VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi

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1 Atti del Convegno / Abstract Book VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases Bologna, Giugno / June, 2013 A cura di / Edited by Assunta Bertaccini

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3 Struttura Ospitante / Host University Alma Mater Studiorum - Università di Bologna Scuola di Agraria e Medicina veterinaria Vicepresidenza di Agraria Partners IPWG International Phytoplasmologist Working Group SIPaV Società Italiana di Patologia Vegetale SIROE Società Italiana per la Ricerca sugli Oli Essenziali L'ORTOFRUTTICOLA Albenga ADAMO CANEL S.A.S. Col San Martino - TV

4 Comitato Scientifico / Scientific Committee Alberto Alma Marina Barba Assunta Bertaccini Piero Attilio Bianco Maurizio Conti Caio Bruno Faraglia Ruggero Osler Gianfranco Romanazzi Comitato Organizzatore / Organizing Committee Maria Grazia Bellardi Assunta Bertaccini Enrico Biondi Lisa Cavicchi Nicoletta Contaldo Carla Lucchese Paola Minardi Samanta Paltrinieri Juan Fernando Mejia Stefano Ardizzi Alma Mater Studiorum - Università di Bologna Scuola di Agraria e Medicina veterinaria Vicepresidenza di Agraria Viale G. Fanin 46, Bologna, Italy

5 Petria 23 (1), (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi Presentazione Facendo seguito agli ormai tradizionali appuntamenti iniziati ad Udine quasi vent anni fa, il gruppo di studio sulle fitoplasmosi delle piante ha organizzato presso l Università di Bologna il "VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi" con lo scopo di aggiornare la comunità scientifica e gli operatori del settore sui vari aspetti delle problematiche legate a queste importanti malattie. Viene presentata come introduzione al convegno la coltivazione dei fitoplasmi in substrato axenico che potrà aprire la strada a ricerche nuove e più focalizzate in questo importante settore fitopatologico. Sono pervenute 36 comunicazioni che coprono i diversi aspetti del settore: nuove malattie e malattie da quarantena, trasmissione ed insetti vettori, interazione con gli ospiti, epidemiologia, controllo e diagnostica. Le tre giornate di lavori si concluderanno con una tavola rotonda che verterà sul tema Fitoplasmi e territorio: diffusione, diagnosi e sistemi innovativi di controllo. Presentation Following the traditional meetings started in Udine almost twenty years ago the phytoplasmology group is organizing at Bologna University, the VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases in order to update the scientific community and the stakeholders on the different aspect of phytoplasma and phytoplasma associated diseases. The introduction will present the axenic cultivation of phytoplasmas that could open new research avenues leading to eventually increase the knowledge in this relevant plant pathology field. The different aspects of the phytoplasma research such as new diseases and quarantine diseases, transmission and insect vectors, phytoplasmahost interactions, epidemiology, control and diagnostic are covered by 36 communications. The three days meeting will end with a round table about Phytoplasma and environment: diffusion, diagnostic and innovative management systems. 5

