APPLICAZIONE DELLA TECNICA MLPA NELLA DIAGNOSI MOLECOLARE DELLA SINDROME DI COHEN E DELLA SINDROME DI ALPORT X-LEGATA

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1 Università degli Studi di Siena Facoltà di Medicina e Chirurgia Scuola di Specializzazione in Genetica Medica Indirizzo tecnico APPLICAZIONE DELLA TECNICA MLPA NELLA DIAGNOSI MOLECOLARE DELLA SINDROME DI COHEN E DELLA SINDROME DI ALPORT X-LEGATA Relatore: Chiar.ma Prof.ssa ALESSANDRA RENIERI Tesi di Specializzazione di: Dott.ssa FRANCESCA SCIONTI Anno Accademico

2 INDICE 1. INTRODUZIONE La Sindrome di Cohen Diagnosi clinica Il gene COH Spettro mutazionale del gene COH Analisi molecolare del gene COH La Sindrome di Alport Diagnosi clinica Patogenesi Mutazioni del gene COL4A5 nella sindrome di Alport X-legata MARETIALI E METODI Pazienti Estrazione del DNA Multiplex ligation-dependent probe amplification Ricerca di delezioni/duplicazioni nel gene COH Ricerca di delezioni/duplicazioni nel gene COL4A Real-Time PCR 27

3 3. RISULTATI Delezioni/duplicazioni nel gene COH1: High frequency of COH1 intragenic deletions and duplications detected by MLPA in patients with Cohen syndrome (Parri et al, Eur J Hum Genet Oct;18(10): Epub 2010 May 12) Delezioni/duplicazioni nel gene COL4A Caso Caso Caso Discussione PROSPETTIVE FUTURE Next Generation Sequencing Piattaforme NGS Third generation sequencing Applicazione della tecnologia NGS alla diagnostica molecolare APPENDICE BIBLIOGRAFIA 71

4 Introduzione 1. INTRODUZIONE 3

5 Introduzione 1. La sindrome di Cohen La sindrome di Cohen (OMIM# ) è una malattia autosomica recessiva associata ad un fenotipo complesso, descritta per la prima volta nel 1973 da Cohen in una coppia di fratelli e in un paziente non imparentato che presentavano ipotonia, obesità, incisivi superiori prominenti e ritardo mentale (Cohen et al., 1973). Da allora sono stati riportati in letteratura circa 150 casi, 35 dei quali provenienti dalla sola Finlandia (Kivitie-Kallio and Norio 2001, Kolhemainen 2004), dove la sindrome di Cohen presenta una considerevole omogeneità fenotipica (Norio et al, 2003). Al contrario, nei pazienti non Finlandesi affetti da sindrome di Cohen il fenotipo clinico è più variabile. (Kondo et al, 1990; Kivitie- Kallio and Norio, 2001; Chandler and Clayton-Smith, 2003; Kolehmainen et al, 2004; Hennies et al, 2004; Seifert et al, 2006; Katzaki et al 2007). L identificazione nel 2003 del gene COH1 come il gene responsabile della sindrome di Cohen (Kolehmainen et al, 2003) ha messo in evidenza che lo spettro fenotipico nei pazienti finlandesi è molto omogeneo a causa di un forte effetto fondatore, infatti l analisi molecolare del gene COH1 ha evidenziato la presenza di una mutazione ancestrale responsabile della maggior parte dei casi (Hennies et al. 2004). 1.1 Diagnosi clinica Dallo studio di una coorte di 29 pazienti finlandesi Kivitie-Kallio e Norio individuarono cinque principali tratti caratteristici della sindrome: 1) ritardo mentale non progressivo, goffaggine e microcefalia; 2) tratti facciali caratteristici tra cui rime palpebrali rivolte verso il basso, filtro corto, capelli folti e attaccatura bassa dei capelli; 3) ipotonia infantile e iperlassità articolare; 4) retinopatia e miopia in individui di età maggiore ai 5 anni; 5) neutropenia isolata. 4

