Il Two-Hybrid System e le sue applicazioni

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1 Il Two-Hybrid System e le sue applicazioni

2 Una breve storia 1985 nel laboratorio di Mark Ptashne fu dimostrata la modularità degli attivatori della trascrizione leganti il DNA nel laboratorio di Steve McKnight furono identificati degli attivatori della trascrizione che non legavano il DNA 1989 nel laboratorio di Stanley Field fu pubblicato il primo lavoro sul Two-hybrid assay

3 Two-hybrid system Il sistema del doppio ibrido (Two-hybrid system) è una metodologia basata sulla modularità dei fattori di trascrizione che permette di identificare e clonare proteine che interagisco con altre proteine. Il problema generale di caratterizzare interazioni proteina-proteina, identificando eventuali partner proteici di una proteina data, può venire risolto in vari modi, tra cui: co-immunoprecipitazioni (utilizzo di anticorpi e risoluzione su gel nativi) cross-linking (con reagenti, come la glutataraldeide, che formano legami covalenti tra le proteine che interagiscono) colonne di affinità con partner di interazione co-purificazioni in colonne cromatografiche screening di librerie di espressione Il two-hybrid system si distingue perché arriva a identificare e clonare contemporaneamente il gene che codifica per il partner proteico senza bisogno di informazioni preliminari o di strumenti precostituiti (per es. anticorpi)

4 Yeast two-hybrid system Saccharomyces cerevisiae

5 Promotori e trascrizione L inizio di trascrizione genica nei lieviti, come in altri organismi, è garantita da vari meccanismi molecolari che agiscono in contemporanea. I geni strutturali sono preceduti da una regione contenente una sequenza conservata (TATAbox) che determina il sito d inizio trascrizione. Molti geni sono inoltre associati ad altre sequenze di DNA a cui si legano fattori di trascrizione ed altre proteine regolatrici Nei plasmidi impiegati per le tecniche di Hybrid System le regioni TATA e UAS sono state disegnate in modo da garantire la massima efficienza di trascrizione.

6 Promotori e trascrizione

7 Promotori e trascrizione

8 Upstream activating sequence (UAS)

9 Upstream activating sequence (UAS)

10 Gal4 I fattori trascrizionali sono generalmente costituiti da due moduli: un dominio che si lega al DNA (BD) e un attivatore trascrizionale (AD). Questi domini possono essere considerati funzionalmente indipendenti come dimostrato da Ptashneetcoll.

11 Gal 4 AD Gal 4 BD Gal 4 box Gal gene Lex A AD Lex A BD LexA box Lex A Gal 4 AD Lex A BD NON TRASCRIVE Gal 4 box Gal gene Lex A AD Gal 4 BD Gal 4 box Gal gene

12 E possibile, viste le caratteristiche suddette, clonare in un vettore di espressione il DNA della proteina X di interesse ( esca o bait ) con quello del DNA-Binding Domain (DBD) del fattore di trascrizione, ottenendo l espressione dell ibrido DBD-bait; Allo stesso modo, possono essere costruite proteine di fusione contenenti l Activation Domain del fattore di trascrizione (AD) e proteine Y ( preda o prey ), AD-prey La co-espressione degli ibridi DBD-Bait e AD-prey in un ceppo di lievito opportuno porta alla ricostituzione del fattore di trascizione attivo (DBD-AD) solo nel caso in cui esca e preda interagiscano tra loro

13 Ricercatore Bait (esca) (proteina di interesse) Prey (preda) Lago = lievito (proteina incognita da libreria DNA)

14 Ceppi utilizzati Solitamente sono ceppi che hanno caratteristiche particolari e contengono dei markers biosintetici e sensibilità ad antibiotici ad esempio: sono His-, Leu-, Trp-, Ade- sono generalmente sensibili ad alcuni antibiotici come Zeocina e Neomicina

15 Scelta dei vettori DNA-binding domains 1) il fattore trascrizionale di Saccaromyces cerevisiae Gal4p 2) il repressore di E. coli lexa Activation domains 1) il fattore trascrizionale di S. cerevisiae Gal4p 2) la proteina dell'herpes simplex virus VP16

16 Vettore esca Vettore preda

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20 Trasformare in lievito la fusione Gal4BD-DNA esca doppia trasformazione Trasformare in lievito la Libreria di fusioni Gal4AD-cDNA Leu +,Trp + Leu + Trp + NO SI NO La proteina esca interagisce con una proteina della library e posiziona l attivatore trascrizionale in modo da attivare la trascrizione del gene reporter Gal 4 BD Gal 4 box Gal 4 AD Gal 4

21 Geni reporter

22 Master plate: terreno His-, Leu-, Trp- Ceppi di controllo: - strong positive (Fos/Jun; ++), - weak positive (prb/e2f; +), - negative (empty vector; )

23 3AT (3-amino-triazole) reporter plate La crescita indica attivazione trascrizionale del gene HIS3.