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7 Petria 23 (1), (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi Indice / Index RELAZIONE INTRODUTTIVA INVITED PRESENTATION Contaldo N., A. Bertaccini, S. Paltrinieri, D. Windsor, H. Windsor Cultivation of several phytoplasmas from a micropropagated plant collection / Coltivazione di fitoplasmi in substrato axenico utilizzando ceppi mantenuti in collezione mediante micropropagazione...pag. 13 NUOVE MALATTIE E MALATTIE DA QUARANTENA NEW AND QUARANTINE PHYTOPLASMA DISEASES Casati P., Y. Abou-Jawdah, A. Cominetti, F. Quaglino, E. Choueiri, M. Molino Lova, R. Tedeschi, S. Prati, L. Picciau, A. Alma, P.A. Bianco Identificazione molecolare di Candidatus Phytoplasma phoenicium in piante spontanee presenti in frutteti del Libano / Molecular identification of Candidatus Phytoplasma phoenicium in spontaneous plants in fruit orchards in Lebanon...pag. 21 Paltrinieri S., M. Piergiacomi, N. Contaldo, F.R. De Salvador, A. Bertaccini Indagine sulla presenza di fitoplasmi in Actinidia spp. in Italia centrosettentrionale / Survey to verify phytoplasmas presence in Actinidia spp. in North-Central Italy...pag. 25 Ermacora P., F. Ferrini, M. Martini, F. Pavan, A. Loschi, N. Loi, S. Moruzzi, R. Osler Caratterizzazione biologica e molecolare di un fitoplasma associato alla fillodia della cicoria nel nord-est dell Italia / Biological and molecular characterization of a phytoplasma associated with chicory phyllody in North-East Italy...pag. 29 Gentili A., L. Ferretti, E. Costantini, A. Zoina, L. Cozzolino, P. Spigno, G. Pasquini Rilevamento di flavescenza dorata ceppo FD-D in areali viticoli dell isola di Ischia / Identification of flavescence dorée strain FD-D in viticultural areas of Ischia island (Campania, Italy)...pag. 33 Contaldo N., A. Bertaccini, G. Bozzano, G. Parrella, L. Cavicchi, M.G. Bellardi Infezione da stolbur e virus dell avvizzimento maculato del pomodoro (TSWV) in Lupinus polyphyllus / Mixed infection by stolbur phytoplasmas and tomato spotted wilt virus (TSWV) in Lupinus polyphyllus...pag. 37 Spallino R.E., S. Rizza, C. Marzachì, M. Tessitori Scopazzi della ginestra in Sicilia / Spartium witches broom in Sicily...pag. 41 7

8 Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases Bertaccini A., J.F. Mejia, S. Paltrinieri, N. Contaldo, G. Granata Grave deperimento in kentia associato alla presenza di fitoplasmi / A severe kentia decline associated with phytoplasma presence...pag. 45 Marcone C., E. Seemüller Diffusa presenza di scopazzi del melo in impianti familiari in Val d Agri, Basilicata / Widespread occurrence of apple proliferation in low-intensity orchards in Agri valley, Basilicata (Italy)...pag. 49 Quaglino F., P. Casati, Y. Abou-Jawdah, E. Choueiri, M. Molino-Lova, R. Tedeschi, A. Alma, P.A. Bianco Elevata omogeneità genetica in popolazioni di fitoplasmi associati agli scopazzi del mandorlo in Libano / High genetic homogeneity among almond witches broom phytoplasma populations in Lebanon...pag. 53 Salem N.M., F. Quaglino, A. Abdeen, P. Casati, D. Bulgari, A. Alma, P.A. Bianco Prima segnalazione di Candidatus Phytoplasma solani associato a legno nero della vite in Giordania / First report of Candidatus Phytoplasma solani associated with grapevine bois noir disease in Jordan...pag. 57 Costantini E., L. Ferretti, A. Gentili, F. Punelli, G. Pasquini Identificazione di fitoplasmi appartenenti al gruppo 16SrIX-C in piante di Argyranthemum frutescens / Identification of 16SrIX-C phytoplasmas in Argyranthemum frutescens L....pag. 61 TRASMISSIONE DI FITOPLASMI ED INSETTI VETTORI PHYTOPLASMA TRANSMISSION AND INSECT VECTORS Conti M. Fitoplasmi e trasmissione per seme / Phytoplasmas and seed transmission...pag. 67 Mori N., F. Pavan, N. Contaldo, S. Paltrinieri, A. Bertaccini Indagini epidemiologiche su Candidatus Phytoplasma asteris in colza / Candidatus Phytoplasma asteris epidemiology in oil seed rape...pag. 71 Monti M., M. Martini, R. Tedeschi Diagnosi e quantificazione specifiche di Candidatus Phytoplasma mali in insetto mediante EvaGreen real-time PCR / Specific detection and quantification of Candidatus Phytoplasma mali in insect by EvaGreen real-time PCR...pag. 75 8

