Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno Unito

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1 Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno Unito Identificazione di specie Bordetella Emesso da the Standards Unit, Microbiology Services Division,PHE Batteriologia - Identificazione ID 5 Emissione no:3 Data emissione: Pagina 1 di 22 Crown copyright 2014

2 Ringraziamenti Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici. Per ulteriori informazioni contattare: Standards Unit Microbiology Services Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ standards@phe.gov.uk Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare Website: Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la collaborazione di: Loghi corretti al momento della pubblicazione Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 2 di 22

3 Contenuti RINGRAZIAMENTI... 2 TABELLA MODIFICHE... 4 RICERCHE MICROBIOLOGICHE STANDARD DEL REGNO UNITO: SCOPO E OBIETTIVO... 6 SCOPO DEL DOCUMENTO... 9 INTRODUZIONE... 9 INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA MICRORGANISMI BERSAGLIO IDENTIFICAZIONE IDENTIFICAZIONE DI SPECIE BORDETELLA REFERTAZIONE INVIO NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE BIBLIOGRAFIA NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for Microbiology Investigations. L accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio Informazioni più dettagliate sull accreditamento possono essere consultate: Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 3 di 22

4 Tabella delle Modifiche Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il sistema locale di gestione della qualità. Modifica No/Data. 9/ Emissione eliminata. no 2.3 Emissione inserita no. 3 Sezione(i) interessate Documento intero. Pagina 2 Intero documento Scopo del docummento Modifica. Collegamenti ipertestuali aggiornati a gov uk. Aggiornati i loghi aggiunti Il titolo del documento è stato aggiornato per includere tutte le specie Bordetella Documento formato presentato in nuovo formato Lo scopo è stato aggiornato per includere tutte le specie di Bordetella isolate da materiale clinico, ma con più enfasi sulle due specie associate alla pertosse negli esseri umani. È stato aggiunto un collegamento Web per B 6 La tassonomia delle specie Bordetella è stata aggiornata. Introduzione Ulteriori informazioni sono state aggiunte alla sezione Caratteristiche. Le specie clinicamente importanti sono menzionati e le loro caratteristiche descritte. La Sezione sui Principi d Identificazione è stata aggiornata per inserire il nome attuale del laboratorio di riferimento in cui inviare le presunte specie Bordetella. Informazione Tecnica/Limitazioni Considerazioni sulla Sicurezza Microrganismi bersaglio Identificazione Aggiunta di informazione riguardante i terreni agar descritti e riferimento bibliografico Questa sezione è stata aggiornata per la necessità che il personale di laboratorio lavori in cabina di sicurezza e sono state incluse le voci bibliografiche. La sezione dei organismi bersaglio è stata aggiornata e presentata in modo chiaro.la bibliografia è stata aggiornata Gli aggiornamenti sono stati apportati a 3.1, 3.2 e 3.4 per riflettere standard nella pratica. Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 4 di 22

5 Punto 3.5, è stato aggiornato per includere i metodi molecolari rapidi Diagramma di flusso per identificazione Refertazione Invio Bibliografia La modifica del diagramma di flusso per l'identificazione delle specie di Bordetella è stato fatto per facilitare la lettura. Sottosezione 5.4 è stata aggiornata per rispecchiare la procedure di refertazione Aggiornato l indirizzo del laboratorio di riferimento Bibliografia in parte aggiornata. Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 5 di 22

6 Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito # : Scopo e Obiettivo Utilizzatori delle SMI Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive. Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di tests appropriati. Le SMI forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la salute (sia clinica che pubblica) per la propria popolazione. Informazioni di Base per le SMI Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati). Gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione della prova. La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di garantire in tutto il Regno Unito strategie d indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le attività di ricerca e di sviluppo. Collaborazione Paritaria La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS, Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali. L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito L'inclusione del logo di una organizzazione in una SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti possono non essere rigorosamente conformi a quelle dei membri delle organizzazioni a cui appartengono né a quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti rappresentano uno strumento bidirezionale per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse sono ricercate con un processo di consultazione. Le SMI sono sviluppate, revisionate ed aggiornate con un ampio processo di consultazione Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica. Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 6 di 22

