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1 Original article Genomic restriction fragment length polymorphism typing of human platelet-specific antigens in blood donors from southern Italy and in alloimmunised pregnancies Giorgio Fratellanza 1, Nicola Scarpato 1, Elio D Agostino 1, Marcello D Onofrio 1, Saverio Misso 2, Annagrazia Fratellanza 3, Salvatore Formisano 1, Valentino De Stefano 4 1 Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, AUOP Federico II, Napoli, Italia 2 Immunoematologia e Medicina Trasfusionale Ospedale San Sebastiano (CE), Italia 3 Dipartimento di Pediatria, AUOP Federico II, Napoli, Italia 4 Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale, Ospedale San Luca, Vallo della Lucania (SA) Genotyping of human platelet antigens is now easily and quickly carried out by the polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCR- RFLP) and by sequence-specific primers (PCR-SSP). The gene frequencies of HPA-1, -2, -3, -4, -5, and -6 were determined in this study by the PCR-RFLP technique in 200 consecutive blood donors referred to our Immunohaematology and Transfusion Service and in parents of 12 neonates affected by foetal-neonatal alloimmune thrombocytopenic purpura (FNAITP) at birth. DNA was isolated from peripheral blood mononuclear leucocytes and specific fragments were amplified by PCR. The fragments were analysed using allele-specific restriction enzymes. Out of 200 genomic DNA samples tested, 50 were tested again with direct sequencing as well as with PCR SSP analysis, to validate our results. Platelet-specific alloantibodies are implicated in FNAITP, post-transfusion purpura and refractoriness to platelet transfusion therapy. We have successfully used our HPA genetic bank for compatible platelet transfusions in neonates affected by FNAITP and in alloimmunised patients. Introduction The di-allelic human platelet antigens (HPA) are located on several platelet membrane glycoproteins (Gp): Gp IIIa Received: 8 August Revision accepted: 12 September 2005 Correspondence: Dott. Giorgio Fratellanza Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale AUOP Federico II Via Pansini Napoli, Italia Introduzione Gli antigeni specifici dei sistemi diallelici HPA (Human Platelet Antigens), trovano collocazione su numerose glicoproteine (Gps) della membrana delle piastrine: più precisamente, sulla Gp IIIa si collocano i sistemi HPA-1, -4, -6, -7, -8; sulla Gp Ib il sistema HPA-2, sulla Gp IIb quello HPA-3, sulla Gp Ia l'hpa-5, sulla Gp V il Nak 1, mentre l'hpa 15 è sistemato sulla proteina CD109. Tutte le caratteristiche HPA sono determinate da una singola sostituzione in una coppia di basi, il che porta alla differenza di un solo amminoacido nella Gp pertinente 2. Gli antigeni HPA rappresentano il bersaglio degli anticorpi (Ab) specifici che determinano lisi piastrinica nella piastrinopenia fetoneonatale alloimmune (FNAITP, Foetal-Neonatal AlloImmune Thrombocytopenic Purpura) e nella porpora post-trasfusionale (PTP, Post-Transfusion Purpura) e contribuiscono all'instaurarsi della refrattarietà piastrinica (PTR) nei pazienti ripetutamente trasfusi 3. I progressi ottenuti sulle conoscenze relative alle basi molecolari e genetiche degli antigeni HPA, permettono ora di condurre, su DNA genomico, tipizzazioni degli alleli che codificano per gli epitopi antigenici piastrinici 1. Sono stati descritti numerosi metodi di tipizzazione basati sui polimorfismi delle sequenze nucleotidiche, come la PCR (Polymerase Chain Reaction), l'aso (Allele Specific Oligonucleotide probe) 4, la PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Lenght Polymorphism) 5, la PCR-SSP (PCR-Sequenze Specific Primer) 6-8 e la PCR-SSCP (PCR-Single Strand Conformation Polymorphism) 9. Scopo di questo studio è stato quello di genotipizzare, con PCR-RFLP, un numero significativo di donatori per i sistemi HPA-1, -2, -3, -4, -5 e 6 al fine di ottenere un più ampio e completo pannello di donatori, utile per l'identificazione di Ab antipiastrine e per un supporto trasfusionale mirato. 222