6 Introduzione Chandler e collaboratori in uno studio condotto nel Regno Unito (Chandler et al, 2002b, 2003) riscontrarono che solo il 24% dei pazienti analizzati poteva essere considerato affetto da sindrome di Cohen in accordo con i criteri diagnostici in uso. In particolare era difficile confermare la diagnosi di sindrome di Cohen nei pazienti di età inferiore ai 5 anni in cui ancora non era presente la distrofia corioretinica o nei pazienti con un background genetico molto eterogeneo. Per tale motivo suggerirono che in un bambino con notevole difficoltà di apprendimento dovevano essere presenti almeno due dei seguenti criteri: 1. Tratti facciali caratterizzati da: capelli, sopracciglia e ciglia folte rime palpebrali rivolte verso il basso naso prominente a forma di becco filtro corto con un espressione di smorfia sorridente 2. Miopia progressiva e retinopatia pigmentosa 3. Neutropenia (conta leucocitaria inferiore a 2 x 10-9 /mm 3 ) La valutazione di soggetti con mutazione del gene COH1 appartenenti a diversi gruppi etnici ha rivelato che nonostante alcune caratteristiche del viso siano presenti in diversi gruppi etnici, la facial gestalt non è un indicatore affidabile per diagnosticare la sindrome di Cohen (Falk et al 2004). Per rendere più agevole l identificazione e la classificazione dei pazienti con sospetto di sindrome di Cohen, Kolehmainen propose i seguenti 8 criteri diagnostici (Kolehmainen et al, 2004, Figura 1) ritardo mentale microcefalia caratteristiche facciali tipiche obesità truncale con estremità affusolate 5

7 Introduzione comportamento socievole distrofia corioretinica neutropenia Figura 1. Fenotipo della sindrome di Cohen: A Mani con dita affusolate; B Caratteristiche facciali; D Obesità troncale e estremità snelle; E distrofia retinica (da Kolehmainen et al, 2004). Nei pazienti che soddisfano almeno 6 di questi criteri, il sospetto clinico di sindrome di Cohen è da considerarsi fondato. I pazienti che soddisfano un numero minore di criteri vengono invece classificati come Cohen-like. Utilizzando i criteri sovradescritti, Kolehmainen identificò 22 diverse mutazioni del gene COH1 in pazienti clinicamente inquadrati come true Cohen syndrome. Per contro, non vennero identificate mutazioni del gene COH1 in soggetti clinicamente inquadrati come Cohen-like syndrome. 6

8 Introduzione L ampio spettro clinico della sindrome di Cohen e la difficoltà di definire dei criteri diagnostici è stata confermata da Seifert (Seifert et al., 2006) in uno studio condotto su 24 pazienti di diversa etnia e di età compresa tra i 2 e i 60 anni. Nei 24 pazienti furono identificate 25 differenti mutazioni del gene COH1. Il tipico facial gestalt è stato osservato in 23/24 individui. La miopia precoce era presente in tutti gli individui di età superiore ai 5 anni (14/14) mentre la retinopatia pigmentaria diffusa è stata riscontrata in 12/14 pazienti. I parametri di crescita e di sviluppo variavano significativamente. Stessa variabilità fenotipica è stata osservata in altri studi condotti in Italia, Grecia e Olanda (Katzaki et al 2007, Bugiani et al 2008, Peeters et al 2008). 1.2 Il gene COH1 Nel 2003, Kolehmainen et al., identificarono e caratterizzarono un nuovo gene, chiamato COH1 (VPS13B, OMIM#607817), mutato in pazienti con Sindrome di Cohen (Falk et al, 2004; Hennies et al, 2004; Kolehmainen et al, 2003; Mochida et al, 2004; Seifert et al, 2006). Il gene COH1 è localizzato sul braccio lungo del cromosoma 8 (8q22), si estende per 864 kb ed è costituito da 62 esoni. Il trascritto full-length è di bp e la corrispondente ORF (open reading frame) codifica una proteina di 4022 amminoacidi. Il gene COH1 mostra una forte omologia con la proteina VPS13 di Saccharomyces cerevisiae, di cui sono state identificate due varianti principali, 1A e 2A, e diverse altre isoforme generate per exon skipping o attraverso l impiego di esoni alternativi. Le varianti 1A e 2A contengono entrambe gli esoni dall 1 al 27 e dal 29 al 62, ma l isoforma 1A include l esone 28 a differenza dell isoforma 2A che include l esone 28b. La variante 1A dà origine alla proteina 7