7 Assicurazione di Qualità Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata dai Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L accreditamento è applicabile a tutte le linee guida prodotte dall Ottobre del La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008. Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti dell accreditamento con la promozione di procedure d elevata qualità che possono essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Le prestazioni della SMI dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del controllo di qualità interno. Coinvolgimento del Paziente e della Comunità Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento dei pazienti e dell opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L opportunità di partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l accesso libero al nostro sito web Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili La PHE è un organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza. Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza I Gruppi di Lavoro SMI sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti. Dichiarazione Legale Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente, escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche. Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell ente accreditato NICE. I diritti d autore delle SMI sono della Crown e questi dovrebbero essere riconosciuti quando appropriato. Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 7 di 22

8 Citazione Suggerita per questo Documento Public Health England (2014) Identification of species Bordetella. UK Standards for Microbiology Investigations. ID 5 Emissione 3. Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 8 di 22

9 Scopo del Documento Questa SMI descrive l identificazione a livello di specie Bordetella, le due associate nell uomo a pertosse (tosse asinina) Boerdetella pertussis e Bordetella parapertussis isolate da campioni clinici a livello di specie. Per informazioni fare riferimento a B 6 - Investigation of Specimens for Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis Questa SMI deve essere usata congiuntamente con le altre SMI. Introduzione Tassonomia Il genere Bordetella è formato attualmente da otto specie nel genere Bordetella; Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella hinzii, Bordetella holmesii, Bordetella trematum, Bordetella avium, e Bordetella petrii.una specie 'Bordetella ansorpii' è ancora in attesa di una classificazione ufficiale. Di queste nove specie, tutte possono potenzialmente causare infezioni negli esseri umani, anche se raramente in alcuni casi 1-3. Caratteristiche Le specie Bordetella sono Gram-negative, di aspetto coccobacillare, x µm. Al microscopio i microrganismi si presentano isolati o accoppiati, raramente formano catene 4. Presentano spesso una colorazione bipolare. Le cellule sono mobili o non mobili. Sono strettamente aerobicie (tranne che per una specie, B. Petrii) e la temperatura ottimale è di C. Sulle piastre le colonie su appaiono lisce, convesse, perlate, scintillanti, quasi trasparenti e circondate da una zona di emolisi, senza limite periferico definito. Il metabolismo è di tipo respiratorio e mai fermentativo. Le specie di Bordetella richiedono nicotinamide, aminoacidi e zolfo organico, per esempio cisteina. Specie Bordetella utilizzano per via ossidativa acido glutammico, prolina, alanina, acido aspartico e serina con produzione di ammoniaca e CO 2 5. Bordetella pertussis B. pertussis può svilupparsi su in tre giorni su terreno selettivo (agar sangue carbone con cefalexina) (ma di solito per l isolamento primario è richiesta un incubazione di 5-7 giorni. Le piastre di Petri dovrebbero essere incubate 7 giorni prima di essere scartate come negative 6. Lo sviluppo delle sottocolture richiede un incubazione più breve(3 giorni). Le colonie sono lisce, convesse, perlacee, brillanti, grigie-bianche e butirrose. B. pertussis non si sviluppa su agar nutriente ed in modo ridotto su agar sangue.b. pertussis è debolmente ossidasi positiva e non è mobile. Sono anche ureasi negative e agglutinano con antisiero polivalente anti B. pertussis e debolmente o non agglutinano con antisiero polivalente anti B. parapertussis in funzione di come è stato accuratamente eseguito l assorbimento crociato 6. Il test di sensibilità agli antibiotici non è eseguito di routine a parte due pubblicazioni che suggeriscono l esistenza di ceppi di Bordetella pertussis resistenti all eritromicina 7,8. L esecuzione del test di sensibilità della pertosse è complicata dalla lenta crescita del microrganismo e dalla ridotta crescita su alcuni tereni 6. Gli isolati di B. pertussis dovrebbero essere indirizzati per la conferma e la sierotipizzazione alla Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit. B. pertussis. ha tre principali agglutinogeni di superficie (1, 2 e 3), che sono rilevabili dall agglutinazione batterica tramite antisieri cross-assorbiti. Sono noti tre sierotipi che possono causare malattia nei soggetti umani Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 9 di 22