2 HPA genotyping in southern Italy (HPA-1, -4, -6, -7, -8), Gp Ib (HPA-2), Gp IIb (HPA-3), Gp Ia (HPA-5), and Gp V (Nak) 1 while HPA-15 is located on the platelet membrane protein CD109. All of the HPA are determined by a single base-pair substitution that leads to a single amino acid difference in the relevant glycoprotein 2. HPA are the target of platelet alloantibodies that mediate platelet destruction in foetal-neonatal alloimmune thrombocytopenic purpura (FNAITP) and post-transfusion purpura, and contribute to platelet transfusion refractoriness in multitransfused patients 3. In accordance with advances in the understanding of the molecular and genetic bases of platelet alloantigens, it is now possible to genotype individuals for the alleles coding for the epitopes of platelet antigens using genomic DNA 1. Based on nucleotide sequence polymorphisms, several DNA-based typing methods such as polymerase chain reaction (PCR), allele-specific oligonucleotide (ASO) probes 4, PCR restriction fragment length polymorphism (RFLP) 5, PCR-sequence specific primer (SSP) 6-8 and PCRsingle strand conformation polymorphism (SSCP) 9 methods have been reported. The aim of this study was to genotype a significant number of donors for HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4, HPA- 5, HPA-6 by PCR-RFLP in order to obtain a wider and more complete panel for both antibody identification and urgent donation. Materials and methods Subjects We typed 200 consecutive blood donors referred to our Centre and parents of 12 neonates affected by FNAITP at birth. Genetic characterisation Genomic DNA was purified from leucocytes using the DNAzol Reagent (GIBCO BRL Life Technologies, Eggenstein, Germany) 10 : blood samples were mixed with DNAzol and DNA precipitated with isopropanol from the resulting lysate. The DNA pellet was washed successively with DNAzol and ethanol, and solubilised. Selected oligonucleotide primers were used to amplify those parts of the genomic DNA that contain the polymorphic sequences corresponding to the HPA-1,- 2,- 3, -4, -5, and -6 alleles. The sequences and genomic positions of the oligonucleotide primers used for the PCR are shown in Materiali e metodi Soggetti Abbiamo tipizzato 200 donatori che si sono presentati consecutivamente al nostro Centro e i genitori di 12 neonati affetti da FNAITP alla nascita. Caratterizzazione genetica Il DNA genomico è stato purificato dai leucociti con reagente DNA-zol (GIBCO BRL Life Technologies, Eggenstein, Germania) 10 : i campioni di sangue sono stati mescolati al DNAzol e il DNA dal lisato ottenuto è stato precipitato con isopropanolo. Il pellet contenente DNA è stato successivamente lavato con DNAzol ed etanolo e solubilizzato. Sono stati utilizzati primers oligonucleotidici selezionati per amplificare quelle parti di DNA note per contenere le sequenze polimorfiche relative agli alleli HPA- 1, -2, e -6, rispettivamente. Le sequenze e la posizione sul DNA dei primers utilizzati sono riportate in tabella I. La PCR è stata condotta secondo il protocollo illustrato nelle tabelle II e III. La posizione degli enzimi di restrizione sul prodotto della PCR (relativamente alle coppie di basi), nonché la lunghezza del frammento ottenuto dopo digestione con Nc1 (per HPA 1), con Fok 1 (per HPA 3) e con Mnl 1 (per HPA 5), sono schematicamente illustrate nella figura 1. Dopo amplificazione, i prodotti della PCR sono stati digeriti con enzimi di restrizione nelle condizioni riassunte in tabella IV. I prodotti della restrizione sono, poi, stati sottoposti a gelelettroforesi (gel di agarosio al 3% per 120' a Volt in buffer Tris-Acetato-EDTA). I frammenti di DNA sono stati visualizzati in gel elettroforesi orizzontale, utilizzando un marcatore del