porta alla formazione di cristalli di un prodotto blu, il formazano, insolubile in acqua. Le cellule vitali, a differenza di quelle non vitali, riducono l MTT e l'ammontare del formazano prodotto è proporzionaleal numero di cellule presenti. Per stabilire quantitativamente l effetto del prodotto sulla sopravvivenza cellulare viene condotto il test colorimetrico MTT per la determinazione della vitalità cellulare. L MTT è basato sulla capacità del composto MTT (sale di tetrazolio, [3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) di venire metabolizzato da un enzima mitocondriale, la succinato deidrogenasi.

11 Irritazione oculare Draize test: riferimento per il test in vivo sviluppato negli anni 40 > 60 anni di utilizzo modello animale: coniglio dosi da 0,1 ml Osservazioni: cornea (opacità area coinvolta) iride (infiammazione) congiuntiva (rossore chemosi scarico)

12 Irritazione oculare Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) assay OECD 437 Isolated Chicken Eye (ICE) OECD 438 Effetti Danno corneale Danno corneale End-point Opacità corneale, spessore e permeabilità Istopatologia consigliata Opacità corneale, tumefazione, Permeabilità Istopatologia consigliata Panorama regolatorio Gravemente irritante /corrosive (CLP/GHS Cat 1/R41) Accettato in EU per gravemente irritanti e corrosivi (Luglio 2004) Gravemente irritante /corrosivo (CLP/GHS Cat 1/R41) Accettato in EU per gravemente irritanti e corrosivi (Luglio 2004) Range Limitazioni Moderati, severi e molto severi. Istologia può accrescere accuratezza Non sensibile per discriminare leggermente irritanti Senza istologia sottostima per sostanze che agiscono principalmente sui ride o congiuntiva Severi e non irritanti Limitazioni per i solidi

13 Linea guida di riferimento BCOP OECD testing guideline no. 437 Protocollo (1 Giorno) Isolamento cornea ed equilibratura Trattamento con la sostanza Valutazione dell opacità (opacitometro) Trattamento con Fluoresceina Valutazione della permeabilità Irritazione oculare Sistema di saggio Cornea di bovino isolata Vantaggi e svantaggi Riduzione costi Metodo formalmente validato per la corrosione; può dare indicazioni di base sul potenziale irritante

14 Irritazione oculare Isolated Rabbit Eye (IRE) assay Hen s Egg Test on the Chorio- Allantoic Membrane (HET-CAM) assay) Effetti Danno corneale Danno alla congiuntiva End-point Opacità corneale, tumefazione, integrità, funzione barriera Cambiamenti della vascolarizzazione (emorragia, lisi) e coagulazione, iperemia Panorama regolatorio Range Gravemente irritante /corrosive (CLP/GHS Cat 1/R41) Accettato in EU per gravemente irritanti e corrosivi (Luglio 2004) Severi Da leggermente a moderati per formulazioni basate su surfattanti Gravemente irritante /corrosivo (CLP/GHS Cat 1/R41) Accettato in EU per gravemente irritanti e corrosivi (Luglio 2004) Leggeri - non irritanti Limitazioni Limitazioni per i solidi Limitazioni per i solidi e per sostanze colorate

15 Fototossicità In vitro 3T3 NRU phototoxicity test OECD432 Phototoxicity is defined as a toxic response from a substance applied to the body which is either elicited or increased (apparent at lower dose levels) after subsequent exposure to light, or that is induced by skin irradiation after systemic administration of a substance. PIF (Photo-Irritation-Factor): factor generated by comparing two equally effective cytotoxic concentrations (IC50) of the test chemical obtained in the absence (-Irr) and in the presence (+Irr) of a non-cytotoxic irradiation with UVA/vis light.