24 ß-galactosidase assay La colorazione blu indica l attivazione del gene lacz Non tutte le colonie cresciute su piastre con 3AT sono blu, indicando una debole interazione proteina-proteina

25 Risultati Master 3AT reporter plate ß-galactosidase assay Gene bank Analisi del DNA

26 Controlli per evitare falsi positivi: - L esca non deve possedere intrinseche capacità di attivazione la trascrizione: controllo clonando solo il plasmide BD-bait; - La preda non deve possedere intrinseche capacità di legame al DNA: in maniera controllo utilizzando solo il plasmide AD-prey; - L esca non deve avere siti di legame per AD: controllo clonando da un lato il Plasmide BD-esca e dall altro un plasmide contenente soltanto AD; - La preda non deve avere siti di legame per BD: controllo clonando da un lato AD-prey e dall altro un plasmide contenente solo BD; - Non ci deve essere trascrizione basale di beta-galattosidasi: controllo delle colonie prima del two Hybrid

27 Come si valutano i positivi? Test specifici: isolare le prede e ritestarle con esche di controllo -Preda senza esca - Preda con DBD da solo - Preda con ibridi non correlati - Preda con mutante non funzionale dell esca

28 Problemi FALSI POSITIVI: - proteine appiccicose - interazioni fisiologicamente non rilevanti - auto-attivazione FALSI NEGATIVI: - proteine non rappresentate nella library - scarsa espressione - misfolding dell esca o della preda - mancanza di modificazioni post-traduzionali - tossicità delle proteine ibride Test alternativi di interazione proteina-proteina: - Co-immunoprecipitazione - GST pulldown

29 Modificazioni del sistema 1. Analisi di complessi multiproteici 2. Mutazioni o Proteine che indeboliscono o aboliscono le interazioni 3. Proteine che legano una sequenza di RNA 4. Proteine che legano una sequenza di DNA 5. Interazioni proteina-proteina che richiedono fosforilazione di una delle due 6. Piccole molecole ligando che mediano l interazione proteina-proteina 7. Piccoli peptidi che interagiscono con la proteina esca

30 Modificazioni del sistema 1. Analisi di complessi multiproteici 2. Mutazioni o Proteine che indeboliscono o aboliscono le interazioni 3. Proteine che legano una sequenza di RNA 4. Proteine che legano una sequenza di DNA 5. Interazioni proteina-proteina che richiedono fosforilazione di una delle due 6. Piccole molecole ligando che mediano l interazione proteina-proteina 7. Piccoli peptidi che interagiscono con la proteina esca

31 Complessi multiproteici E possibile co-esprimere una componente proteica che è noto interagire con l esca in modo da rafforzare il legame con una eventuale proteina preda

32 Modificazioni del sistema 1. Analisi di complessi multiproteici 2. Mutazioni o Proteine che indeboliscono o aboliscono le interazioni 3. Proteine che legano una sequenza di RNA 4. Proteine che legano una sequenza di DNA 5. Interazioni proteina-proteina che richiedono fosforilazione di una delle due 6. Piccole molecole ligando che mediano l interazione proteina-proteina 7. Piccoli peptidi che interagiscono con la proteina esca

33 The Reverse Two-Hybrid E un sistema inverso, in cui l interazione delle due proteine porta alla attivazione di un gene reporter che porta alla morte cellulare ad es. URA3 che consente la crescita su acido 5-fluoroorotico (5- FOA) che porta alla formazione di un composto tossico per la cellula Una mutazione sull esca può portare alla mancata interazione e la cellula sopravvive

34 The Two and a Half-Hybrid In questo caso può essere l interazione con un terzo componente ( ad es. un farmaco o altra componente proteica) che porta ad una mancata interazione

35 Modificazioni del sistema 1. Analisi di complessi multiproteici 2. Mutazioni o Proteine che indeboliscono o aboliscono le interazioni 3. Proteine che legano una sequenza di RNA 4. Proteine che legano una sequenza di DNA 5. Interazioni proteina-proteina che richiedono fosforilazione di una delle due 6. Piccole molecole ligando che mediano l interazione proteina-proteina 7. Piccoli peptidi che interagiscono con la proteina esca

36 The Three-Hybrid Il DBD è fuso con un frammento legante RNA noto con cui interagisce l RNA esca (o ad es. un farmaco) che a sua volta interagisce con una preda legante RNA. Non riguarda direttamente interazione proteina-proteina

37 Modificazioni del sistema 1. Analisi di complessi multiproteici 2. Mutazioni o Proteine che indeboliscono o aboliscono le interazioni 3. Proteine che legano una sequenza di RNA 4. Proteine che legano una sequenza di DNA 5. Interazioni proteina-proteina che richiedono fosforilazione di una delle due 6. Piccole molecole ligando che mediano l interazione proteina-proteina 7. Piccoli peptidi che interagiscono con la proteina esca

38 The One-Hybrid Consente di identificare proteine che interagiscono con il DNA mediante la diretta ativazione della trascrizione