10 1,2, 1,3 e 1,2,3. Attualmente il meno frequente 1,2,3 6. Il tipo 1,3 rimane predominante e rappresenta la maggior parte degli isolati 4. Bordetella parapertussis Le colonie di B. parapertussis sono simili a quelle di B. pertussis, ma sono più grandi, più opache e divengono visibili prima. Crescono rapidamente e possono essere visualizzate su piastre di agar entro 2-3 giorni. Diversamente da B. pertussis, crescono su agar nutriente producendo nel terreno una colorazione marrone dopo diversi giorni. B. parapertussis non è mobile, ossidasi negativa e ureasi positiva. Sono agglutinate dall antisiero polivalente di B. parapertussis e in modo lento, se non per nulla, dall antisiero di B. pertussis 6. Bordetella bronchiseptica La morfologia delle colonie di questo microrganismo, quando coltivato su piastre di agar varia da liscia a rugosa. Su terreni contenenti sangue il microrganismo si presenta con colonie scintillanti β- emolitiche e sviluppa un diametro medio di 2,0 millimetri in 1 o 2 giorni. Le colonie crescono altrettanto bene su agar MacConkey. Sono ossidasi positive e mobili per flagelli peritrichi. Sono nitrato e ureasi positive (di solito entro 4 ore); ciò rappresenta un carattere differenziale da B. pertussis 9. Bordetella ansorpii Crescono sia sangue e agar MacConkey. Sono negative per ossidasi, ureasi, riduzione dei nitrati, esculinasi, mannitolo e arginina diidrolasi, ma positive per citrato, adipato, malato, attività gelatinasica e motilità 1. Bordetella trematum B. trematum sono mobili per presenza di flagelli peritrichi. La motilità non varia in modo significativo quando le cellule sono coltivate a 25, 30, o 37 C. In ore le culture su agar sangue, la cellule sono mediamente di 0,5 a 0.6μm di larghezza e 1-1.8μm di lunghezza; i bastoncini più grandi sono lunghi fino a 2.4μm. Su agar sangue formano colonie convesse, circolari, e grigio crema bianche con bordi continui. Non necessitano di particolari fattori di crescita e si svilupano sui terreni convenzionali. La loro crescita non è inibita da una temperatura di 42 C, ma si riduce notevolmente a 25 C. I ceppi crescono in microaerofilia, ma non in condizioni anaerobiche. Le colonie coltivate per 16 a 24 ore su transparent Diagnostic Sensitivity Test a 37 C presentano, a luce trasmessa obliquamente sotto un stereo microscopio, iridescenza dal giallo verdastro al giallo-rosso 10. Sono negative per ossidasi, attività dell'ureasi, fermentazione del glucosio, ma presentano risultati variabili durante il test per la riduzione dei nitrati e ciò dipende dal ceppo 10. Bordetella holmesii Si tratta di piccoli bastoncini coccoidi, di media ampiezza, si osservano occasionalmente cellule più lunghe. Su agar sangue, le colonie sono punteggiate, semiopache, convesse, e rotonde con bordi continui. Sui terreni si osserva una zona di doratura o verdeggiante. Sono ossidasi negativi, non mobili, asaccarolitici, esigenti e producono un pigmento solubile di colore marrone. Non crescono su Aga Citrate di Simmons, ma sulle piastre di agar MacConkey 3-7 giorni dopo incubazione a 35 C 11. Sono negative per motilità, crescita aerobica a 25 C e a 42 C, attività dell'ureasi, fermentazione del glucosio, ma positive per arginina, pralina e leucil glicine 10. Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 10 di 22