9 Petria 23 (1), (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi Tedeschi R., L. Picciau, F. Quaglino, P. Casati, M. Molino-Lova, Y. Abou-Jawdah, P.A. Bianco, A. Alma Indagini preliminari su insetti vettori di Candidatus Phytoplasma phoenicium in Libano / Preliminary survey on potential insect vectors of Candidatus Phytoplasma phoenicium in Lebanon...pag. 79 Forte V., E. Bortolamai, L. Filippin, E. Angelini, N. Mori Emitteri Auchenorrincha presenti in Ailanthus altissima infetto dal fitoplasma della flavescenza dorata della vite / Auchenorrhyncha fauna living on Ailanthus altissima infected by grapevine flavescence dorée phytoplasma...pag. 83 Mori N., V. Forte, P. Collodel, E. Angelini Sopravvivenza dei diversi stadi di sviluppo di Scaphoideus titanus su Ailanthus altissima / Scaphoideus titanus survival on Ailanthus altissima...pag. 87 Rizza S., V. D Urso, C. Marzachì, M. Tessitori Osbornellus horvathi potenziale vettore di fitoplasmi del gruppo 16SrIX / Osbornellus horvathi potential vector of 16SrIX phytoplasmas...pag. 91 INTERAZIONE FITOPLASMA ED OSPITI INTERACTION AMONG PHYTOPLASMAS AND HOSTS Pacifico D., L. Galetto, S. Abbà, S. Bertin, S. Palmano, M. Rashidi, D. Bosco, G. Firrao, C. Marzachì Risultati preliminari dell espressione genica del fitoplasma del giallume della margherita nella pianta e nell insetto vettore / Preliminary results on gene expression of chrysanthemum yellows phytoplasma in plant and insect vector...pag. 97 Miotti L., R. Musetti, E. Angelini Studi di espressione genica in Catharanthus roseus infetto dal fitoplasma della flavescenza dorata della vite / Gene expression studies on Catharanthus roseus infected by grapevine flavescence dorée phytoplasma...pag. 101 Rashidi M., L. Galetto, F. Veratti, C. Marzachì, D. Bosco Studio in vivo del ruolo delle proteine di membrana di chrysanthemum yellows phytoplasma nella trasmissione con insetti vettori / In vivo assays to test the role of phytoplasma membrane proteins of chrysanthemum yellows phytoplasma on vector acquisition and transmission capabilities...pag. 105 Serwaa R.A., M. Kube, R. Reinhardt, S. Paltrinieri, A. Bertaccini Organizzazione del gene imp in Candidatus Phytoplasma cynodontis / Organisation of the imp-locus in Candidatus Phytoplasma cynodontis...pag