9 Introduzione costituita da aminoacidi, mentre la variante 2A codifica per una proteina di 3997 aminoacidi (Velayos-Baeza et al, 2004). Nell uomo questo gene sembra avere un complicato pattern di splicing alternativo che porta a cinque isoforme diverse espresse in vari tessuti sia a livello fetale che nell adulto. Sono stati identificati due trascritti di circa 2 e 5 kb in tutti i tessuti adulti analizzati e in tessuti fetali quali cervello, polmone, fegato e rene; un trascritto più lungo, di kb è invece presente solo nell adulto ed è altamente espresso in prostata, testicolo, ovaie e colon, mentre l espressione risulta bassa nel tessuto nervoso (Figura 2). Questa varietà di trascritti potrebbe suggerire differenti funzioni proteiche tessuto-specifiche (Kolehmainen et al, 2003). Inizialmente si riteneva che il trascritto di maggiori dimensioni codificasse per una proteina transmembrana fornita di una sequenza di indirizzamento vacuolare, una sequenza segnale al C-terminale per la permanenza nel reticolo endoplasmatico e due sequenze consensus di indirizzamento verso la matrice dei perossisomi (Kolehmainen et al, 2003). Recentemente Seifert e collaboratori hanno dimostrato che il trascritto del gene COH1 in realtà è una proteina periferica di membrana dell apparato di Golgi, colocalizzata con la proteina GM130 nel compartimento cis. La proteina sembra coinvolta nel mantenimento dell integrità del complesso vacuolare, infatti la deplezione della stessa indotta tramite RNAi determina la frammentazione dell apparato di Golgi (Seifert et al, 2011). Rimane, tuttavia, ancora da chiarire il meccanismo patogenetico alla base del complesso fenotipo della sindrome di Cohen. 8

10 Introduzione Figura 2 Struttra del gene COH1 e schematica rappresentazione dello splicing alternativo (da Kolehmainen et al, 2003). Il trascritto COH1 è costituito da nt che coprono una regione di 864bp ed è trascritto da 62 esoni (riquadri colorati). Il trascritto più lungo, comprendente gli esoni 8,17,28 e 31, presenta una ORF di bp. La presenza dell esone 28b al posto dell esone 28 risulta in un trascritto più corto di 75 kb. L isoforma contenente sia l esone 28 che l esone 28b presenta una ORF di 4281 bp, mentre lo splicing alternativo degli esoni 17b e 8b risulta in una ORF rispettivamente di 2589 bp e di 1236 bp. 9

11 Introduzione 1.3 Spettro mutazionale del gene COH1 Ad oggi sono state riportate più di 150 mutazioni del gene COH1 in pazienti affetti da sindrome di Cohen di diversa origine etnica. Si tratta per lo più di mutazioni non senso e framshift, mentre le mutazioni missenso sono meno ricorrenti. Nei pazienti Finlandesi, dove il fenotipo clinico è altamente omogeneo, l analisi molecolare del gene COH1 ha rilevato, oltre a mutazioni sparse nell intera lunghezza del gene, una mutazione ricorrente (c.3348_3349delct; p.c1117fs1124x) nell esone 23 (Kolehmainen et al, 2003), probabilmente dovuta ad un effetto fondatore (Hennies et al, 2004) considerando l isolamento geografico della suddetta popolazione. In due comunità Amish dove i casi di matrimoni tra consanguinei sono molto frequenti, sono stati descritti 8 pazienti con sindrome di Cohen con fenotipo molto omogeneo. Tale circostanza ha fatto supporre che anche in questo caso la malattia fosse riconducibile ad una mutazione ricorrente dovuta ad un effetto fondatore. L analisi molecolare del gene COH1 ha infatti evidenziato, per tutti gli individui Amish affetti, la presenza di due mutazioni in eterozigosi composta: una mutazione frame-shift con inserzione di una timina nell esone 51 (c.9258_9259inst; p.k3086fs3105x) e una missenso nell esone 46 (c.8459t>c; p.i2820t) (Falk et al, 2004). Nel Database of Genomic Variants due studi riportano la presenza di CNVs (Copy Number Variations) nel gene COH1 (~ 6%) localizzate tra gli esoni 2-26, (Redon et al, 2006) e 9-19 (Sebat et al, 2004). E stato ipotizzato che alcune di queste CNV in realtà siano mutazioni eterozigoti in grado di causare la sindrome di Cohen se presenti in omozigosi o in eterozigosi composta. Ciò potrebbe spiegare la presenza di un solo o nessun allele mutato in alcuni pazienti con forte sospetto clinico di sindrome di Cohen (Balikova et al, 2009). 10