16 Fototossicità

17 Fototossicità In vitro 3T3 NRU phototoxicity test OECD432 Test di citotossicità eseguito in presenza e assenza di irraggiamento NRU (neutral red uptake): l assorbimento di NR entro i lisosomi/endosomi e vacuoli delle cellule vitali è utilizzato come indicazione quantitativa della vitalità cellulare La massima dose testabile 1000 g/ml con osmolarità inferiore a 10 mm

18 Fototossicità

19 Ecotox Legge 28 del 24/03/2012 Nelle more dell adozione, da parte del Ministero dell ambiente e della tutela del territorio e del mare, di uno specifico decreto che stabilisca la procedura tecnica per l attribuzione della caratteristica H14, sentito il parere dell ISPRA, tale caratteristica viene attribuita ai rifiuti secondo le modalità dell accordo ADR per la 9 M6 («Materie pericolose per l ambiente acquatico, liquide») e M7 («Materie pericolose per l ambiente acquatico,solide»).

20 Ecotox I principali elementi da prendere in considerazione ai fini della classificazione di materie pericolose per l ambiente acquatico sono i seguenti: tossicità acuta per l ambiente acquatico; tossicità cronica per l ambiente acquatico; bioaccumulazione potenziale o effettiva; degradazione biotica e non biotica dei composti organici. La classe di pericolo «Pericoloso per l ambiente acquatico» è così differenziata: pericolo acuto per l'ambiente acquatico; pericolo cronico (a lungo termine) per l ambiente acquatico.

21 Ecotox Nella normativa ADR, la classificazione delle materie pericolose per l ambiente si basa sulla rilevazione mediante metodi di prova conformi a linee guida OCSE e specificamente indicati delle seguenti proprietà ecotossicologiche: - tossicità acuta per l ambiente acquatico (categoria Acuta 1 ); - tossicità cronica per l ambiente acquatico (distinta in categoria Cronica 1 e categoria Cronica 2 ); - bioaccumulazione potenziale o effettiva; - degradazione (biotica e non biotica) dei composti organici. Le miscele devono essere classificate in conformità a quanto previsto dal punto dell ADR, che riprende i criteri utilizzati per la classificazione delle sostanze, integrandoli con indicazioni ulteriori per il caso in cui non siano disponibili dati sulla tossicità per la miscela in quanto tale o in relazione a singoli componenti.

22 Ecotox Alcune definizioni utili LD 50: dose letale mediana, cioè la dose che uccide metà della popolazione saggiata; LC50: concentrazione letale mediana; ED50 /EC50: dose/concentrazione mediana efficace, cioè la dose che produce un determinato effetto (non necessariamente la morte) sul 50% della popolazione; NOED/NOEC: No Observed Effect Dose/Concentration, cioè la dose che non produce effetti osservabili; LOED/LOEC: Lowest Observed Effect Dose/Concentration, cioè la dose minima che produce effetti osservabili BCF: fattore di bioconcentrazione BCF = Cf/Cw Cf e Cw rappresentano le concentrazioni di una determinata sostanza nel tessuto dell organismo e nell acqua in cui vive Kow: coefficiente di ripartizione acqua/n-ottanolo che esprime la capacità di accumulo dei composti in fasi apolari, quali ad esempio i tessuti lipidici degli organismi. Kow = [S]ottanolo/[S]acqua [S] = concentrazione della sostanza S espressa in molarità o ppm L EPA afferma che i composti per i quali logkow è maggiore di 3.5 devono essere considerati potenzialmente pericolosi per l ambiente

23 Ecotox ADR Tab

24 Ecotox ADR Tab Pericolo di lunga durata per l ambiente acquatico Sostanze non rapidamente degradabili per le quali esistono dati adeguati sulla tossicità cronica

25 Ecotox ADR Tab Pericolo di lunga durata per l ambiente acquatico Sostanze rapidamente degradabili per le quali esistono dati adeguati sulla tossicità cronica

26 Ecotox ADR Tab Pericolo di lunga durata per l ambiente acquatico Sostanze per le quali non esistono dati adeguati sulla tossicità cronica

27 Ecotox EN 14735: Characterisation of waste Preparation of waste samples for ecotoxicity tests Questo standard Europeo descrive gli step necessari da compiere prima di condurre test ecotossicologici su rifiuti. Esso dà indicazioni su campionamento, trasporto, conservazione e preparazione campione. Questo draft Europeo è applicabile sia a rifiuti solidi che a liquidi. Esso non specifica una batteria di test.