10 Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases Nissen L., P. Mattarelli, N. Contaldo, L. Cavicchi, A. Bertaccini, M.G. Bellardi Studio analitico-comparativo sull attività antibatterica di oli essenziali di Monarda fistulosa sana e infetta da fitoplasmi / Comparative analysis of the antibacterial activity of essential oils from healthy and phytoplasma infected Monarda fistulosa...pag. 113 Margaria P., P. Caciagli, A. Ferrandino, A. Schubert, S. Palmano Analisi biochimiche e di espressione genica della via metabolica dei flavonoidi in viti affette da flavescenza dorata e risanate / Transcriptional and metabolic analyses of the flavonoid pathway in flavescence dorée affected and recovered grapevines...pag. 117 EPIDEMIOLOGIA DELLE FITOPLASMOSI EPIDEMIOLOGY OF PHYTOPLASMA DISEASES Punelli F., A. Gentili, E. Costantini, L. Ferretti, G. Pasquini Variabilità molecolare multigenica del fitoplasma stolbur in relazione alla distribuzione geografica sul territorio italiano / MLST variability of stolbur phytoplasmas in relationship with their geographic distribution in Italy...pag. 123 Bertaccini A., S. Paltrinieri, N. Contaldo, E. Gargani, P. Braccini, B. Bagnoli Variabilità genetica di fitoplasmi associati a flavescenza dorata in un vigneto della provincia di Massa Carrara / Genetic variability in phytoplasmas associated with flavescence dorée in a vineyard of the Massa Carrara province (Tuscany, Italy)...pag. 127 Vizzaccaro L., G. Pasquini, E. Costantini, A. Gentili, F. Punelli, L. Ferretti Studio della variabilità molecolare mediante analisi multigenica di Candidatus Phytoplasma mali, Candidatus Phytoplasma prunorum e Candidatus Phytoplasma pyri / Investigation on molecular variability of Candidatus Phytoplasma mali, Candidatus Phytoplasma prunorum and Candidatus Phytoplasma pyri by multilocus sequence analysis...pag. 131 Mejia J.F., L. Zamora, B. Duduk, M.L. Quiñones, A. Bertaccini, N. Contaldo Caratterizzazione molecolare di ceppi di Candidatus Phytoplasma asteris da mais /Molecular characterization of Candidatus Phytoplasma asteris strains from maize...pag. 135 Duduk B., Y. Arocha, J. Mitrović, R. Michelutti, R. Benabid, J. Scott, A. Bertaccini Caratterizzazione molecolare di Candidatus Phytoplasma asteris in ortensia in Canada / Molecular characterization of Candidatus Phytoplasma asteris infecting hydrangea in Canada...pag

11 Petria 23 (1), (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi CONTROLLO DELLE MALATTIE ASSOCIATE A FITOPLASMI CONTROL OF PHYTOPLASMA-ASSOCIATED DISEASES Osler R., P. Ermacora, N. Loi, M. Martini, R. Musetti Malattie da fitoplasmi: il recovery e le resistenze acquisite, l epigenetica e la resilienza / Recovery and acquired resistances, epigenetic and resilience...pag. 145 Romanazzi G., S. Murolo, E. Feliziani, L. Landi, V. Mancini Effetti dell applicazione in campo di induttori di resistenza sulle caratteristiche quantitative e qualitative della produzione e sulle infezioni di legno nero della vite / Application of resistance inducers in grapevines affected by bois noir : effects on qualitative and quantitative production parameters...pag. 149 Gonella E., E. Crotti, M. Mandrioli, D. Daffonchio, A. Alma Colonizzazione e trasmissione del batterio acetico Asaia in Scaphoideus titanus Ball, vettore del fitoplasma della flavescenza dorata della vite / Colonization and transmission pathways of the acetic acid bacterium Asaia in Scaphoideus titanus Ball, vector of flavescence dorée phytoplasma to grapevine...pag. 153 Lessio F., A. Alma Influenza dello sviluppo del ritidoma e della termoterapia sulle uova di Scaphoideus titanus Ball / Influence of bark s development and hot water treatment on the eggs of Scaphoideus titanus Ball...pag. 157 Tessari F., N. Mori, F. Quaglino, G. Posenato, P.A. Bianco Possibilità di diffusione del legno nero della vite attraverso il materiale vivaistico / Possibility of grapevine bois noir diffusion through propagation material...pag. 161 Poggi Pollini C., A.R. Babini, M. Dallara, C. Lanzoni, C. Ratti Valutazione di nuove varietà di albicocco nei confronti del giallume europeo delle drupacee (ESFY) mediante l utilizzo di tecniche molecolari / Evaluation of tolerance to European Stone Fruit Yellows (ESFY) of new apricot cultivars with molecular methods...pag. 165 DIAGNOSI DI MALATTIE DA FITOPLASMI PHYTOPLASMA DISEASE DETECTION Pasquini G., A. Bertaccini, P.A. Bianco, P. Casati, E. Costantini, L. Ferretti, A. Gentili, M. Martini, C. Marzachì, S. Palmano, S. Paltrinieri, M. Barba Progetto ARNADIA: definizione di protocolli nazionali di diagnosi per Candidatus Phytoplasma mali e Candidatus Phytoplasma prunorum / ARNADIA project: definition of National diagnostic protocols for Candidatus Phytoplasma mali and Candidatus Phytoplasma prunorum...pag

