Il ruolo del sistema maggiore di istocompatibilità: Marco Andreani LIBT - Roma

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1 Il ruolo del sistema maggiore di istocompatibilità: dal laboratorio alla clinica Marco Andreani LIBT - Roma

2 Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche

3 Variabilità nella Genetica Umana Cosa ci rende unici La variabilità inter-individuale in 3 miliardi di bp nel genoma umano è dello 0.5%

4 Variabilità nella Genetica Umana Cosa ci rende unici Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) Copy Number Variations (CNV) 0.1% of inter-individual variability 30 x 10 6 SNP are known 1% are functional (3x10 5 ) 0.4% of inter-individual variability Insertion, Deletion, Inversion, Duplication

5 Sistemi genetici polimorfici Ruolo Biologico e Clinico Polimorfismo Rilevanza Biologica Rilevanza Clinica Geni HLA class I e II classici Geni HLA non classici (HLA-G) Presentazione dell antigene Alloreattività Immunità Innata Evoluzione Tolleranza Immunologica Trapianti Autoimmunità Malattie Infettive Gravidanza Trapianti Gravidanza Antigeni Minori di Alloreattività Trapianti Istocompatibilità Gravidanza Natural Killer Receptors (KIR) Geni delle citochine e dei loro recettori Immunità Innata Risposta Immunitaria Trapianti Malattie Infettive Trapianti Autoimmunità Malattie Infettive Gruppi sanguigni Immunità Naturale Medicina Trasfusionale Molecole di Adesione (CTLA-4) Altri (PTX3, PTTN2, etc.) Risposta Immunitaria Attivazione cellulare Trasduzione del Segnale Trapianti Autoimmunità Malattie Infettive Autoimmunità Malattie Infettive

6 Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche

7 Regione HLA HLA di Classe I (A,B C) HLA di Classe II (DR, DQ, DP) Cromosoma 6

8 Insieme di proteine di membrana che consente ai linfociti di riconoscere le cellule come proprie (self) oppure come estranee

9 HLA Classe I (A, B, C)

10 Location of amino acid variability that results in multiple different HLA class I molecules Leader α1 α2 α3 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4

11 HLA Classe II (DRB1, DQB1, DPB1)

12 Location of amino acid variability that results in multiple different HLA class II molecules Leader β1/α1 β2/α2 Exon 1 Exon 2 Exon 3

13 Processazione e presentazione dell antigene Insieme dei processi che hanno come risultato: Antigeni endogeni per HLA classe I Antigeni esogeni per HLA classe II frammentazione delle proteine antigeniche associazione dei frammenti proteici (peptidi) alle molecole MHC trasporto del complesso peptide-mhc sulla superficie cellulare dove può essere riconosciuto dal recettore dei linfociti

14 Presentazione dell antigene da parte di molecole HLA

15 Riconoscimento diretto e indiretto

16 Antigen Presentation

17 Maturazione ed espansione delle cellule T

18 Attivazione delle cellule B

19 Interazione tra HLA e cellule NK

20 Caratteristica del sitema HLA Diversità allelica

21 Sequenze di alcuni alleli HLA*A

22 Annual Increase of the Number of HLA Antigens/Alleles

23 Per contrastare la flessibilità degli agenti patogeni Obiettivo: protezione della popolazione dall estinzione, utilizzando due strategie: Più di un tipo di molecola MHC in ciascun individuo Sistema POLIGENICO Estese differenze nelle molecole HLA tra individui Sistema POLIMORFICO

24 Difference from class I HLA molecule The classical HLA class Ia molecules are highly polymorphic HLA-A10 HLA-B12 HLA-Cw5 HLA-A3 HLA-B5 HLA-Cw7 HLA-A23 HLA-B12 HLA-Cw1 HLA-A11 HLA-B16 HLA-Cw8 HLA-A25 HLA-B40 HLA-Cw2 HLA-A26 HLA-B8 HLA-Cw5 HLA-A2 HLA-B27 HLA-Cw6 HLA-A28 HLA-B17 HLA-Cw5 HLA-A19 HLA-B14 HLA-Cw8 HLA-A19 HLA-B15 HLA-Cw2 HLA-A25 HLA-B12 HLA-Cw1 HLA-A24 HLA-B8 HLA-Cw4