12 Introduzione Nel 2008 Bugiani e collaboratori analizzarono un gruppo di 14 pazienti provenienti da un isola dell arcipelago greco. Nell intera popolazione in studio venne riscontrato un fenotipo omogeneo tranne che per la microcefalia non sempre presente. L analisi molecolare del gene COH1 rilevò la presenza in tutti i pazienti di una delezione in omozigosi comprendente gli esoni Analisi molecolare del gene COH1 I metodi di indagine per la ricerca di mutazioni puntiformi nel gene COH1 si avvalgono dell utilizzo della tecnica DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Cromatography) e del sequenziamento diretto col metodo di Sanger. In circa il 70% dei pazienti affetti da sindrome di Cohen sono state individuate mutazioni su entrambi gli alleli, in omozigosi o in eterozigosi composta. Nel 30% dei casi è stata individuata una sola mutazione o nessuna (Kolehmainen et al, 2004; Seifert et al, 2008). Inizialmente la ricerca di delezioni/duplicazioni totali o parziali del gene COH1 veniva effettuata tramite Real-Time PCR (Katzaki et al, 2007). Tuttavia viste le notevoli dimensioni del gene e il costo delle sonde, l analisi era limitata solo ad alcuni esoni. Nel 2009 viene riportato in un lavoro pubblicato da Balikova e collaboratori, l utilizzo di un array Custom con circa 3148 sonde oligonucleotidiche disegnate all interno del locus del gene COH1 distribuite in una regione di 5Mb in grado di individuare CNVs con una risoluzione di circa 200 bp. Utilizzando questa strategia gli autori hanno individuato 7 delezioni (2 in omozigosi e 5 in eterozigosi) in un gruppo di 35 pazienti provenienti da 26 famiglie (Balikova et al, 2009). Tuttavia questa tecnica risulta costosa e non facilmente riproducibile nella pratica quotidiana di laboratorio. Nel 2002 è stata introdotta sul mercato la tecnica MLPA (multiplex ligationdependent probe amplification). Questa metodica permette di identificare 11

13 Introduzione delezioni/duplicazioni di numerose sequenze esoniche, applicabile allo screening di interi geni in un unica sessione sperimentale. Al fine di applicare questa tecnica all analisi molecolare del gene COH1 per la ricerca di CNVs, presso la UOC di Genetica Medica dell Università di Siena sono state messe a punto, in collaborazione con la MRC-Holland (Amsterdam, una serie di sonde specifiche per gli esoni del gene COH1, raggruppate in due distinti kits P321-A1 e P322-A1. 2. La sindrome di Alport La Sindrome di Alport (ATS) è una glomerulopatia a andamento progressivo eterogenea sia dal punto di vista clinico che genetico. E stata inizialmente descritta da Alport nel 1927 (Alport et al., 1927) come una malattia renale ereditaria caratterizzata da ematuria e sordità neurosensoriale. L associazione tra lesioni oculari e ematuria ereditaria è stata riconosciuta nel 1954 da Reyersbach e Butler (Reyersbach and Butler, 1954), mentre solo con l introduzione della microscopia elettronica è stata dimostrata la presenza di alterazioni ultrastrutturali della membrana basale glomerulare (MBG) nei pazienti affetti da ATS in tre studi indipendenti condotti nel 1972 e nel 1973 (Hinglais N et al., 1972; Spear GS et al., 1972; Churg J et al., 1973). La malattia presenta eterogeneità genetica (Pirson et al, 1999). Nel 1988 è stato identificato, mediante studi di linkage, il locus maggiore sul cromosoma X, e nel 1990 sono state identificate mutazioni a carico del gene COL4A5, localizzato in Xq22.3, codificante per la catena α5 del collagene tipo IV. Tale gene è responsabile della sindrome di Alport legata al cromosoma X presente in circa l 80% circa dei casi di ATS. Il quadro clinico è più grave nei maschi, dove conduce all insufficienza renale terminale (IRT) dai 15 ai 35 anni di vita (Kashtan et al, 1999, Jais et al, 2000) raramente dopo i 40. Nelle femmine 12