peso molecolare per la valutazione dei risultati. L'individuazione dei frammenti di DNA è stata ottenuta a luce UV. L'analisi PCR-SSP è stata eseguita secondo il protocollo di lavoro del Domino Protrans HPA System (Nuclear Laser, Settala, MI, Italia). Per confermare i risultati, 50 dei 200 campioni relativi ai donatori sono stati ulteriormente esaminati in PCR-SSP. Risultati In tabella V sono riportate le frequenze geniche e antigeniche dei sistema HPA-1, -2, -3, -4, -5, -6 relative ai donatori di sangue. I risultati delle 12 coppie di genitori dei neonati hanno dimostrato incompatibilità soltanto nell'ambito del sistema HPA-1. Tale incompatibilità è 223

3 G Fratellanza et al. Table I - Sequences of the specific primers used for PCR and their genomic position on DNA PrimerSequence DNA HPA-1(s) 5 -CTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAG HPA-1(a) 5 -GTGCAATCCTCTGGGACTGACTTG HPA-2(s) 5 -CCTTCAACCGGCTGACCTCGCTGCC HPA-2(a) 5 -TTCAGCATTGTCCTGCAGCCAGC HPA-3(s) 5 -CTCAAGGTAAGAGCTGTGAAGAAGAC HPA-3(a) 5 -CTCACTACGAGAAGGATCCTGAACCTC HPA-4(s) 5 -TACCAAGCTGGCCACCCAGATT HPA-4(a) 5 -CCAAACAGGGAGACCAAGGTAGAA HPA-5(s) 5 -GTGACCTAAAGAAAGAGG HPA-5(a) 5 -CTCTCATGGAAAATGGCAG HPA- 6 (s) 5 - CTGGCTGGCTGGGATCCCAGTG- 3 HPA- 6 (a) 5 - CCCTGCAGTTCTCCTCACCTGAG- 3 Table II - PCR protocol: master mix Master mix HPA-1 HPA-2 HPA-3 HPA-4 HPA-5 HPA-6 Buffer 2µL 2µL 2µL 2µL 2µL 2µL W1(5%) 1µL 1µL 1µL 1µL 1µL 1µL DNTPs (10µM) 0.8µL 0.8µL 0.8µL 0.8µL 0.8µL 0.8µL Forward 1µL 1µL 1µL 1µL 0.8µL 0.8µL Reverse 1µL 1µL 1µL 1µL 0.8µL 0.8µL MgCl 2 0.6µL 0.4µL 0.4µL 0.4µL 0.4µL 0.4µL TAQ 0.08µL 0.08µL 0.08µL 0.08µL 0.08µL 0.08µL H µL 13.72µL 13.72µL 13.72µL 14.12µL 14.12µL Table III - PCR protocol: amplification cycles (temperature, time, number of cycles) Cycles HPA-1 HPA-2 HPA-3 HPA-4 HPA-5 HPA-6 Denaturation 95 C x 5 (1) 95 C x 5 (1) 95 C x 5 (1) 95 C x 5 (1) 95 C x 5 (1) 95 C x 5 (1) Denaturation 95 C x 30 (30) 95 C x 1 (35) 95 C x 1 (35) 95 C x 1 (30) 95 C x 55 (36) 95 C x 1 (28) Annealing 62 C x 15 (30) 68 C x 1 (35) 60 C x 1 (35) 60 C x 30 (30) 51 C x 55 (36) 70 C x 1 (28) Extension 72 C x120 (30) 72 C x 1 (35) 72 C x 1 (35) 72 C x 30 (30) 72 C x 30 (36) 72 C x 1 (28) End cycle 72 C x5 72 C x5 72 C x5 72 C x 5 72 C x 5 72 C x 5 Table IV - Restriction-enzymes used to digest the amplification products and restriction sequences Alloantigens Genes Site on cdna Aa. Restriction sequences Enzyme Undigested amplificate Alleles (bp) HPA-1 a GPIIIa 196: CTG 33:Leu CTGGG Nci I HPA-1 b CCG Pro CCGGG 77/170 HPA-2 a GPIb 524: ACG 145:Thr GACGTC BsaH I /242 HPA-2 b ATG Met GATGTC 353 HPA-3 a GPIIb 2622:ATC 843:Ile CATCC Fok I /127 HPA-3 b AGC Ser CAGCC 253 HPA-4 a GPIIIa 526: CGA 143:Arg TCGA Taq I /92/162 HPA-4 b CAA Gln TCAA 114/162 HPA-5 a GPIa 1648:GAG 505:Glu GAGG Mnl I 274 8/33/136/97 HPA-5 b AAG Lys AAGG 8/169/97 HPA-6 a GPIIIa 1564: CAG 489: Gln CGGA Mwa I HPA-6 b CGG Arg CAGG 75/

4 HPA genotyping in southern Italy HPA-1: Nci I (1U) 37 C over night HPA-1a: 247bp HPA-1b: bp HPA-1a HPA-1b 247bp Nci 1 CTGGG 247bp 77bp CCGGG 170bp Nci 1 HPA-3: Fok I (1U) 37 C over night HPA-3a: bp HPA-3b: 253 bp HPA-3a HPA-3b 253bp Fok 1 126bp CATCC 127bp Fok I 253bp CAGCC HPA-5: Mnl I (1U) 37 C over night HPA 5a: bp HPA 5b: bp HPA-5a HPA-5b 274bp Mnl 1 8bp 33bp 136bp GAGG 97bp Mnl I Mnl I Mnl I 8bp 169bp AAGG 97bp Mnl I Mnl I Figure 1 - Diagrammatic representation of the restriction site map of the PCR amplified fragments of HPA-1, HPA-3, HPA-5 generated after digestion. The arrows indicate the positions of the restriction enzyme sites table I. PCR was performed according to the protocol summarised in tables II and III. The position of the enzyme restriction sites on the bp PCR product and the length of the fragment generated after digestion by Nci I (HPA-1), Fok I (HPA-3) and Mnl I (HPA- 5) are schematically shown in figure 1. After amplification, the PCR products were digested with restriction enzymes under the conditions summarised in table IV. The restriction products were submitted to gel electrophoresis in a 3% agarose gel for 120 at Volt in TAE buffer. DNA fragments were responsabile delle gravi forme di FNAITP osservate nei 12 neonati ed è stata confermata dalla presenza di anticorpi lesivi nel siero materno (10 anti-hpa-1a e 2 anti-hpa-1b). La figura 2 mostra un esempio delle analisi PCR-SSP per i 6 sistemi HPA indagati. Discussione Ciascun sistema HPA consiste di 2 varianti alleliche, 225

