Mutation screening mediante PCR

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1 Mutation screening mediante PCR

2 Denaturing High-Perfomance Liquid Chromatography (DHPLC) E una tecnica di analisi cromatografica ad alta pressione che consente di discriminare tra homoduplex ed heteroduplex in una popolazione di frammenti di DNA. La separazione viene ottenuta riscaldando la colonna cromatografica ad una temperatura prossima al Tm del frammento analizzato. In tali condizioni il legame alla colonna dell heteroduplex si riduce ed è eluito anticipatamente rispetto all homoduplex, evidenziando la presenza della variazione.

3 Analisi degli heteroduplex

4 Come si lega il DNA alla resina della colonna. Il legame del DNA alla resina è mediato dal TEAA. Il TEAA interagisce con la superfice idrofobica della resina mentre lo ione AMMONIO si lega con lo ione FOSFATO del DNA. l interazione tra la resina e la catena alchilica del TEAA e ridotta dalla presenza dell ACETONITRILE.

5 DNASep Cartridge C18 Alkylated PS/DVB Polymer 3 micron Particle Size Very Highly Efficient ph and Temperature Stable Injection guarantee >4000 Cleanable

6 Chimica della separazione (1)

7 Chimica della separazione (1)

8 Chimica della separazione (2)

9 Chimica della separazione (2)

10 Absorbance (254nm) La temperatura Retention time / min

11 Wave 3500HT HSD Fluorimetro UV Detector Forno HS Autocampionatore Pompa Centro Grandi Apparecchiature Seconda Università degli Studi di Napoli

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14 Analisi al DHPLC

15 Amplification Refractory Mutation System (ARMS)

16 Degenerate Oligonucleotideprimed PCR (DOP-PCR)

17 Rapid amplification of cdna Ends (5-3 RACE)

18 Multiplex- PCR E una reazione di PCR in cui più coppie di primers vengono utilizzate insieme per amplificare diversi frammenti la cui lunghezza deve essere tale da poterli agevolmente separare mediante elettroforesi. Esistono diverse applicazioni diagnostiche basate sulla multiplex-pcr. Il principale problema è l ottimizzazione delle condizioni di amplificazione. Temperatura di annealing dei primers e loro concentrazione. Durata dell annealing e della fase estensione ph, concentrazione Mg2+ ed eventuale aggiunta di additivi che possono migliorare le perfomance dell enzima

19 Diagnosi di DMD/BMD

20 80plex-PCR (1) DMD Scelta dei primers: Sequenze esoniche ed introniche dalla GenBank (NM_ ) BMD Lunghezza finale degli ampliconi è stata scelta per ottenere, sul gel, una serie di bande elettroforetiche equidistanti (dipendenza della migrazione dal log n bp)

21 80plex-PCR (2) A DMD B C BMD D

22 80plex-PCR (3) MIX A MIX C 1: del ex 43 2: del ex 11, 17, 19, 21 3: del ex 17, 19, 21 4: del ex 50, 52 5: del ex 7, 11, 17, 19 6: del ex 61 1: del ex 26, 28, 30, 32,34, 36, 38, 40, 42 2: del ex 9, 13, 16, 24, 26 3: del ex 13, 16, 24, 26, 28, 30 4: del ex 48 5: del ex 9, 13, 16 6: del ex MIX B 1: no del 2: del ex 8, 12, 18, 20, 22 3: del ex 12, 18, 20, 22 4: del ex 46, 51 5: del ex 6, 8, 12, 18 6: del ex 62 MIX D 1: del ex 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 2: del ex 10, 14/15, 23, 25, 27, 29 3: del ex 14/15, 23, 25, 27, 29 4: del ex 47, 49 5: del ex 10, 14/15 6: no del

23 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Riconoscimento di variazioni del numero di copie in più di 40 distinte sequenze genomiche mediante un unica reazione di PCR. Campi applicativi: Caratterizzazione di delezioni/duplicazioni o variazioni del numero di copie (aneuploidie) Determinare lo stato di metilazione di promotori o regioni imprinted Quantificazione relativa di RNA Riconoscimento di specifiche mutazioni puntiformi o SNPs (single nucleotide polymorphism) Richiede minime quantità di DNA genomico (circa 20 ng).

24 Come funziona l MLPA

25 Il gene ASPA codifica per l asparto-acilasi. Mutazioni in questo gene causano la Malattia di Canavan (deficit di aspartoacilasi) o degenerazione spongiosa del sistema nervoso centrale. E una degenerazione neurologica autosomica recessiva, che di solito causa morte precoce.