14 Introduzione l espressione clinica dipende dal grado di lyonizzazione e può variare dalla microematuria isolata e saltuaria, alla proteinuria, alla insufficienza renale cronica (IRC). Solo il 20% circa delle femmine affette raggiunge l IRT e sempre in età adulta. L ipoacusia neurosensoriale bilaterale progressiva e le manifestazioni oculari quali lenticono o le macchie perimaculari retiniche sono presenti solo nel 45-55% dei casi. Nel 1993 sono state individuate mutazioni a carico del gene COL4A3 oppure del gene COL4A4, localizzati sul cromosoma 2 (2q36-q37), in pazienti affetti dalla meno comune forma autosomica recessiva. Le forme autosomiche recessive rappresentano il 15-20% dei casi e sono caratterizzate da una progressione rapida verso l ITR in entrambi i sessi. Un individuo affetto da questa forma possiede due mutazioni in omozigosi o in eterozigosi composta del gene COL4A3 o COL4A4. Gli individui eterozigoti possono essere completamente asintomatici o presentare microematuria. Mutazioni a carico dei geni COL4A3 e COL4A4 sono state individuate, in eterozigosi, anche nella microematuria familiare benigna (BFH). L esistenza della forma autosomica dominante della ATS è stata ipotizzata per la prima volta nel 1976 ma è rimasta a lungo dibattuta. In questa forma la mutazione è presente in una sola copia del gene COL4A3 o COL4A Diagnosi clinica Il decorso clinico della malattia è caratterizzato da un lento e progressivo decadimento della funzione renale, fino all insufficienza renale cronica terminale (IRC). In base all età di insorgenza della IRC, la ATS viene divisa in due sottogruppi clinici. Nel tipo giovanile i maschi manifestano la IRC intorno ai 18 anni, mentre nel tipo adulto l età di insorgenza sale a 37 anni. Nel 1988 sono stati ridefiniti una serie di criteri clinici diagnostici, comprendenti: 13

15 Introduzione anamnesi familiare di macro/microematuria, insufficienza renale cronica o entrambe biopsia renale che mostri le tipiche alterazioni della membrana basale del glomerulo (ispessimento e/o sdoppiamento delle membrane basali glomerulari) caratteristiche alterazioni oculari (lenticono anterire/maculopatia) ipoacusia neurosensoriale progressiva per le alte frequenze La presenza di almeno tre di questi quattro criteri permette di definire un paziente affetto da sindrome di Alport (Flinter et al, 1988). Nel 1966 Gregory propose una revisione dei criteri diagnostici: storia familiare di nefrite o ematuria inspiegabile in un parente di primo grado del probando o in un maschio imparentato attraverso un qualsiasi numero di femmine ematuria persistente senza evidenza di altre possibili nefropatie ereditarie quali malattia delle membrane basali sottili, rene policistico, nefropatia da IgA ipoacusia neurosensoriale bilaterale tra i 2000 e gli 8000 Hz (l ipoacusia si sviluppa gradualmente e non si manifesta prima dei 30 anni) mutazione in uno dei tre geni COL4A3, COL4A4, COL4A5 evidenza immunoistochimica della perdita totale o parziale della catena α3(iv), α4(iv), α5(iv) nella membrana basale del glomerulo o dell epidermide o di entrambe alterazioni della MBG quali ispessimento, assottigliamento e sdoppiamento lesioni oculari quali lenticono anteriore, cataratta subcapsulare posteriore, distrofia polimorfa posteriore, macchie retiniche progressione graduale all IRC nel probando o in almeno due membri della famiglia macrotrombocitopenia o inclusioni granulocitiche 14