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13 Petria 23 (1), (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi CULTIVATION OF SEVERAL PHYTOPLASMAS FROM A MICROPROPAGATED PLANT COLLECTION N. Contaldo 1, A. Bertaccini 1, S. Paltrinieri 1, D. Windsor 2, H. Windsor 2 1 DipSA, Patologia vegetale, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, viale G. Fanin 42, Bologna 2 Mycoplasma Experience - Reigate, UK and Introduction The recognition that certain plant diseases were associated with mycoplasmalike structures in the sieve-tubes was first reported by Doi and coworkers in 1967 who extended this observation by confirming possible disease causation, and their similarity to mycoplasmas, by showing that disease symptoms could be ameliorated by treatment with tetracycline (Ishiie et al., 1967). Hitherto, these diseases - referred to as the aster yellows group - had been thought to be caused by viruses. In animals and humans, mycoplasma infections had similarly often been regarded as viral in nature due partly to their filterability through membranes of small pore size but also due to the inability to culture the infectious organism in common bacteriological media. Many workers, mainly plant pathologists rather than mycoplasmologists, took up the challenge to culture these organisms. An early outcome of this effort was the culture of spiroplasmas microorganisms derived from insects capable of causing plant diseases following infection of the sieve tubes. This distinct group of organisms grew readily in mycoplasma media formulations whereas the mycoplasma-like objects (phytoplasmas) did not and a possible reason was that a closer alignment of media to sieve-tube sap composition was required. Morphologically the two groups were quite distinct, spiroplasmas having a spiral structure as the name suggests whereas phytoplasmas were generally pleomorphic. Some reports of successful phytoplasma culture were published (Lombardo and Pignattelli, 1970; Lin et al., 1970; Giannotti and Vago, 1971; Ghosh et al., 1975) but none proved repeatable and as the years of failure increased, hope of cultivation decreased to such an extent that some plant workers came to consider that phytoplasmas were indeed uncultivable (reviewed in Maramorosch, 2011). Over forty years had elapsed since Doi s publication but there were workers who believed culture to be possible and a collaboration was initiated in 2008 between Bologna University and Mycoplasma Experience. Early success was definitely not anticipated and a lengthy process of medium modification/alignment to sieve-tube sap composition was envisaged. 13

14 Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases Materials and methods The collaboration started with routine mycoplasma liquid and solid media (lacking thallium acetate) being sent to Bologna for isolation attempts from the micropropagated plant collection infected with phytoplasmas. Several lots of media were sent to Bologna and before any modifications were made to the formulation, evidence of phytoplasma cultivation was obtained (Bertaccini et al., 2010). Sliced midribs, leaf stalks and stems from infected and healthy micropropagated shoots were inoculated into 2 ml volumes of liquid medium and incubated at 26 C. The broth culture inoculated with some stolbur phytoplasma strain (Contaldo et al., 2012) was seen to have a strong acid colour change (yellow as phenol red is the ph indicator) after about 1 to 9 months incubation. The colour change was passaged in fresh liquid medium and the colonies produced on Mycoplasma Experience solid medium were in-keeping with the size and overall shape of mycoplasma colonies. Several other apparent successful isolations did show that, however surprising, culture of phytoplasmas was a reasonable interpretation of the evidence, so it was important to repeat this work in UK laboratories. Phytoplasma infected micropropagated plants were accordingly transferred and culture was repeated. So, despite many failures over the years, why has this effort succeeded with a medium that supported animal mycoplasmas? Here is a list of necessary requirements for phytoplasma cultivation. 1. Plant tissue selected for isolation must contain viable phytoplasmas. 2. Release from the plant tissue of viable phytoplasmas. Disruption of whole plants could release factors inhibitory to growth. Release of phytoplasmas must be achieved from the sieve-tubes in the presence of sieve-tube sap coagulation mechanisms to prevent loss on trauma. 3. Culture media and temperature must be suitable to support growth of the phytoplasma species infecting the chosen plant. Where solid media are chosen for isolation attempts, the atmosphere must also be considered. 4. The incubation period must be of sufficient time to allow evidence of phytoplasma growth to manifest itself. 5. The observer must be able to recognize elements of microbial growth if it occurs. This is not always straight forward and time-consuming inspections of solid media may be required. Inadequacy on any of these points would result in failure so there are many reasons, apart from a suitable medium, that could be responsible for previous failures. It is quite possible that isolations have been made but not recognized as such, or not suitably subcultured for isolation to be confirmed. PCR amplification using phytoplasma specific primers (Gibb et al., 1995; Gundersen and Lee, 1996; Lee et al., 1994; 1995) under previously described conditions (Schaff et al., 1992; Lee et al., 1998) confirmed that the colonies were indeed identical to 14