5 G Fratellanza et al. Table V - HPA genotype and antigens frequencies in the studied population HPA Genotype Number of subjects Genotype Frequencies (%) HPA Antigens Antigen Frequency (%)Gene Frequency HPA-1 a/a % HPA-1 a 95.5% HPA-1 a/b % HPA-1 b/b 9 4.5% HPA-1 b" 28% HPA-2 a/a % HPA-2 a 97% HPA-2 a/b 48 24% HPA-2 b/b 6 3% HPA-2 b 26.5% HPA-3 a/a 92 46% HPA-3 a 85.5% HPA-3 a/b % HPA-3 b/b % HPA-3 b 54% HPA-4 a/a % HPA-4 a 100% HPA-4 a/b 1 0.5% HPA-4 b/b 0 0% HPA-4 b 0.5% HPA-5 a/a % HPA-5 a 99.5% HPA-5 a/b 30 15% HPA-5 b/b 1 0.5% HPA-5 b 15.5% HPA-6 a/a % HPA-6 a 100% HPA-6 a/b 1 0.5% HPA-6 b/b 0 0% HPA-6 b 0.5% Figure 2 - PCR-SSP agarose gel determination of HPA polymorphisms in six donors 226

6 HPA genotyping in southern Italy Table VI - Comparison of the frequency of HPA antigens in Caucasian populations and other populations HPA antigens Studied subjects Dutch USA Finn Japanese (Italians) population 11 white population 12 population 13 population 14,15 1a 95.5% 97.9% 98% 99% 100% 1b 28% 28.8% 20% 26.5% 0.3% 2a 97% 100% 97% 99% 99.2% 2b 26.5% 13.2% 15% 16.5% 19.7% 3a 85.5% 81% 88% 83.5% 85.1% 3b 54% 69.8% 54% 66.5% 66.2% 4a 100% 100% 100% 100% - 4b 0.5% 1% 1% 1% - 5a 99.5% 100% 98% 99.5% 99.0% 5b 15.5% 19.7% 21% 10% 7.0% 6a 100% % 99.7% 6b 0.5% - - < 1% 5.13% visualised horizontally using a molecular weight marker to enable evaluation of the results. The detection of DNA fragments was carried under UV light. The PCR-SSP analysis was performed according to the working protocol of Domino Protrans HPA System (Nuclear Laser, Settala, MI, Italy). Out of 200 genomic DNA donor samples tested, 50 were examined again with a direct sequencing as well as PCR SSP analysis, to validate our results. Results Genotypic and antigenic frequencies of HPA-1, -2, -3, - 4, -5, -6 in the analysed samples from blood donors are summarised in table V. Our results from 12 couples of parents of neonates born with a severe form of FNAITP showed incompatibility only for HPA-1 system. These incompatibilities were responsible for the FNAITP and confirmed by the presence of offending antibodies in maternal serum (10 anti-hpa-1a, 2 anti-hpa-1b). Figure 2 shows a diagrammatic example of PCR-SSP analysis of the HPA 1-6 systems. Discussion Each HPA system consists of two allelic variants, now known as a, high frequency, and b, low frequency. These allelic variants are caused by single point mutations, which result in single amino acid changes between the two different gene products. In our study the frequencies of the alleles in most of the HPA systems are comparable to those described by other authors for the European Caucasian population 11. In conosciute, rispettivamente, come "a", ad alta frequenza, e "b", a bassa frequenza. Le varianti sono causate da una sola mutazione puntiforme che determina un cambiamento in un singolo amminoacido in due diversi prodotti genici. Le frequenze per i più importanti sistemi HPA, ottenute nel nostro studio, sono paragonabili a quelle trovate da altri Autori nei caucasici europei 11. Al contrario, la frequenza dell'antigene HPA-1b è più alta nel nostro campione rispetto a quelle della popolazione bianca statunitense e della popolazione giapponese (Tabella VI) Tali dati avvalorano ulteriormente che la frequenza degli alleli HPA-4b e HAP-6b è, nei caucasici, molto bassa (<1%) e che i sistemi HPA-4 e HPA-6 sono