16 Introduzione diffusa leiomiomatosi dell esofago, genitali femminili o entrambi. Per fare diagnosi di ATS in una famiglia devono essere presenti almeno quattro dei criteri appena riportati nei membri stretti della famiglia, mentre per fare diagnosi di ATS in un individuo, la malattia deve essere presente nella famiglia in accordo con i criteri diagnostici precedentemente riportati. 2.2 Patogenesi L ATS è causata da difetti nella sintesi del collagene tipo IV. Il collageno tipo IV è il principale componente strutturale delle membrane basali e serve da impalcatura per il legame e l allineamento di altre macromolecole quali laminina, eparan solfato e nidogeno. E una proteina multimerica composta da tre catene dette α. Fino ad oggi sono state identificate nell uomo sei differenti catene α (α1- α6) di peso molecolare compreso tra KDa, codificate rispettivamente dai geni COL4A1-A6. La localizzazione di questi geni è in tre diversi cromosomi: COL4A1 e COL4A2 sul cromosoma 13 (13q34); COL4A3 e COL4A4 sul cromosoma 2 (2q35) e COL4A5 e COL4A6 sul cromosoma X (Xq22). I geni di ogni coppia sono disposti testa a testa e vengono trascritti da un promotore comune (Burbero et al, 1988). Questa tipica disposizione dei geni e la somiglianza tra le sequenze codificanti, hanno fatto presupporre che un gene ancestrale si sia duplicato dando origine ad una coppia di geni (α1 e α2) dalla quale sarebbero derivate altre duplicazioni su cromosomi differenti (Leinonen et al, 1994). Le catene α(iv) si associano a formare una tripla elica (protomero) e nel collagene di tipo IV sono possibili solo tre diverse combinazioni: α1α1α2, α3α4α5, α5α5α6 (Figura 3). In ogni catena α(iv) si possono individuare tre domini: 15

17 Introduzione dominio 7S a tripla elica all estremità N-terminale costituito da amminoacidi e ricco in cisteina e lisina dominio collagenico centrale a tripla elica di circa 1400 residui costituito dall unità tripeptidica ripetuta Gly-X-Pro oppure Gly-X-HyPro (dove X può essere qualsiasi altro amminoacido) dominio C-terminale non collagenico (NC1) costituito da circa 230 residui amminoacidici Figura 3 Rappresentazione schematica della localizzazione cromosomica, dell organizzazione genica, della produzione e dell assemblaggio delle sei isoforme delle catene α del collagene tipo IV. A COL4A1/COL4A2; B COL4A3/COL4A4; C COL4A5/COL4A6. Soltanto i residui di Gly si possono adattare alle giunzioni molto strette che si generano tra le catene α, mentre i residui di Pro consentono l arrotolamento stretto della catena polipeptidica del collagene. Una caratteristica del collagene di tipo IV è la presenza lungo il dominio a tripla elica di interruzioni, che non solo conferiscono flessibilità alla molecola ma servono per la formazione di legami crociati tra le catene α. 16

18 Introduzione E stato proposto un modello di assemblamento per l organizzazione del collagene IV in cui 4 molecole sono connesse attraverso il dominio 7S mediante ponti disolfuro e 2 molecole interagiscono testa a testa attraverso il dominio globulare NC1, formando delle maglie molecolari che costituiscono la struttura portante della membrana basale. L associazione delle molecole resta stabile attraverso ponti disolfuro intramolecolari tra le estremità N-terminale e C- terminale (Khoshnoodi et al, 2008). Le catene α1 e α2 sono presenti in tutte le membrane basali; mutazioni nei loro geni probabilmente sono letali per l embrione. Al contrario le catene α3-α6 sono espresse selettivamente nelle membrane basali di alcuni tessuti, inclusi quelli potenzialmente coinvolti nella ATS, cioè rene, coclea ed occhio, tali da spiegare la sintomatologia extra-renale nella ATS. L analisi al microscopio elettronico della biopsia renale nella ATS evidenzia anomalie tipiche della MBG, che sono rappresentate da spessore variabile, in quanto si riscontrano aree di ispessimento alternate ad aree di assottigliamento, slaminamento ed interruzioni (Figura 4). Non tutti gli individui affetti da ATS, comunque, presentano tutte queste caratteristiche (ad esempio in fase iniziale può essere presente solo un assottigliamento della membrana basale). Figura 4. A) Ispessimento e rottura della MBG che presenta margini festonati ; B) irregolare ispessimento della MBG; C) diffuso assottigliamento della MBG 17