28 Ecotox Pre-trattamento Il campione deve avere una granulometria inferiore ai 4 mm (almeno 95% in massa). Per questo motivo occorre setacciare i campioni: se la parte con granulometria >4 mm è maggiore del 5% in peso occorre macinare. Questo per raggiungere maggiore uniformità e dispersione

29 Ecotox Leaching procedure Place the test portion with the total mass M corresponding to (90 ± 5) g of dry mass MD in a bottle with a nominal volume of 1 l to minimise headspace. Ecotoxicological tests usually require several litres of eluate leading to an adjustment of mass of the test portion. When a large volume of eluate is required, it is possible to perform the leaching test in a vessel of appropriate capacity into which the corresponding number of test portions (a dry mass of (95 ± 5) g) are introduced or to perform parallel leaching tests at the same time with an appropriate number of vessels of 1 l capacity each (see above). In that case, all the individual eluates shall be mixed in order to obtain the test sample. When the leaching test is performed in one vessel, the size of the vessel shall be appropriate to minimise the headspace ( 5 % of the total capacity of the vessel). Add an amount of leachant (L) establishing a liquid to solid ratio (L/S) = 10 l/kg ± 2 % during the extraction. Care should be taken to obtain good mixing of solid and liquid.

30 Daphnia Tests OECD 202/211 Daphnia magna Gli animali nelle colture Stock devono essere mantenuti in condizioni più simili possibili a quelle di test (luce, temp, medium) Test Media: Acqua standard ( mg/l CaCO3; UNI EN ISO 250 mg/l) water, ph 7.8 ± 0.2 Repliche: 4 replicati per concentrazione da 5 animali per acuta. 4 replicati per concentrazione da 10 animali per cronica. Controlli: negativo e dicromato di potassio ( mg/l) ph e DO all inizio e alla fine di ogni test per ogni concentrazione, temperatura continuously Temperatura C 16-hours light and 8-hours dark cycle is recommended Light intensity not exceeding µe m-2 s-1.

31 Daphnia Tests OECD 202/211 Valutazioni e Calcoli 24 e 48 ore per organismi immobili 21 gg per cronica (semi static o flow throught test) Registrare ogni effetto inusuale es. galleggiamento di Daphnia Calcolare EC50, Limite di confidenza 95% e la slope ad ogni time point, con grafico a 48 ore Mortalità nei controlli negativi 10% acuta 20% cronica OD alla fine della prova maggiore o uguale 3 mg/l EC50 dicromato di potassio compreso tra mg/l per acuta Scarto tipo <20% tra le misure delle concentrazioni di sostanze a inizio e fine test

32 Algae Tests OECD 201 Acuta 72 h Cronica 96 h Particle counter metodo di elezione P 3 replicates per concentration (e.g. 100 ml volume each)

33 Algae Tests OECD 201

34 Fish Tests OECD 203/204/210 Specie Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) as cold water species Fathead minnow (Pimephales promelas), Medaka (Oryzias latipes) or Zebrafish (Brachydanio rerio) as warm water species* La selezione della specie dipende: Dal tipo di sostanza (sost. Chimica, diserbante. Farmaco, biocida) Dal paese di registrazione The test concentrations must be maintained, and preferably it should be at least 80% of the nominal concentration throughout the test. Depending on the stability of the test substance, this requires either a static for stable substances, or dynamic system* (semi-static or flow-through) for hydrolytically unstable, volatile, photo- or biodegradable, and substances with high adsorbtive tendency (high organic carbon/water partition coefficient (Koc) and very low solubility). *chronic fish test require dynamic system as well (degrading feed, faeces)

35 Fish Tests OECD 203/204/210 DO: 80%* of saturation value (you may use aeration) Light: photoperiod 16L/8D, with 30 min transition period ph: (required by EPA, OECD: )

