History of DNA Sequencing

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1 History of DNA Sequencing Adapted from Eric Green, NIH; Adapted from Messing & Llaca, PNAS (1998) Efficiency (bp/person/year) Miescher: Discovers DNA Avery: Proposes DNA as Genetic Material Watson & Crick: Double Helix Structure of DNA Holley: Sequences Yeast trna Ala ,500 15,000 25,000 50, , Wu: Sequences λ Cohesive End DNA Sanger: Dideoxy Chain Termination Gilbert: Chemical Degradation Messing: M13 Cloning Hood et al.: Partial Automation Cycle Sequencing Improved Sequencing Enzymes Improved Fluorescent Detection Schemes 50,000, ,000,000, Next Generation Sequencing Improved enzymes and chemistry New image processing

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3 (1) Produzione dello stampo a filamento singolo Evoluzione dei vettori d espressione Utilizzo della PCR (PCR asimmetrica Promotore/operatore M13 Shine-Dalgarno TAG laci BamHI Terminatore Utilizzo di fagemidi oric Ap ori Utilizzo di un fago helper Per M13 e produzione della Forma a singolo filamento Denaturazione del vettore 3

4 DNA sequencing by Capillary Electrophoresis (CE) Resa: circa pb/corsa

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6 L Algoritmo Phred e l identificazione delle basi 1) I 4 tracciati fluorescenti sono fusi in un unico file 2) il computer calcola il punto dove si aspetta di trovare un picco, basandosi sulla distanza media dei picchi in certe parti della sequenza. La lettera N viene assegnata quando non è possibile individuare una base esatta. 3) calcola i valori massimi locali per ogni serie di tracciati e valuta se ogni picco cade nello spazio previsto 4) Per stabilire se un picco è reale viene indicato un valore soglia di altezza minima e massima 6

7 Le probabilità di errore (P) del programma Phred sono calcolate in base a 4 parametri: 1) la variazione di distanza del picco, al centro, in un intervallo di 7 picchi; 2) il rapporto fra il più alto e il più basso picco non identificato in un dato intervallo; 3) il rapporto fra il più alto e il più basso picco in un intervallo con tre picchi; 4) il n di basi tra quella in esame e quella più vicina non identificata

8 Determinazione della qualità delle sequenze: algoritmo Phred valore di affidabilità: Phred-score Phred-score = - 10 log10 P ( probabilità di errore) Phred-score = 10 P=1/10 Phred-score = 20 P=1/100 Phred-score = 30 P=1/1000 ok! Al termine dell analisi, Phred genera un file in cui ad ogni base è assegnato il corrispondente Phred-score

9 L Algoritmo Phred e l identificazione delle basi 1) I 4 tracciati fluorescenti sono fusi in un unico file 2) il computer calcola il punto dove si aspetta di trovare un picco, basandosi sulla distanza media dei picchi in certe parti della sequenza. La lettera N viene assegnata quando non è possibile individuare una base esatta. 3) calcola i valori massimi locali per ogni serie di tracciati e valuta se ogni picco cade nello spazio previsto 4) Per stabilire se un picco è reale viene indicato un valore soglia di altezza minima e massima 9

10 Le probabilità di errore (P) del programma Phred sono calcolate in base a 4 parametri: 1) la variazione di distanza del picco, al centro, in un intervallo di 7 picchi; 2) il rapporto fra il più alto e il più basso picco non identificato in un dato intervallo; 3) il rapporto fra il più alto e il più basso picco in un intervallo con tre picchi; 4) il n di basi tra quella in esame e quella più vicina non identificata

11 Determinazione della qualità delle sequenze: algoritmo Phred valore di affidabilità: Phred-score Phred-score = - 10 log10 P ( probabilità di errore) Phred-score = 10 P=1/10 Phred-score = 20 P=1/100 Phred-score = 30 P=1/1000 ok! Al termine dell analisi, Phred genera un file in cui ad ogni base è assegnato il corrispondente Phred-score

12 L Algoritmo Phred e l identificazione delle basi 1) I 4 tracciati fluorescenti sono fusi in un unico file 2) il computer calcola il punto dove si aspetta di trovare un picco, basandosi sulla distanza media dei picchi in certe parti della sequenza. La lettera N viene assegnata quando non è possibile individuare una base esatta. 3) calcola i valori massimi locali per ogni serie di tracciati e valuta se ogni picco cade nello spazio previsto 4) Per stabilire se un picco è reale viene indicato un valore soglia di altezza minima e massima 12

13 Le probabilità di errore (P) del programma Phred sono calcolate in base a 4 parametri: 1) la variazione di distanza del picco, al centro, in un intervallo di 7 picchi; 2) il rapporto fra il più alto e il più basso picco non identificato in un dato intervallo; 3) il rapporto fra il più alto e il più basso picco in un intervallo con tre picchi; 4) il n di basi tra quella in esame e quella più vicina non identificata