polimorfici soltanto nelle popolazioni non caucasiche. Il protocollo PCR-RFLP descritto per la genotipizzazione del sistema HPA-4, impiegando un primer oligonucleotidico modificato, introduce un sito di restrizione Taq1 "artificioso", che consente la distinzione fra gli alleli HPA-4 e HPA-4b e che elude la scarsa disponibilità dell'enzima CVIR1, l'unico in grado di riconoscere un sito di restrizione naturale 11,16. In ogni sistema HPA, tutti i tre genotipi (a/a, a/b, b/b) sono stati perfettamente distinguibili e non si sono osservate discrepanze fra i risultati ottenuti in PCR-RFLP e quelli in PCR-SSP. I risultati di questo studio dimostrano chiaramente la capacità della PCR-RFLP di individuare i polimorfismi HPA. Il metodo di biologia molecolare RFLP è basato sulla PCR che permette l'arricchimento del campione e produce DNA bersaglio in quantità sufficiente per la caratterizzazione genica. Ciò risulta fattibile quando il sito polimorfico è situato all'interno di quello riconosciuto dall'enzima di restrizione. Per la nostra esperienza, è cruciale la concentrazione del DNA prima dell'amplificazione, giacché una bassa concentrazione determina deboli bande, che possono essere perse nell'analisi elettroforetica.di 227

7 G Fratellanza et al. contrast, the frequency of the HPA-1b antigen in our samples was higher than that in Japanese and white USA populations (Table VI) Our data further corroborate that the frequency of the less common HPA-4b and HPA-6b alleles is extremely low (<1%) in Caucasians and that the HPA-4 and HPA-6 systems are polymorphic only in non-caucasian populations. The PCR-RFLP protocol for HPA-4 system genotyping described, using a modified oligonucleotide primer, introduces an artificial Taq1 restriction site allowing the distinction between the HPA-4a and HPA-4b alleles and circumventing the poor availability of the CVIR1 enzyme (the only enzyme that recognises a common, naturally occurring restriction site) 11,16. In each HPA system, all three genotypes (a/a; a/b; b/ b) were clearly distinguished; no discrepancy was observed between the results obtained with PCR-RFLP and PCR- SSP. The results of the present study clearly demonstrate the ability of PCR-RFLP to detect HPA polymorphisms. The molecular biological RFLP detection method is based on a PCR, which enables enrichment of the sample and produces the target DNA in sufficient amounts for genetic characterisation to be achieved. This method is feasible when the polymorphic site is situated within a site recognised by a restriction enzyme. In our experience the DNA concentration prior to amplification is crucial: low DNA concentrations cause weak PCR product-bands that can be missed in gel analysis but DNA in high concentrations may be incompletely digested causing patterns that simulate a state of heterozygosity. PCR-RFLP methodology is a two-stage technique, which requires time and expertise. In contrast, PCR-SSP determines the HPA genotype in a single, rapid step. This technique relies on the fact that the Taq DNA polymerase used in the PCR is unable to repair single mismatches at the 3 end of DNA primers. DNA typing of platelet alloantigens gives an effective aid to the diagnosis and transfusion support of the patients with thrombocytopenia related to platelet alloantibodies (FNAITP, post-transfusion purpura, platelet transfusion refractoriness) 17,18. In all these cases, immunological diagnosis requires both the assessment of antibody specificity and the characterisation of the patients platelet antigens. Many different serological methods are now available to detect platelet antibodies while the phenotype HPA characterisation is limited by poor availability of specific well-characterised typing alloantisera and by the converso, alte concentrazioni di DNA possono produrre una digestione incompleta che favorisce patterns eterozigoti. La metodica PCR-RFLP e una