36 Fish Tests OECD 203/204 Five or more concentrations in a geometric series Factor (Interval) between concentrations: OECD requirements: not exceeding 2.2 For new ai s (EPA requirements): 2 replicates (test volume appropriate to loading) per concentration with 10 organisms in each replicate For the other substances: 1 replicate with 7 fish For all substances: in a limit test, a minimum of 30 organisms should be exposed (3 replicates of 10 organisms in each = OPPTS versus OECD = 7) Times 96h acute gg long

37 Fish Tests OECD 203/204 Validity Criteria Mortality in the control(s) should not exceed 10% (or one fish) at the end of the exposure Constant conditions should be maintained, if necessary, dynamic procedures should be used DO 60% throughout the test (OPPTS for flow-through: 75%) There must be evidence, that the concentration has been satisfactorily maintained, and preferably it should be at least 80% of the nominal concentration throughout the test.

38 Chelab is already here New market and new business Laboratorio che opera in compliance alla UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 Laboratorio certificato Good Laboratory Practice (G.L.P.) Stabilimento autorizzato a gestire pesci a fini sperimentali Laboratorio autorizzato ad eseguire sperimentazioni su pesci a fini ecotossicologici Laboratorio autorizzato ad eseguire test per il marchio Ecolabel Authorized Laboratory for OK compost certified products of the European standard EN (Compostability and Biodegradability of packaging).

39 Enrico Nieddu Test di Biodegradabilita

40 Biodegradabilità Normativa Concetti base Standard Test Methods

41 Biodegradabilità Reg. 1272/2008/CE (CLP) (All. I parte 4) Reg. 1906/2006/CE (REACH) All. VII/IX Reg. 648/04/CE All. II/III (Reg. detergenti) Dir. 94/62/CE (Imballaggi) Green Label (Ecolabel)

42 Regulation (EC) No 648/2004 La legislazione sui detergenti garantisce una crescente protezione dell ambiente attraverso la salvaguardia degli ambienti marini dagli effetti dannosi di sostanze pericolose presenti nei detergenti. Scopo: Biodegradabilità dei tensioattivi Etichettatura dei detergenti Obbiettivi: Libero mercato dei detergenti nella UE Protezione dell ambiente e della salute umana

43 Regulation (EC) No 648/2004 Regulation (EC) No 648/2004 Tutti i tensioattivi devono soddisfare i criteri di biodegradazione aerobica completa stabiliti nell allegato III I tensioattivi nei detergenti sono da considerarsi biodegradabili se il livello di biodegradabilità aerobica (mineralizzazione) è almeno del 60 % entro i 28 giorni in accordo con i test riportati nell allegato III al Reg. 648/2004 Nel caso un detergente non superi le prove di biodegradazione aerobica completa è possibile una deroga che riporti i risultati di un test di biodegradabilità primaria ed una valutazione del rischio legata alla sostanza impiegata I test di biodegradabilità devono essere condotti da laboratori che siano conformi alla EN/ISO/IEC/17025 o alle buone pratiche di laboratorio (GLP)

44 Regulation (EC) No 648/2004 Regulation (EC) No 648/2004 Biodegradabilità completa (All III) TENSIOATTIVI Test superato conforme Test fallito DEROGA Biodegradabilità Primaria (All II) Test superato Possibile una deroga Test fallito Non conforme Valutazione del rischio Concessione deroga conforme

45 Biodegradabilità Normativa Concetti base Standard Test Methods

46 Biodegradabilità ultima SOSTANZE ORGANICHE POLIMERO OLIGOMERO poche unità monomeriche MONOMERO ALCOLI-ACIDI Biodegradabilità ultima Completa Mineralizzazione Biomassa + Sali minerali CO 2 H 2 O CH 4

47 BIODEGRADABILITA TERMINOLOGIA Biodegradabilità Primaria Biodegradabilità Ultima Biodegradabilità Completa Biodegradabilità Pronta Biodegradabilità Inerente Biodegradabilità Aerobica Biodegradabilità Anaerobica Velocemente Lentamente Facilmente Moderatamente Potenzialmente