14 Determinazione della qualità delle sequenze: algoritmo Phred valore di affidabilità: Phred-score Phred-score = - 10 log10 P ( probabilità di errore) Phred-score = 10 P=1/10 Phred-score = 20 P=1/100 Phred-score = 30 P=1/1000 ok! Al termine dell analisi, Phred genera un file in cui ad ogni base è assegnato il corrispondente Phred-score

15 Next-gen sequencers From John McPherson, OICR 100 Gb 10 Gb AB/SOLiDv3, Illumina/GAII short-read sequencers (10+Gb in bp reads, >100M reads, 4-8 days) bases per machine run 1 Gb 100 Mb 10 Mb 1 Mb 454 GS FLX pyrosequencer ( Mb in bp reads, 0.5-1M reads, 5-10 hours) ABI capillary sequencer ( Mb in bp reads, 96 reads, 1-3 hours) 10 bp 100 bp 1,000 bp read length 15

16 Pyrosequencing - Solid Phase Ronaghi M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res

17 Pyrosequencing - Liquid Phase Ronaghi M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res

18 Pyrogram Ronaghi M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res

19 454 LifeSciences Sequencer

20 %5B77r5p8IBwJk%5D.cfm

21 SOLiD_video_final.html 21

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23 APPLICAZIONI DELLE TECNICHE DI SEQUENZIAMENTO Whole Genome Sanger (old-gen) Sequencing Human (early drafts), model organisms, bacteria, viruses and mitochondria (chloroplast), low coverage Now-Gen Sequencing New human (!), individual genome, 1,000 normal, 25,000 cancer matched control pairs, rare-samples RNA cdna clones, ESTs, Full Length Insert cdnas, other RNAs RNA-Seq: Digitization of transcriptome, alternative splicing events, mirna Communities Environmental sampling, 16S RNA populations, ocean sampling, Human microbiome, deep environmental sequencing, Bar-Seq Other Epigenome, rearrangements, ChIP-Seq 23

24 Elenco dei siti che contengono informazioni sul Progetto Genoma Umano e sui frammenti di DNA sequenziati.

25 Sequenziamento: Applicazioni in ambito biomedico Sequenziamento di genomi umani individuali a scopo preventivo o farmacoterapeutico. Analisi dettagliata delle mutazioni presenti in cloni cancerosi Associazione Genotipo-Fenotipo Profilo di espressione genica complessivo in vitro e in situ a tutti gli stadi di sviluppo di un organismo multicellulare Diversità Microbica (studi metagenomici) Eteroplasmia Mitocondriale 25

26 454-based Mutation Detection DNA from X tumor samples Pooled with equal concentration PCR amplification with Y primer pairs Pool PCR products 454 sequencing SNP/Indel Detection Using ssahasnp and BreakPointRead Reads with G12 mutation in KRAS Reads with 15 bp deletion in EGFR 26

27 Solexa Approach to Exon Sequencing Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 gdna Fragment and hybridize to Solexa capture array Elute 454 Sequencing Analyze Exon sequences Courtesy of R.A. Gibbs 27

28 GBM (Glioblastoma multiforme): Somatic mutations (Shared 20 genes, 84 tumors; orthogonal validation pending) Samples *Indels included ASXL1 BMPR1A CDK4 CDK6 CDKN2A CDKN2B CHIC2 CYP27B1 EGFR FBXW7 FGFR1 KIT LRRN2 MDM4 MET PDGFRA Pink: 1 mutation Red: 2 mutations PLAG1 PTEN RB1 TP53 28

29 Studio del trascrittoma e ricerca di splicing alternativi Può essere usato per il sequenziamento massivo del trascrittoma, da cui dedurre la frequenza delle sequenze e quindi gli splicing alternativi

30 Analisi Metagenomica: una autostrada per la conoscenza di batteri che non sopravvivono in coltura. 30

31 Sequenziamento del tratto nucleotidico delle immunoglobuline (Ig) relativo al riarrangiamento della regione variabile CDR3, specifica di ogni clone tumorale: - da utilizzare nell analisi in neoplasie linfoidi di tipo B; - per il monitoraggio della malattia minima residua; - come base per la produzione di vaccini anti-idiotipici paziente-specifici.

32 HIV Software allinea sequenza con WT Rileva Mutazioni Singole o combinazioni di mutazioni in grado di dare resistenza ai farmaci Accesso a Banca Dati

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34 Monitoring Changes in Genomic DNA Identify mutations Examine genomic instability such as in certain cancers and tumors (gene amplifications, translocations, deletions) Identify polymorphisms (SNPs) Diagnosis: chips have been designed to detect mutations in p53, HIV, and the breast cancer gene BRCA-1 Analizzare gli elementi che controllano l espressione genica

35 Applications in Drug Discovery Drug Discovery Identify appropriate molecular targets for therapeutic intervention (small molecule / proteins) Monitor changes in gene expression in response to drug treatments (up / down regulation) Analyze patient populations (SNPs) and response Targeted Drug Treatment Pharmacogenomics: individualized treatments Choosing drugs with the least probable side effects