15 Petria 23 (1), (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi the phytoplasmas that were initially transferred to the agar plates. Identification using RFLP analysis and direct sequencing of selected amplicons confirmed phytoplasma identity. Results and discussion Phytoplasmas reveal their presence by turning the medium acid (yellow) and this can often become strongly acid overnight. Endosymbionts, if present, can also cause strong acid colour changes, but on plating these organisms produce large, spreading colonies that cover the entire plate on continued incubation. Filtration of acid broth cultures through 0.8 µm filters can sometimes exclude the endosymbionts whilst allowing through the phytoplasmas. The incubation time required before a phytoplasma induced colour change occurs, as demonstrated by plating and colony development, is extremely variable. Colonies are conveniently detected by observing plates at an overall magnification of X25 with colonial growth commonly occurring in three to seven days. Storage of cultures at -70 C has resulted in stable counts so far mycoplasma suspensions are stable for tens of years at -70 C (death occurs within months at -20 C). Inactivation of phytoplasmas, like mycoplasmas, occurs at temperatures around 50 C to 60 C. Besides the initial seven phytoplasmas (Contaldo et al., 2012), five additional strains were grown: potato witches broom (PWB, ribosomal group 16SrVI-A), witches broom disease of lime (WBDL, ribosomal group 16SrII-B), peach X disease (CX, ribosomal group 16SrIII-A), clover phyllody England (KVE, ribosomal group 16SrI-C), Pichris echioides yellows (PEY, ribosomal group 16SrIX-C). Because PCR confirmation of these latter phytoplasmas is still in progress, they should be regarded as preliminary results. Additional types of phytoplasmas are in the initial isolation stage, but it appears that all the available phytoplasma strains can be cultured. Contrary to the prevailing dogma in plant pathology, therefore, phytoplasmas, like mycoplasmas, can indeed be grown independently from the host(s). The commercial medium used for phytoplasma isolation and cultivation utilizes media available for purchase at Phytoplasmas in vitro Ltd. (Reigate, UK), although their composition is proprietary. From the preliminary cultivation work a patent was submitted (Bertaccini et al., 2012) to cover the commercial exploitation of the methodology. However, research carried out for scientific purposes is not restricted by the patent. Another key point for in vitro cultivation is that micropropagated periwinkle shoots infected with phytoplasmas must be used for initial isolation. These can be obtained from the official collection of phytoplasma strains in micropropagation (http://www.ipwgnet.org/collection.html) and have been available since 1990 (Bertaccini et al., 1992). A major advantage of the procedure is that it makes it possible to obtain a source of phytoplasma cultures from different strains, which may then be compared in order to improve understanding of these microorganisms and their mechanisms of pathogenesis. Possible applications of phytoplasma cultivation include improvement of diagnostic 15