39 Modificazioni del sistema 1. Analisi di complessi multiproteici 2. Mutazioni o Proteine che indeboliscono o aboliscono le interazioni 3. Proteine che legano una sequenza di RNA 4. Proteine che legano una sequenza di DNA 5. Interazioni proteina-proteina che richiedono fosforilazione di una delle due 6. Piccole molecole ligando che mediano l interazione proteina-proteina 7. Piccoli peptidi che interagiscono con la proteina esca

40 The Trihybrid Se la proteina esca deve essere fosforilata per interagire con altre proteine una Tyr-cinasi viene co-espressa con l esca

41 Modificazioni del sistema 1. Analisi di complessi multiproteici 2. Mutazioni o Proteine che indeboliscono o aboliscono le interazioni 3. Proteine che legano una sequenza di RNA 4. Proteine che legano una sequenza di DNA 5. Interazioni proteina-proteina che richiedono fosforilazione di una delle due 6. Piccole molecole ligando che mediano l interazione proteina-proteina 7. Piccoli peptidi che interagiscono con la proteina esca

42 The Ligand Two-Hybrid Sia la preda che l esca possono interagire con una piccola molecola ligando che media la loro interazione

43 Modificazioni del sistema 1. Analisi di complessi multiproteici 2. Mutazioni o Proteine che indeboliscono o aboliscono le interazioni 3. Proteine che legano una sequenza di RNA 4. Proteine che legano una sequenza di DNA 5. Interazioni proteina-proteina che richiedono fosforilazione di una delle due 6. Piccole molecole ligando che mediano l interazione proteina-proteina 7. Piccoli peptidi che interagiscono con la proteina esca

44 The Peptide Two-Hybrid La proteina preda può essere derivatizzata con un breve peptide E così possibile identificare la sequenza minima interagente con la proteina

45 Come procedere Costruzione dell esca, verifica dell espressione e test di autoattivazione Trasformazione con la library e selezione dei cloni positivi Test per verificare la dipendenza dall esca e sequenziamento della preda

46 Svantaggi Falsi positivi e negativi Interazioni in vivo (dipendenza da temperatura, ph, conc. Proteica) Overespressione di proteine Localizzazione nucleare Proteine ibride misfolded Autoattivazione Analisi qualitativa La rilevanza fisiologica delle interazioni deve essere determinata anche con altri metodi Vantaggi Interazioni in vivo Non è necessario effettuare purificazioni Non dipende dalla naturale attività delle proteine Screening ad ampio spettro Test di approccio semplice Versatilità Disponibilità di molte librerie Domini di interazione facilmente mappabili

47 RIASSUMENDO

48 Sistemi Ibridi modificati SPLIT UBIQUITIN ASSAY SOS RECRUITMENT SYSTEM

49 The Split Ubiquitin Assay Il vettore Bait è espresso come la fusione alla metà C-term dell Ubiquitina (Cub) di un fattore trascrizionale (Lex-A VP16). Il vettore Prey invece esprime la seconda proteina target fusa alla porzione N-term dell ubiquitina (Nub) che porta però una mutazione Ile3->Gly tale da ridurre l affinità per Cub. Se le 2 proteine di interesse interagiscono portano anche alla riassociazione della split-ubiquitin che viene riconosciuta dalle Proteasi UBPs in grado di tagliare la catena polipeptidica tra il Cub e LexA-VP16. Il fattore trascrizionale LexA viene rilasciato ed entra nel nucleo dove attiva i geni reporter.

50 The SOS recruitment system L esca è localizzata a livello della membrana plasmatica attraverso una miristilazione La preda è invece fusa con SOS (Guanine Exchange Factor) Crescita cellulare L interazione dell esca con la preda recluta SOS alla membrana, determina la conversione GDP-Ras GTP-Ras (inattivo) (attivo) e porta alla crescita cellulare

51 Sistemi ibridi non in lievito E.coli +Crescita veloce +Alta efficienza di trasformazione +Facilità di estrazione plasmidica +I domini di attivazione eucariotica non attivano la trascrizione -Non si hanno modificazioni post-traduzionali -Non si verificano di solito interazioni indirette -Poca letteratura -Poche modificazioni del sistema

52 Bacterial two-hybrid system Adenilato ciclasi inattiva attiva Catabolite Activator Protein

53 Sistemi ibridi non in lievito Cellule di mammifero +Sono possibili interazioni indirette +Facilità di esecuzione -Bassa efficienza di trasformazione -Poca letteratura -Poche modificazioni del sistema

54 Mammalian two-hybrid system

55 β-galactosidase Mutant Complementation Una tecnologia innovativa è lo screening di Complementazione intra-cistronica (ICAST) E un test che si effettua su cellule vive e quantifica direttamente l interazione tra proteine in cellule di mammifero Utilizza la complementazione intracistronica del gene LacZ che avviene solo quando i due frammenti dell enzima sono espressi come chimere con proteine che interagiscono tra loro