26 Identificazione di specifiche mutazioni puntiformi mediante MLPA

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28 X DMD exon 01 X DMD exon 03 X DMD exon 05 X DMD exon 07 X DMD exon 09 X DMD exon 21 X DMD exon 23 X DMD exon 25 X DMD exon 27 X DMD exon 29 X DMD exon 41 X DMD exon 43 X DMD exon 45 X DMD exon 47 X DMD exon 49 X DMD exon 61 X DMD exon 63 X DMD exon 65 X DMD exon 67 X DMD exon 69 X DMD exon 11 X DMD exon 13 X DMD exon 15 X DMD exon 17 X DMD exon 19 X DMD exon 31 X DMD exon 33 X DMD exon 35 X DMD exon 37 X DMD exon 39 X DMD exon 51 X DMD exon 53 X DMD exon 55 X DMD exon 57 X DMD exon 59 X DMD exon 71 X DMD exon 73 X DMD exon 75 X DMD exon 77 X DMD exon 79 c c c c c c Ratio Ratio Analisi mediante MLPA del gene DMD (1) 1.6 ìmlpa_p34_3_c^gmstxt.txt Mix P Paziente A P35 Mix P Mapview Mapview Femmina portatrice di una delezione degli esoni 12-30

29 Analisi mediante MLPA del gene DMD (2) Maschio affetto (BMD) con duplicazione in emizigosi degli esoni 3-4

30 Il sequenziamento del DNA Il metodo oggi comunemente utilizzato è il metodo enzimatico di Sanger. Prevede la reazione di sintesi del DNA utilizzando dntp + ddntp (2,3 dideossinucleotidi trifosfati). L assenza dell OH in 3 impedisce la formazione del legame fosfodiesterico con la base successiva è la sintesi s interrompe Se i ddntp sono opportunamente marcati, dopo separazione elettroforetica, è possibile leggere la corretta successione delle basi.

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35 Next-Generation Sequencing (NGS) Il sequenziamento automatico secondo il metodo Sanger ha dominato nella scienza e nell industria per almeno 20 anni e ha consentito il sequenziamento del genoma umano e la scoperta di almeno malattie genetiche. Il sequenziamento automatico secondo il metodo Sanger è considerato la tecnologia di prima generazione, mentre I nuovi metodi di deep sequencing sono denominati nextgeneration sequencing (NGS) I maggiori vantaggi offerti dal next-generation sequencing sono rappresentati dalla capacità di produrre un volume enorme di dati a basso costo. Le potenzialità del next-generation sequencing sono simili a quelle offerte dall avvento della PCR, con il solo limite dell immagginazione dell utilizzatore.

36 Tecnologie attualmente disponibili Illumina/Solexa (modified Sanger) Roche/454 (pyrosequencing) Applied Biosystems SOLID (sequencing by ligation).

37 Principi della metodica Si basano sul principio del sequenziamento di 'cluster' clonali. Il processo, che incomincia con una singola molecola target, prevede la creazione di targets clonali durante un processo intermedio di amplificazione. Copie multiple identiche sono infatti necessarie per avere un alto rapporto segnale-rumore Sequenziamento mediante sintesi (SBS) Sequenziamento mediante ligazione (SBL) SOLID Chimica con terminatori SOLEXA Chimica del pirosequenziamento 454

38 Tecnologia Illumina/Solexa

39 Tecnologia ROCHE 454 (1)

40 Tecnologia ROCHE 454 (1) APS=adenosine 5 phosphosulfate PPi=pyrophosphate

41 Confronto tra le metodiche Roche (454) Illumina SOLiD Chemistry Pyrosequencing Polymerase-based Ligation-based Amplification Emulsion PCR Bridge Amp Emulsion PCR Paired ends/sep Yes/3kb Yes/200 bp Yes/3 kb Mb/run 100 Mb 1300 Mb 3000 Mb Time/run 7 h 4 days 5 days Read length 250 bp bp 35 bp Cost per run (total) $8439 $8950 $17447 Cost per Mb $84.39 $5.97 $5.81

42 Sequenziamento dell exoma di 8 individui di controllo Sequenziamento dell exoma di 4 individui non imparentati tra loro affetti dalla sindrome Freeman Sheldon, artrogripposi distale tipo 2A, un raro disordine autosomico dominante. Un a mutazione nel gene MYH3, myosin, heavy chain 3, skeletal muscle (17p13.1) causa la malattia.

43 Risultati