16 Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases techniques by allowing the preparation of specific antisera and assessment of compounds/ biochemical agents for inhibition of phytoplasma growth. Selection and screening of plants resistant to phytoplasma infection, as well as the study of the modes of colonization by phytoplasmas of plant and insect vectors, are other possible applications. As a consequence, strategies aiming to treat and/or prevent phytoplasma related plant diseases could be better defined and more effective. In addition, faster production of diagnostic reagents can be achieved, as well as a more detailed knowledge about basic mechanisms that regulate the survival of phytoplasmas, which are among the smallest known living organisms. Key words: phytoplasmas, axenic growth, PCR/RFLP analyses, sequencing Coltivazione di fitoplasmi in substrato axenico utilizzando ceppi mantenuti in collezione mediante micropropagazione Viene descritta la coltivazione in substrato axenico di diversi ceppi di fitoplasmi ottenuta per la prima volta ed utilizzando materiale infetto mantenuto in micropropagazione. Il successo di questa ricerca, dopo oltre 40 anni di tentativi, è dovuto principalmente alla collaborazione fra l Università di Bologna e l azienda inglese che produce substrati per la coltura dei micoplasmi patogeni per uomo ed animali. Dopo tentativi preliminari che avevano fatto capire che i fitoplasmi erano in grado di svilupparsi in maniera autonoma in substrato liquido, è stata messa a punto una metodologia specifica per il prelievo e la coltivazione in substrati liquido e solido che è stata poi brevettata. Fino ad ora è stato possibile ottenere colonie di 12 ceppi di fitoplasmi e precisamente stolbur, ceppo STOL (gruppo ribosomico 16SrXII-A); legno nero, ceppo CH-1 (gruppo ribosomico 16SrXII-A); Chrysanthemym yellows, ceppo CY-TO (gruppo ribosomico 16SrI-B); tomato big bud, ceppo TBB (gruppo ribosomico 16SII-D); pear decline, ceppo PD (gruppo ribosomico 16SrX-C); apple proliferation, ceppo AP-15 (gruppo ribosomico 16SrX-A); poinsettia branching factor, ceppo JR (gruppo ribosomico 16SrIII-J); potato witches broom, ceppo PWB (gruppo ribosomico 16SrVI-A); witches broom disease of lime, ceppo WBDL (gruppo ribosomico 16SrII-B), peach X disease, ceppo CX (gruppo ribosomico 16SrIII-A), clover phyllody, ceppo KVE (gruppo ribosomico 16SrI-C) e Pichris echioides yellows, ceppo PEY (gruppo ribosomico 16SrIX-C). Da quanto fatto si ipotizza che tutti i fitoplasmi possano essere coltivati su questo substrato o su sue varianti. La conferma dell avvenuto isolamento viene ottenuta mediante l osservazione delle colonie al microscopio ottico a 25 ingrandimenti e l analisi dell acido nucleico estratto dalle colonie seguita da saggio PCR. L impiego di primers ribosomici e non, specifici per i diversi fitoplasmi, seguita dall analisi RFLP e dal sequenziamento degli ampliconi ottenuti hanno confermato che non vi sono rilevanti variazioni nelle sequenze studiate degli acidi nucleici rispetto ai ceppi originali identificati nelle piante ospiti. 16