tecnica a due fasi che richiede tempo ed esperienza. Quella PCR-SSP, invece, determina il genotipo HPA in una sola, rapida fase. Quest'ultima tecnica è basata sul fatto che la polimerasi Taq, impiegata nella PCR, è incapace di riparare singoli mismatches all'estremo 3' dei primers per il DNA. La tipizzazione DNA degli antigeni piastrinici offre un aiuto effettivo per la diagnosi e il supporto trasfusionale in pazienti affetti da trombocitopenie immuni, sostenute, cioè, da anticorpi (FNAITP, PTP, PTR) 17,18. In questi casi, la diagnosi richiede sia la identificazione della specificità anticorpale sia la tipizzazione HPA del paziente. Attualmente, sono disponibili vari metodi sierologici per evidenziare gli Ab anti-piastrinici, mentre la tipizzazione HPA viene limitata dalla scarsa disponibilità di antisieri tipizzanti validi e anche dal basso numero di piastrine che si possono ottenere da un paziente trombocitopenico. I sieri utili alla determinazione degli antigeni HPA sono rari e rinvenibili soltanto in laboratori specializzati. Per di più, in alcune situazioni cliniche, non sono disponibili piastrine per la tipizzazione sierologica, mentre qualsiasi materiale da cui sia possibile estrarre DNA è indicato per la genotipizzazione. Conclusioni I risultati da noi ottenuti confermano che nella popolazione caucasica i polimorfismi del sistema HPA-1 sono quelli più frequentemente coinvolti nella FNAITP. Inoltre, la frequenza, estremamente bassa, degli antigeni HPA-4b e HPA-6b implica che il rischio di PTR dovute ad anticorpi diretti contro questi due antigeni è veramente improbabile. L'immediata disponibilità di piastrine HPAgenotipizzate è utilissima sia per la diagnosi che per il supporto trasfusionale di pazienti affetti da trombocitopenie immuni 21. Riassunto Attualmente, la genotiopizzazione HPA (Human Platelet Antigens) è agevole e rapidamente eseguibile mediante PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Lenght Polymorphism) o con PCR-SSP (PCR- Sequence Specific Primers). In questo studio, sono state determinate le frequenze geniche dei sistemi HPA-1, -2, -3, 228

8 HPA genotyping in southern Italy low number of platelets that can be collected from thrombocytopenic patients. Reagents suitable for serologic HPA typing are rare and available only in specialised laboratories. Moreover, in some clinical situations, no platelets are available for alloantigen typing, while any material from which DNA can be extracted is suitable for genotyping. Conclusions Our results confirm that the HPA-1 polymorphism is the one most frequently involved in FNAITP in the Caucasian population 23,24. Furthermore, the extremely low frequency of HPA-4b and HPA-6b antigens implies that the risk of platelet transfusion refractoriness due to these two alloantigenic systems is very low. The prompt availability of HPA genotyped platelets is very useful for both diagnosis and transfusion support in patients with alloantibody-related thrombocytopenia , -5, -6 impiegando PCR-RFLP in 200 donatori di sangue, convenuti consecutivamente al nostro Servizio Ttrasfusionale e in entrambi i genitori di 12 neonati affetti da FNAITP (Foetal-Neonatal AlloImmune Thrombocytopenic Purpura). Il DNA è stato isolato da leucociti del sangue periferico e i frammentio specifici sono stati amplificati in PCR. L'analisi dei frammenti è stata condotta con enzimi di restrizione specifici. Per confermare i nostri risultati, 50 dei 200 campioni testati sono stati ulteriormente esaminati in PCR-SSP. Anticorpi specificamente diretti contro antigeni HPA sono responsabili della FNAIP, di Porpora Post-Trasfusionake e di refrattarietà alla terapia trasfusionale con concentrati piastrinici. Finora, abbiamo utilizzato, con successo, la nostra banca per trasfusioni HPA-compatibili in neonati affetti da FNAITP o in pazienti immunizzati. 229

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