11 Bordetella hinzii Le cellule sono mobili per mezzo di flagelli peritrichi. Si verificano due distinti tipi di colonie. Alcuni ceppi su piastre di agar sangue sviluppano colonie rotonde, convesse, lucenti, grigiastre di circa 1 a 2 millimetri di diametro dopo ore di incubazione a 37 C in aria contenente il 5% di CO 2. Nelle stesse condizioni, altri ceppi producono colonie piatte asciutte, increspate con diametro fino a 5 mm di diametro. Bordetella hinzii cresce anche su agar MacConkey, ed è positiva per catalasi, ossidasi e assimilazione di adipato citrato, L-malato e fenilacetato. Esse forniscono risultati variabili per produzione di ureasi e non riducono nitrati 1. Sono anche negative per la fermentazione di glucosio e crescono in aerobiosi a 25 C e 42 C 10. Bordetella petrii Queste sono caratterizzate dalla capacità di crescere in condizioni aerobiche, microaerofile e anaerobie. Le cellule possiedono fimbrie di diverso diametro. Il microrganismo può essere coltivato su agar MacConkey e sviluppa su agar sangue colonie bianco crema non-emolitiche. Sono batteri asaccharoltici, non-fermentanti. Sono positivi per i test ossidasi e di riduzionedel tetrazolo; hanno reazione negativa per la produzione di ureasi, riduzione dei nitrati e motilità. Possono assimilare, citrato, adipato, L-malato e D-Gluconate 13. Sono sensibili a eritromicina, gentamicina, ceftriaxone, e piperacillina/tazobactam e sono resistenti ad amoxicillina, co-clavulanico, tetraciclina, clindamicina, ciprofloxacina e metronidazolo 14. Bordetella avium Questi batteri non sono lattosio fermentanti, b astoncini di piccole dimensionie che si caratterizzano per la capacità di crescere in condizioni aerobiche. Possono crescere su Trypticase soy agar arricchito con 5% di sangue di montone, agar cioccolato e agar MacConkey incubati a 35 C in 5% di CO 2. Su agar sangue formano colonie non-emolitiche 15. Sono positivi alle prove per motilità, ossidasi, catalasi e riduzione tetrazolio; e negativi per la riduzione dei nitrati e produzione di ureasi. Essi possono assimilare L-malato, adipato e fenilacetato anche se alcuni ceppi possono presentare una debole reazione per L-malato e adipato 10,13. Principi di Identificazione Le colonie di Bordetella isolate su agar selettivo sono identificate in modo preliminare per il loro aspetto, colorazione Gram e l agglutinazione con antisiero polivalente. I saggi biochimici ed altre prove addizionali sono utili per differenziare le specie del genere Bordetella da quelle microrganismi simili. Gli isolati sospetti e confermati positivi di B. pertussis e B. parapertussis devono essere inviati alla Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit. L identificazione molecolare completa utilizzando, ad esempio, con PCR e Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) può essere utilizzata per identificare i ceppi a livello di specie. Tutti i laboratori della PHE che dispongono del saggio PCR per B. pertussis dovrebbero inviare tutti i campioni positivi al PHE Colindale per scopi di sorveglianza. Per informazioni, rivolgersi al laboratorio o consultare il seguente sito per i dettagli: : Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 11 di 22

12 Informazione Tecnica Terreni con agar Le piastre devono essere incubate aerobicamente in camera umida per 5 a 7 giorni a 35 a 37 C. Non incubare in atmosfera aerobica arricchita di anidride carbonica. La cefalexina è inclusa nei terreni con carbone come inibitore di molti batteri Gram-positivi e di alcuni Gram-negativi presenti nella normale flora faringea, ma non è completamente inibitoria verso tutti gli organismi. La crescita di B. pertussis è moderatamente ritardata sui terreni contenenti cefalexina. Si ritiene che alcuni ceppi di B. pertussis siano inibiti dalla cefalexina; pertanto, è stato sostenuto l'uso di entrambi terreni, selettivi e non selettivi 16. Può essere utilizzato un'altro terreno selettivo, ciclodestrina Solid Medium (MCS) modificato con cefdinir, questo ha dimostrato di migliorare l'isolamento selettivo di B. pertussis da campioni clinici, per una maggiore sensibilità e inibizione della flora del rinofaringe rispetto al terreno con cefalexina. Un altro vantaggio di questo di questo terreno è dovuta al lungo periodo di conservazione in quanto alla maggior parte dei laboratori di microbiologia clinica sono raramente richiesti esami colturali per pazienti con pertosse 17. Il costo del terreno MCS è simile a quello degli altri terreni utilizzati. Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 12 di 22