19 Introduzione 2.3 Mutazioni del gene COL4A5 nella sindrome di Alport legata al cromosoma X La sindrome di Alport legata al cromosoma X (ATS-XL) è dovuta a mutazioni nel gene COL4A5 (Xq22.3). Questo gene ha una dimensione di circa 250 kb e contiene 51 esoni, che codificano per un trascritto di circa 6,5 kb. La catena proteica α5 è costituita da 1685 amminoacidi. Fino ad oggi sono state trovate più di 400 mutazioni nel gene COL4A5 (http://www.arup.utah.edu/database/alport/alport_welcome.php). Si tratta per lo più di mutazioni missenso in cui l amminoacido coinvolto è quasi sempre la Gly presente all interno della sequenza ripetuta Gly-Xaa-Yaa. La sostituzione della Gly impedisce un corretto avvolgimento della catena α5 durante la formazione del network α3α4α5. Mutazioni non senso, di splicing e framshift sono state largamente riportate in letteratura come anche grosse delezioni e duplicazioni. Nell insieme si può osservare che indipendentemente dal tipo di mutazione, non è possibile riscontrare nel gene COL4A5 la presenza di hot spots ( Figura 5) Figura 5 Sprettro mutazionale del gene COL4A5 Nella letteratura sono stati riportati più di 60 riarrangiamenti del gene COL4A5. Le grandi delezioni possono interessare un singolo esone come l intero 18

20 Introduzione gene. Rappresentano circa l 1-16% delle mutazioni nella ATS-XL (Plant et al, 1999; Antignac et al, 1992; Saito et al, 1994; Lemmink et al; 1997; Bekheirnia et al, 2010; Uliana et al, 2011). Le delezioni che si estendono dall estremità 5 terminale dei geni COL4A5 e COL4A6 sono responsabile di una rara forma di associazione tra ATS e leiomiomatosi diffusa (DL). Il breakpoint della delezione è spesso localizzato nell introne 2 del gene COL4A6 (Zhou et al, 1993). Meno frequenti sono le duplicazioni (Arrondel et al, 2004). Per quanto riguarda la correlazione genotipo-fenotipo sembra che le mutazioni che portano alla produzione di una proteina tronca (non senso e framshift) o alla sua totale mancanza (delezioni), causino una progressione più rapida verso l insufficienza renale, che si verificherebbe nel 90% di questi casi entro i 30 anni (forma giovanile). Tale percentuale sarebbe del 70% per i pazienti con produzione di una proteina riarrangiata (alterazioni dei siti di splicing) e si ridurrebbe del 50% per quelli con una mutazione missenso (forma adulta) (Renieri et al, 1995; Jais et al, 2000). Inoltre la presenza nella stessa famiglia di forme giovanili e adulte di ATS indicherebbe che non è solo la specifica mutazione e determinare l espressione fenotipica (Knebelmann et al, 1992; Renieri et al, 1994b). La prognosi nelle femmine eterozigoti è decisamente migliore, con un rischio di sviluppare IRT prima dei 40 anni che si aggira intorno ai 12%, rischio che tuttavia aumenta fino al 30% se considerato a 60 anni. E comunque importante sottolineare che in generale la ATS-XL è caratterizzata da una notevole eterogeneità intrafamiliare del quadro clinico delle femmine dovuta al diverso grado di lyonizzazione. La ricerca di piccole mutazioni viene tradizionalmente condotta attraverso l uso combinato della metodica DHPLC e del sequenziamento diretto tramite il metodo Sanger, con una mutation detection rate compresa tra 70-80%. Tuttavia l elevato numero di esoni da analizzare e l assenza di hot spots rendono l analisi molecolare del gene COL4A5 lunga (non meno di 6-12 mesi) e indaginosa. 19