48 BIODEGRADABILITA TERMINOLOGIA Il termine BIODEGRADAZIONE non ha informazioni in merito a: l ambiente specifico dove si suppone il processo dovrà aver luogo il tipo di processo (aerobico or anaerobico) il grado di biodegradazione (coversione totale o parziale in CO 2 ) la velocità che regolerà il processo (rapida, lenta)

49 BIODEGRADABILITA : TERMINOLOGIA BIODEGRADATION 1)Ambiente WATER MARINE WATER SOIL HOUSEHOLD WASTE 2)Tipo ANAEROBIC AEROBIC 3)Grado 4)Velocità PRIMARY ULTIMATE READY INHERENT Organic substances

50 BIODEGRADABILITA 1) L ambiente WATER (e.g.complete Waste Water Treatment Plant) WWTP Microorganisms, like all living things, require food for growth. Biological sewage treatment consists of a step-by-step, continuous, sequenced attack on the organic compounds found in wastewater

51 BIODEGRADABILITA 2) tipo di processo AEROBICA biodegradazione Aerobica: Tensioattivi + O 2 CO 2 + H 2 O + C RESIDUO + C BIOMASSA con ossigeno By Aerobic Microorganisms ANAEROBICA biodegradazione Anaerobica: Tensioattivi CO 2 + CH 4 + H 2 O + C RESIDUO + C BIOMASSA senza ossigeno By Anaerobic Microorganisms

52 Biodegradazione Aerobica Processo per step che comporta trasformazioni strutturali La chimica del sistema e sono caratterizzati da condizioni ossidative Ha una alta rilevanza ambientale perchè la maggior parte dei rifiuti è smaltita in impianti aerobici I batteri aerobici sono molto efficaci nel rompere sostanze organiche di scarto BIODEGRADABILITY OF DETERGENTS

53 Biodegradazione Anaerobica Processo per step che comporta trasformazioni strutturali in assenza di ossigeno Prende il nome: digestione anaerobica Comporta la riduzione di massa e di volume del materiale trattato E vista come una fonte di energia rinnovabile perché il processo produce biogas (CH 4 + CO 2 ) Ci sono 4 stadi chimico biologici che caratterizzano la digestione anaerobica : BIODEGRADABILITY OF DETERGENTS

54 BIODEGRADABILITY 3) GRADO DI DEGRADAZIONE PRIMARIA ULTIMA Biodegradebilità primaria comporta modifiche strutturali della molecola dovute all azione di microoganismi Biodegradebilità ultima comporta la completa degradazione della molecola ad opera di microorganismi fino ai prodotti ultimi CO 2, H 2 O e Biomassa )

55 BIODEGRADABILITA 4) Velocità del processo La velocità di biodegradazione è classificata attraverso alcuni test che valutano la biodegradazione di sostanze organiche in determinate condizioni. READY Biodegradabilità Immediata (Pronta) biodegradabilità ultima (mineralizzazione) condizioni aerobiche pass level: 60% o 70% biodegradabilità - solo per sostanze durata: 28 giorni OECD 301 test series INHERENT Biodegradabilità Inerente Propensione e pontenziale di biodegradazione condizioni di laboratorio favorevoli OECD 302 B (COD - DOC)

56 BIODEGRADABILITA : MISCELE I test di biodegradazione su miscele possono non essere soddisfacenti. I metodi sono stati studiati per singola sostanza organica I PASS LEVEL sono applicabili solo alle sostanze Eccezione: Miscele di molecole con le stesse caratteristiche (ad. Es. miscele di diversi omologhi)

57 Biodegradabilità Normativa Concetti base Standard Test Methods

58 BIODEGRADABILITA : I METODI READY BIODEGRADABILITY Method OECD All. V dir. Guidelines 67/548/CE ISO DOC - DIE AWAY TEST 301 A C4 - A ISO 7827 CO 2 EVOLUTION TEST 301 B C4 - C ISO 9439 MITI TEST 301 C C4 - F CLOSED BOTTLE TEST 301 D C4 - E ISO MODIFIED OECD SCREENING TEST 301 E C4 - B MANOMETRIC RESPIROMETRY TEST 301 F C4 - D ISO 9408 Metodi aerobici INHERENT BIODEGRADABILITY OECD All. V dir. Method Guidelines 67/548/CE ISO Modified SCAS Test 302 A C12 ISO 9887 Zahn - Wellens /EMPA Test 302 B C9 ISO 9888 Modified MITI Test 302 C ULTIMATE BIODEGRADABILITY CO 2 IN SEALED VESSELS (HEADSPACE TEST) 310 ISO BIODEGRADABILITY CONFIRMATORY TEST 303 ISO 11733