13 1 Considerazioni sulla Sicurezza Microrganismi del Gruppo di Rischio 2. Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza della manipolazione per tutti i microrganismi presentati in questa SMI. Eseguire le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi in cabina di sicurezza microbiologica 26. Se è utilizzato un tampone per raccogliere la crescita da una piastra e si esegue l emulsione in fisiologica per il test di agglutinazione, può insorgere il rischio di infezione; ciò dovrebbe essere incluso nella valutazione del rischio locale. In caso di espettorato, o altro materiale del tratto respiratorio inferiore, ove il rischio è rappresentato dalla possibilità che questi campioni possano contenere Mycobacterium tuberculosis vitali (MTB); tutte le procedure operative devono essere effettuate in strutture di Contenimento di Livello 3 Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e con la valutazione del rischio. Può manifestarsi rischio d infezione, che deve essere incluso nella valutazione del rischio locale, se per le prove di agglutinazione si utilizza un tampone per emulsionare in fisiologica colonie prelevate da una piastra. E essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto. 2 Microrganismi Bersaglio Specie Bordetella segnalate come causa di pertosse 4 Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis Altre Bordetella segnalate come agenti causali di infezione nell uomo - Bordetella bronchiseptica 35, Bordetella trematum 10, Bordetella hinzii 12, Bordetella holmesii 11, Bordetella ansorpii 1, Bordetella petrii 14, Bordetella avium Identificazione 3.1 Aspetto Microscopico Colorazione Gram (TP 39 - Staining Procedures) Coccobacilli sottili, Gram negativi, si presentano isolati o in coppia, raramente in catene. Alcuni ceppi possono essere dotati di capsula. 3.2 Terreno di Primo Isolamento Per l isolamento primario si usa agar carbone selettivo, incubato per 7 giorni a 35 C - 37 C in aerobiosi, con elevata concentrazione di umidità e buona circolazione d aria. Tuttavia, estendendo l incubazione della piastra fino a 12 giorni si è verificato nei campioni clinici un miglioramenti nel recupero di specie di Bordetella Aspetto delle Colonie Su agar carbone sangue con cefalexina le colonie di B. pertussis sono lisce, convesse, perlacee e brillanti, grigio-bianche e butirrose; nelle sottocolture si manifestano dopo 3 giorni e nell isolamento primario dopo incubazione più prolungata. Le colonie di B. parapertussis sono simili, ma più larghe, più opache e si sviluppano in due giorni. Su agar nutriente le colonie delle sottocolture di B. parapertussis producono un pigmento scuro che diffonde nel terreno. B. pertussis non cresce su agar nutriente. Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 13 di 22