21 Introduzione Mutazioni criptiche di splicing e grossi riarrangiamenti possono tuttavia non essere rilevate dai metodi di indagine cosiddetti exon-by-exon. L analisi dell mrna (nel caso delle mutazioni di splicing) e l utilizzo della tecnica MPLA (nel caso dei grossi riarrangiamenti) risultano più efficaci (Hertz et al). 20

22 Materiali e metodi 2. MATERIALI E METODI 21

23 Materiali e metodi 2.1 Pazienti I pazienti riportati in questo lavoro comprendono 14 pazienti con sospetto clinico di Sindrome di Cohen in accordo con i criteri diagnostici di Kolehmainen del 2004, di età compresa tra 18 mesi e 52 anni e 10 pazienti con sospetto clinico di Sindrome di Alport di età compresa tra 8 e 48 anni. Tutti i pazienti si sono resi disponibili nell eseguire questo tipo di studio previa compilazione di un consenso informato. L analisi molecolare sia del gene COH1 che del gene COL4A5 è stata inizialmente condotta tramite DHPLC. In 2 dei 14 pazienti con sospetto clinico di Sindrome di Cohen sono stati individuati due alleli mutati in eterozigosi composta, in 9 un solo allele mutato e nei restanti 3 pazienti nessun allele mutato. Nei 10 pazienti con sospetto clinico di Sindrome di Alport l analisi al DHPLC non ha rilevato alcuna mutazione nel gene COL4A Estrazione del DNA L estrazione di DNA genomico è stata effettuata a partire da un prelievo di sangue periferico in EDTA utilizzando il QIAamp DNA Blood Maxi Kit (QIAGEN) secondo il seguente protocollo: Trasferire 5 ml di sangue in una falcon da 50 ml Aggiungere 500 µl di proteasi Aggiungere 6 ml di Buffer AL, miscelare per inversione 15 volte e vortexare Mettere le provette in bagnomaria per 10 minuti Aggiungere 5 ml di etanolo assoluto, miscelare per inversione 10 volte e vortexare Trasferire il lisato su colonna e centrifugare 3 minuti a 3000 rpm 22

24 Materiali e metodi Scartare l eluato e caricare sulla colonna 5 ml di Buffer AW1. Centrifugare 1 minuto a 5000 rpm Scartare l eluato e caricare sulla colonna 5 ml di Buffer AW2. Centrifugare 15 minuti a 5000 rpm Mettere la colonna in una nuova provetta e caricare 600 µl di acqua MillyQ. Attendere 5 minuti e centrifugare 2 minuti a 5000 rpm Ricaricare l eluato, attendere 5 minuti e centrifugare 5 minuti a 5000 rpm Trasferire i campioni di DNA ottenuto in provette da 1,5 ml La concentrazione del DNA è stata determinata tramite lo spettrofotometro GENEQUANTpro (Amersham Pharmacia Biotech) utilizzando una diluizione 1/20 (5 µl di DNA in 95 µl di acqua MillyQ). 2.3 Multiplex ligation-dependent probe amplification La Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) è una tecnica rapida e sensibile che permette di quantificare il numero di copie di oltre 50 sequenze di DNA o RNA in una unica reazione di PCR utilizzando una sola coppia di primers (Schouten et al., 2002). Il metodo utilizza due sonde oligonucleotidiche per ciascun target di interesse. Queste sono costruite in modo tale da essere contigue alla regione nucleotidica da analizzare e contengono all estremità 3 e 5 sequenze che funzionano da primer (sequenza X e sequenza Y), uguali per tutte le sonde in esame. Uno dei due primer è coniugato con un marcatore fluorescente; inoltre una delle sonde contiene una sequenza di lunghezza variabile (stuffer) per l analisi contemporanea di più target, ciò permette di discriminare sequenze che differiscono anche per un solo nucleotide. La peculiarità dell MLPA risiede nel fatto che non i campioni genomici bensì le 23

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