59 Metodi anaerobici BIODEGRADABILITA : I METODI

60 BIODEGRADABILITA : I METODI UFFICIALI e.g. READY BIODEGRADABILITY QUALE APPLICARE?

61 BIODEGRADABILITA : I METODI UFFICIALI e.g. READY BIODEGRADABILITY Facili da condurre SCREENING TEST La sola fonte di carbonio è la sostanza test Basse concentrazioni di inoculo Nessun preadattamento alla sostanza Non simulano l ambiente ma sono drastici e permettono di classificare le sostanze ( facilmente e rapidamente biodegradabile )

62 STANDARD TEST METHODS Biodegradazione Aerobica OECD 301B: CO 2 Evolution Test OECD 301F: manometric respirometry test Queste linee guida descrivono dei metodi per valutare la biodegradabilità di sostanze organiche in soluzione acquosa mediante test di screening

63 STANDARD TEST METHODS OECD 301 B CO2 Evolution Test (Modified Sturm Test) Una quantità nota di campione è posta in mineral medium e addizionata di un opportuno inoculo Aerato attraverso il passaggio di aria esente da CO 2 La degradazione è seguita per 28 giorni quantificando la CO 2 prodotta La CO2 è raccolta in una soluzione di bario idrossido La quantità di CO 2 prodotta è rapportata alla percentuale di ThCO 2 della sostanza. Una sostanza è classificata come prontamente biodegradabile quando la degradazione è superiore 60 % in 28 giorni Il riferimento positivo è il sodio benzoato

64 STANDARD TEST METHODS OECD 301B : CO2 Evolution Test sample

65 STANDARD TEST METHODS OECD 301B : CO2 Evolution Test 301 B - CO2 evolution test 100% 90% Riferimento Controllo Positivo Plateau phase 80% 70% Exponential Test substance A degradazione % 60% 50% 40% phase Test substance B 30% 20% prova A prova B riferimento 10% 10-day windows 0% Lag phase tempo (giorni)

66 STANDARD TEST METHODS OECD 301F : manometric respirometry test Un volume noto di mineral medium inoculato, contenente la sostanza in esame come unica fonte di carbonio organico, viene posto in agitazione all interno di un reattore chiuso. La CO2 prodotta nel processo viene adsorbita mediante soda. Il consumo di ossigeno viene monitorato per 28 giorni e registrato per via manometica Deg mg O2 campione O2 bianco.(%) = 100 mg - mg campione

67 STANDARD TEST METHODS OECD 301F : manometric respirometry test Controllo remoto Misuratore di pressione soda Mineral medium Inoculo Sostanza test

68 STANDARD TEST METHODS OECD 301F : manometric respirometry test OECD 301F Riferimento Controllo Positivo 70 mg/l Tensioattivo solfato 40 Tensioattivo solfonato solfonato lauril solfato anilina (riferimento) bianco tempo (h)

69 STANDARD TEST METHODS CONSIDERAZIONI La biodegradabilità è un processo complicato influenzato da molte variabili:. peso molecolare; Stuttura chimica (ad. es ingombro sterico rallenta l attacco enzimatico) inibizione della crescita dei microorganismi strutture solo parzialmente biodegradabili parametri di processo (ph,temp,pressure,light,hr%,inoculum)

70 CONCLUSION Per effettuare questi test è nessaria: Competenza scientifica ed una struttura capace di individuare/valutare/controllare i numerosi parametri critici Accreditamento alla EN ISO/IEC 17025:2005 Accordo con le Buone pratiche di laboratorio (GLP)

71 Grazie per l attenzionel