14 3.4 Procedura di Prova Prove biochimiche Prova dell ossidasi (TP 26 Prova dell ossidasi) B. parapertussis è ossidasi-negativa, B. pertussis è ossidasi-positiva Agglutinazione (vetrino) con antisiero specifico.seguire le istruzioni del produttore e, prima dell'uso, le confezioni devono essere validate e aver dimostrato di essere idonee allo scopo. Preparare su un vetrino da microscopio una sospensione della colonia sospetta in soluzione fisiologica. Antisiero specifico di B. pertussis, B. parapertussis o soluzione fisiologica devono essere aggiunti alle sospensioni e miscelate. Un risultato positivo è indicato dalla presenza di agglutinazione con antisiero specifico e assenza di agglutinazione nella soluzione fisiologica. Se il risultato di agglutinazione è dubbio, inviare l'isolato Per una caratterizzazione più approfondita inviare al Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit gli isolati sospetti di B. pertussis e B. parapertussis Matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) Questo strumento ha dimostrato di essere rapido e potente per la sua riproducibilità, velocità e sensibilità dell'analisi. Il vantaggio di MALDI-TOF rispetto ad altri metodi di identificazione è che i risultati delle analisi sono disponibili entro poche ore anziché diversi giorni. La velocità e la semplicità di preparazione del campione e l'acquisizione del risultato associato a costi di consumo minimi rendono questo metodo adatto per la routine con elevata produttività 37. Questa nuova tecnica, che richiede minor impegno operativo, è stata utilizzata per ottenere identificazione delle specie a livello affidabile per la specie Bordetella di non frequente isolamento, come nel caso di endocardite su protesi valvolare aortica da omotrapianto causata da Bordetella holmesii che il test di routine di laboratorio aveva inizialmente ed erroneamente identificato come ceppo di specie Acinetobacter, mentre il sequenziamento del gene 16S rrna, quello del gene codificante la proteina A (ompa) della membrana esterna e l identificazione con MALDI-TOF MS sono state tutte coerenti per B. holmesii Nucleic Acid Amplification Tests (NAATs) La PCR è generalmente considerata un buon metodo perché è semplice, sensibile e specifica. La base per le applicazioni diagnostiche della PCR in microbiologia sono la rivelazione di agenti infettivi e la discriminazione fra ceppi non patogeni dai ceppi patogeni in virtù di geni specifici. Si tratta di uno strumento prezioso per rafforzare la sorveglianza epidemiologica e per la disponibilità di una rapida diagnosi di pertosse, in cui i risultati possono giovare alla gestione del paziente (e del contatto). Questo metodo è stato usato con successo per l'identificazione di Bordetella pertussis 39,40. Questa opportunità (tramite la Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit) è utilizzata per bambini di età 6 mesi ricoverati in unità di pediatrica con malattia respiratoria compatibile con la pertosse. 3.5 Identificazione Successiva Metodi Rapidi molecolari I metodi molecolari hanno avuto un impatto enorme sulla tassonomia di Bordetella. Le analisi delle sequenze geniche hanno aumentato la comprensione delle relazioni filogenetiche delle specie Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 14 di 22

15 Bordetella e ciò ha comportato la rilevazione di nuove specie. Le tecniche molecolari hanno consentito l identificazione di molte specie in modo più rapido e preciso di quanto sia possibile con le tecniche fenotipiche. Sono stati sviluppati numerosi metodi rapidi di tipizzazione per isolati da campioni clinici; Si tratta di tecniche molecolari come l Elettroforesi su Gel a Campo Pulsato i (PFGE), Multiple-locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and16s rrna gene sequencing. Tutti questi approcci consentono la tipizzazione dei ceppi non correlati, ma lo fanno in modo diverso per precisione, potere discriminante e riproducibilità. Tuttavia, alcuni di questi metodi rimangono accessibili solo a laboratori di riferimento e sono difficili da implementare in un laboratorio clinico per l identificazione batterica di routine. Pulsed Field Gel Electrophoresis Gel (PFGE) La PFGE rileva variazione genetica tra ceppi con rari tagli ottenuti con enzimi di restrizione e successiva separazione dei grandi frammenti genomici ottenuti su gel di agarosio.la PFGE è nota per essere altamente discriminante ed è una tecnica utilizzata frequentemente per le indagini sui focolai avendo acquisito una vasta applicazione nella caratterizzazione degli isolati epidemiologicamente correlati. Tuttavia, la stabilità della PFGE può essere insufficiente per un applicazione affidabile e in studi epidemiologici a lungo termine. Inoltre, a causa della sua natura, richiede tempo (30 ore o più per l esecuzione) e attrezzature speciali. La PFGE non è diffusamente usata se non nei laboratori di riferimento 41,42. La caratterizzazione molecolare dei ceppi è importante per identificare l epidemiologia della pertosse. Questo metodo è stato utilizzato inizialmente, ma è risultato laborioso e i risultati sono stati difficili da confrontare tra i laboratori 43. Multiple-locus variabile Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) La MLVA è un metodo efficace, semplice e trasportabile, che può essere utilizzato per ottenere profili di ceppi che possono essere facilmente scambiati per via elettronica. MLVA è stata usata con successo per tipizzare alcune diverse specie batteriche, dimostrando di essere un metodo eccellente e dotato di alta risoluzione, particolarmente utile per microrganismi con un ridotto livello di diversità nella sequenza. Questo nuovo approccio, MLVA Typing, è stato introdotto ed è usato per analizzare il numero di sequenze ripetute in tandem nel genoma di B. pertussis 43,44. Questa tecnica non richiede la coltura e può essere applicata direttamente a tamponi nasali o faringei. L analisi Variable-number tandem repeat (VNTR) ha rivelato una notevole eterogeneità nel genoma di B. pertussis e l'espansione clonale durante i periodi epidemici. 16S rrna gene sequencing Il metodo di identificazione genotipica, 16S rrna per il sequenziamento del gene è usato per studi filogenetici ed è stato successivamente riscontrato di essere in grado di ri-classificare i batteri in specie completamente nuove, o anche in generi. È stato utilizzato anche per descrivere nuove specie che non sono mai state coltivate con successo. Questo metodo è stato utilizzato recentemente per l'identificazione accurata delle specie Bordetella non classiche (cioè non includenti B. pertussis, B. parapertussis o B. bronchiseptica) come nel primo caso della setticemia a esito infausto causata da Bordetella hinzii 45. La maggiore variazione di mutazione del gene A (ompa) della proteina della membrana esterna della Bordetella confrontato al gene 16S rrna permette l'identificazione univoca delle specie non classiche di Bordetella. Tuttavia, si deve notare che le sequenze del gene 16S rrna di B. Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 15 di 22