17 Petria 23 (1), (2013) - VI Incontro Nazionale sui Fitoplasmi e le Malattie da Fitoplasmi Le ricadute a livello scientifico e pratico di questo lavoro vanno dalla possibilità di soddisfare i postulati di Koch, chiarendo i ruolo di questi patogeni nelle malattie ad essi associate, alle prospettive di produzione di specifici reagenti per kit diagnostici di rapida e facile applicazione, fino allo studio di possibili resistenze ai diversi patogeni. Parole chiave: fitoplasmi, cultura axenica, analisi PCR/RFLP, sequenziamento Lavori citati / References Bertaccini a., r.e. Davis, i-m. Lee, In vitro micropropagation for maintenance of mycoplasmalike organisms in infected plant tissues. Horticultural Science, 27(9), Bertaccini a., n. contaldo, a. calari, s. PaLtrinieri, H.M. WinDsor, D. WinDsor, Preliminary results of axenic growth of phytoplasmas from micropropagated infected periwinkle shoots. 18th Congress IOM, Chianciano Terme, Italy abstr. P-147, page 153. Bertaccini a., n. contaldo, D.G. WinDsor, Method for culturing phytoplasma. Pct/Ib2012/052965, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna - Phytoplasmas In Vitro Ltd. contaldo n., a. Bertaccini, s. PaLtrinieri, H.M. WinDsor, D.G. WinDsor, Axenic culture of plant pathogenic phytoplasmas. Phytopathologia Mediterranea, 51(3), Doi Y., M. teranaka, k. Yora, H. asuyama, Mycoplasma or PLT grouplike microrganisms found in the phloem elements of plants infected with mulberry dwarf, potato witches broom, aster yellows or pauwlonia witches broom. Annals Phytopathological Society Japan, 33, GHosH s.k., s.p. raychaudhuri, v.v. chenulu, a. varma, Isolation, cultiavation and characterization of mycoplasma-like organisms from plants. Proceedings of the Indian National Science Academy, 41B(4), Giannotti J., c. vago, Role des mycoplasmes dans l étiologie de la phyllodie du trèfle: culture et transmission expérimentale de la maladie. Physiologie vegetale, 9, GiBB k.s., a.c. PaDovan, B.D. MoGen, Studies on sweet potato little-leaf phytoplasma detected in sweet potato and other plant species growing in Northern Australia. Phytopathology, 85, GunDersen D.e., i-m. Lee, Ultrasensitive detection of phytoplasmas by nested- PCR assays using two universal primer pairs. Phytopathologia Mediterranea, 35, contaldo n., a. Bertaccini, s. PaLtrinieri, H.M. WinDsor, G.D. WinDsor, Axenic culture of plant pathogenic phytoplasmas. Phytopathologia Mediterranea, 51(3),

18 Petria - VI Italian Meeting on Phytoplasmas and Phytoplasma Diseases ishiie t., Y. Doi, k. Yora, H. asuyama, Suppressive effects of antibiotics of tetracycline group on symptom development of mulberry dwarf disease. Annals Phytopathological Society Japan, 33, Lee i-m., D.e. GunDersen, r.w. HaMMonD, r.e. Davis, Use of mycoplasmalike organism (MLO) group-specific oligonucleotide primers for nested-pcr assays to detect mixed-mlo infections in a single host plant. Phytopathology, 84, Lee i-m., a. Bertaccini, M. vibio, D.e. GunDersen, Detection of multiple phytoplasmas in perennial fruit trees with decline symptoms in Italy. Phytopathology, 85, Lee i-m., D.e. GunDersen-rinDaL, a. Bertaccini, Phytoplasma: ecology and genomic diversity. Phytopathology, 88, Lin s.c., c.s. Lee, r.j. chin, Isolation and cultivation of, and inoculation with a mycoplasma causing white leaf disease of sugarcane. Phytopathology, 60, LoMBarDo G., P. PiGnatteLLi, Cultivation in a cell-free medium of a mycoplasmalike organism from Vinca rosea with phyllody symptoms on the flowers. Annals of Microbiology, 20, MaraMoroscH k., Historical reminiscences of phytoplasma discovery. Bulletin of Insectology, 64(Supplement), S5-S8. schaff D.a., i-m. Lee, r.e. Davis, Sensitive detection and identification of mycoplasmalike organisms by polymerase chain reactions. Biochemical Biophysical Research Communications, 186,

19 NUOVE MALATTIE E MALATTIE DA QUARANTENA new and Quarantine PHYtoPLasMa Diseases

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