16 pertussis, B. parapertussis e B. bronchiseptica sono identiche e pertanto questo metodo non può essere utilizzato per fornire una identificazione di specie nell ambito di queste ultime 3 specie. Questo vale anche per la sequenza ompa di queste 3 specie Conservazione e Invio Conservare gli isolati puri su agar carbone sangue a becco di clarino per l invio al Laboratorio di Riferimento. La coltura su becco di clarino può richiedere alcuni giorni d incubazione prima di manifestare una crescita adeguata. Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 16 di 22

17 4 Identificazione di specie Bordetella Il Diagramma Flusso rappresenta solo un indicazione Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 17 di 22

18 5 Refertazione 5.1 Identificazione Presuntiva Se si riscontrano appropriate caratteristiche di crescita, aspetto della colonia, colorazione Gram della coltura, prove dell ossidasi e risultati sierologici. 5.2 Conferma dell Identificazione Successiva al referto del Laboratorio di Riferimento. 5.3 Medico Microbiologo In accordo con i protocolli locali, informare il medico microbiologo di tutti gli isolati con identificazione preliminare e confermata di B. pertussis or B. parapertussis. Seguire i protocolli locali per la refertazione al medico del paziente. 5.4 CCDC Fare riferimento al Memorandum locale di Informazione. 5.5 Public Health England 47 Fare riferimento alle linee guida attuali della PHEe alle indicazioni del COSURV "La pertosse"tosse asinina è una malattia soggetta a Denuncia, per la gestione della salute pubblica dei casi, i contatti e le epidemie,e tutti i casi sospetti devono essere immediatamente denunciati ai locali Public Health England Centers Tutti gli isolati clinicamente significativi devono essere notificati dai laboratori diagnostici per garantire l avvio urgente di procedure corrette. 5.6 Gruppo Controllo Infezione Informare il gruppo di controllo delle infezioni degli isolati presunti o confermati di B. pertussis o B parapertussis da pazienti degenti in ospedale con identificazione preliminare e confermata. Gli altri isolati devono essere segnalati al gruppo di controllo delle infezioni secondo le procedure locali, specialmente se si sospetta un epidemia. 6 Invio 6.1 Laboratorio di Riferimento Contattare gli appropriati laboratori nazionale di riferimento per informazioni sugli accertamenti disponibili, i tempi di risposta, le procedure di trasporto ed altre informazioni riguardanti il invio del campione: Respiratory and Vaccine Preventable Bacteria Reference Unit Microbiology Services Public Health England 61 Colindale Avenue London NW9 5EQ Contattare il Centralino: Tel. +44 (0) Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 18 di 22

19 Inghilterra e Galles Scozia Irlanda del Nord 7 Notifica al PHE 47,48 o Equivalente Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s identificano gli agenti causali elencati nella Scheda 2 della Direttiva, Le denuncie devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica, entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro sette giorni. Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l ufficio locale della PHE. Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d infezione imputabili ad agenti causali soggetti a tale disposizione. La denuncia secondo la Direttiva dell Health Protection (Notification) Regulations 2010 non sostituisce l informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di alcuni tipi d infezione. Queste iniziative devono continuare. Nota: La linea guida dell Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione perf Human Immunodeficiency Virus (HIV) & Sexually Transmitted Infections (STIs), Healthcare Associated Infections (HCAIs) and Creutzfeldt Jakob disease (CJD) da includere nel Notification Duties of Registered Medical Practitioners, e non nel Notification Duties of Diagnostic Laboratories. Esistono accordi diversi in. Scotland 49,50, Wales 51 e Northern Ireland 52. Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 19 di 22

20 Bibliografia 1. Ko KS, Peck KR, Oh WS, Lee NY, Lee JH, Song JH. New species of Bordetella, Bordetella ansorpii sp. nov., isolated from the purulent exudate of an epidermal cyst. J Clin Microbiol 2005;43: Fry NK, Duncan J, Malnick H, Cockcroft PM. The first UK isolate of 'Bordetella ansorpii' from an immunocompromised patient. J Med Microbiol 2007;56: Spilker T, Liwienski AA, LiPuma JJ. Identification of Bordetella spp. in respiratory specimens from individuals with cystic fibrosis. Clin Microbiol Infect 2008;14: Kerr JR, Matthews RC. Bordetella pertussis infection: pathogenesis, diagnosis, management, and the role of protective immunity. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000;19: Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, et al. Genus Bordetella. Bergey,s Manual of Determinative Bacteriology. 9th ed. Baltimore: Williams and Wilkins; p Matthews R. The diagnosis of pertussis infections: a recurring challenge. PHLS Microbiol Dig 1997;14: Lewis K, Saubolle MA, Tenover FC, Rudinsky MF, Barbour SD, Cherry JD. Pertussis caused by an erythromycin-resistant strain of Bordetella pertussis. Pediatr Infect Dis J 1995;14: Korgenski EK, Daly JA. Surveillance and detection of erythromycin resistance in Bordetella pertussis isolates recovered from a pediatric population in the Intermountain West region of the United States. J Clin Microbiol 1997;35: Goodnow RA. Biology of Bordetella bronchiseptica. Microbiol Rev 1980;44: Vandamme P, Heyndrickx M, Vancanneyt M, Hoste B, De VP, Falsen E, et al. Bordetella trematum sp. nov., isolated from wounds and ear infections in humans, and reassessment of Alcaligenes denitrificans Ruger and Tan Int J Syst Bacteriol 1996;46: Weyant RS, Hollis DG, Weaver RE, Amin MF, Steigerwalt AG, O'Connor SP, et al. Bordetella holmesii sp. nov., a new gram-negative species associated with septicemia. J Clin Microbiol 1995;33: Vandamme P, Hommez J, Vancanneyt M, Monsieurs M, Hoste B, Cookson B, et al. Bordetella hinzii sp. nov., isolated from poultry and humans. Int J Syst Bacteriol 1995;45: von WF, Schattke A, Siddiqui RA, Rosick U, Gobel UB, Gross R. Bordetella petrii sp. nov., isolated from an anaerobic bioreactor, and emended description of the genus Bordetella. Int J Syst Evol Microbiol 2001;51: Fry NK, Duncan J, Malnick H, Warner M, Smith AJ, Jackson MS, et al. Bordetella petrii clinical isolate. Emerg Infect Dis 2005;11: Harrington AT, Castellanos JA, Ziedalski TM, Clarridge JE, III, Cookson BT. Isolation of Bordetella avium and novel Bordetella strain from patients with respiratory disease. Emerg Infect Dis 2009;15: Hoppe JE. Bordetella. In: Murray P R BEJPMATFCYRH, editor. Manual of Clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC: ASM press; p Ohtsuka M, Kikuchi K, Shundo K, Okada K, Higashide M, Sunakawa K, et al. Improved selective isolation of Bordetella pertussis by use of modified cyclodextrin solid medium. J Clin Microbiol 2009;47: Batteriologia Identificazione ID 5 Emissione no: 3 Data emissione: Pagina: 20 di 22