25 Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche

26 Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche

27 Variazioni HLA nelle popolazioni L alto grado del polimorfismo del sistema HLA fornisce strumenti per lo studio della diversità nelle varie popolazioni: Storia Migrazioni Evoluzione Genetica Suscettibilità o resistenza alle malattie

28 Variazioni HLA nelle popolazioni

29 The Hardy-Weinberg Equilibrium Utilizzarono l algebra per spiegare come le frequenze alleliche possono predire le frequenze genotipiche e fenotipiche Una popolazione resta in equilibrio solo se in essa si verificano alcune condizioni restrittive: non devono verificarsi mutazioni non deve verificarsi una migrazione netta di alleli verso l interno della popolazione (immigrazione) o verso l esterno (emigrazione) la popolazione deve essere ampia (teoricamente infinita) non si deve verificare selezione naturale, vale a dire tutti i genotipi devono possedere le stesse capacità adattative e riproduttive

30 Two Allele Model Alleles A B Phenotypes Frequency a b Frequency A B A a*a a*b B a*b b*b Formularono indipendentemente questa formula matematica A AB B a*a 2*a*b b*b

31 Software packages Arlequin Gene[rate] Pypop

32 HLA population data storage and analysis Software should be able to handle ambiguous data, e.g. Gene[rate]

33 Variazioni HLA nelle popolazioni Progetto IME Formidabile opportunità di studio Possibilità di studio della segregazione aplotipica in quanto disponiamo di dati relativi all intera famiglia

34 Variazioni HLA nelle popolazioni

35 Variazioni HLA nelle popolazioni

36 Confronto tra la frequenza dell allele HLA-B*53 in diverse popolazioni SYRIA 0.61% IRAQI KURDISTAN NIGERIA 2.1% 16.9%

37 Global Distribution of Frequent African HLA-B Alleles Image from Solberg et al.(2008) see for more info

38 Variazioni HLA nelle popolazioni Uno studio su bambini in Africa condotto da Hill A (Nature 1991) ha mostrato che gli alleli HLA-B53 DRB1*1302-DQB1*0501 erano più frequenti in popolazioni provenienti dall Africa Occidentale rispetto a quanto osservato in altri etnie; variabili indipendentemente associate alla protezione nei confronti della Malaria

39 Variazioni HLA nelle popolazioni *07 *08 *13 *14 *15 *18 *27 *35 *37 *38 *39 *40 *41 *42 *44 *45 *46 *47 *48 *49 *50 *51 *52 *53 *54 *55 *56 *57 *58 *59 *67 *73 *78 *81 *82 *83 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 NIGERIA HLA-B Frequency Entrambi questi alleli sono frequenti nella popolazione Nigeriana *01 *15 *16 *03 *04 *11 *12 *13 *14 *07 *08 *09 *10 NIGERIA HLA-DRB1 Frequency 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

40

41 Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche

42 Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche Il laboratorio di Immunogenetica ha il compito di individuare un donatore HLA compatibile per un paziente proposto al trapianto Mother Father HLA-A: 01:01 29:01 HLA-A: 02:05 03:01 HLA-B: 08:01 35:03 HLA-B: 08:01 40:01 HLA-Cw: 07:01 04:01 HLA-Cw: 03:03 07:02 HLA-DRB1*: 07:01 03:01 HLA-DRB1*: 13:01 08:01 HLA-DQA1*: 02:01 05:01 HLA-DQA1*: 01:03 04:01 HLA-DQB1*: 03:03 02:01 HLA-DQB1*: 06:03 04:02 Tipizzazione HLA ad alta risoluzione di una famiglia dove è possibile evidenziare la segregazione aplotipica HLA-DPB1*: 09:01 04:01 HLA-DPB1*: 04:01 15: Child 1 Child 2 Child 3 Child 4 HLA-A: 29:01 03:01 HLA-A: 01:01 03:01 HLA-A: 29:01 03:01 HLA-A: 01:01 02:05 HLA-B: 35:03 40:01 HLA-B: 08:01 40:01 HLA-B: 35:03 40:01 HLA-B: 08:01 08:01 HLA-Cw: 04:01 07:02 HLA-Cw: 07:01 07:02 HLA-Cw: 04:01 07:02 HLA-Cw: 07:01 03:03 HLA-DRB1*: 03:01 08:01 HLA-DRB1*: 07:01 08:01 HLA-DRB1*: 03:01 08:01 HLA-DRB1*: 07:01 13:01 HLA-DQA1*: 05:01 04:01 HLA-DQA1*: 02:01 04:01 HLA-DQA1*: 05:01 04:01 HLA-DQA1*: 02:01 01:03 HLA-DQB1*: 02:01 04:02 HLA-DQB1*: 03:03 04:02 HLA-DQB1*: 02:01 04:02 HLA-DQB1*: 03:03 06:03 HLA-DPB1*: 04:01 15:01 HLA-DPB1*: 09:01 15:01 HLA-DPB1*: 04:01 15:01 HLA-DPB1*: 09:01 04:

43 Ambiguità Alleliche Genotipiche

44 Ambiguità Alleliche : Dovute a polimorfismi che si trovano fuori della regione analizzata

45 HLA ambiguity results from the amplification and Sanger sequencing based typing (SBT) of partial genes Allele ambiguity A*01:01:01:01 vs A*01:01:01:02N (Intron 2) DRB1*12:01 vs DRB1*12:06 (Exon 3) Exon 2 Intron 2

46 Ambiguità Genotipiche: Dovute a combinazioni uguali di alleli diversi (cis-trans) in campioni eterozigoti

47 HLA ambiguity results from heterozygous sequencing by Sanger SBT Genotype ambiguity-results from an inability to establish phase (cis/trans ambiguity) between closely linked polymorphisms identified by the typing system A*01:01:01:01+24:02:01: Y Y R Y MS A*01: : Y Y R Y MS A*24:02:01: C------T A C AC A*24: C------T A C CG

48 Sample: T Reference: IMGT/B Summary The allele pairs listed below are compatible with the consensus sequence. B*18:01:01 B*44:02:01:01 B*18:01:01 B*44:02:01:02S B*18:01:01 B*44:19N Exon 1 B*18:09 B*44:09 Exon 2 B*18:12 B*44:12 Exon 2 B*18:17N B*44:02:01:01 Exon 1 B*18:17N B*44:02:01:02SExon 1 B*18:17N B*44:19N Exon 1 B*18:20 B*44:51 Exon 3 B*18:43 B*44:55 Exon 2 Ambiguità Genotipiche o Cis/Trans

49 The discovery of new HLA alleles has resulted in an increase in heterozygous allele combinations that are identical in the commonly sequenced regions Allele 1 Allele 2 A* A*02:01:01:01 A*03:01:01:01 A* A*0226 A*02:26 A*03:07 A*0307 A*0234 A*02:34 A*03:08 A*0308 A* A*02:01:01:01 A*03:01:01:02N A* N A* L A*02:01:01:02L A*03:01:01:01 A* A* L A*02:01:01:02L A*03:01:01:02N A* N A* A*02:01:01:01 A*03:01:01:03 A* A* L A*02:01:01:02L A*03:01:01:03 A* A*0224 A*02:24:01 A*03:17 A*0317 A*0290 A*02:90 A*03:09 A*0309 A* A*02:01:01:03 A*03:01:01:01 A* A* A*02:01:01:03 A*03:01:01:02N A* N A* A*02:01:01:03 A*03:01:01:03 A* A* A*02:01:02 A*03:01:12 A* A*0323 A*03:23:01 A*02:195 A*9295 A*02:01:52 A*03:01:03 A*02:35:01 A*03:108 A*02:237 A*03:05 Year IMGT Release Year IMGT Release combinations (ex2+3) 20 combinations (ex2-4)

50 Compatibilità HLA e Trapianto di CSA Ambiguità Genotipiche attese in base alla frequenza allelica HLA-A: 62 % HLA-B: 58 % HLA-C: 58 % HLA-DPB1: 56 % HLA-DQB1: 25 % HLA-DRB1: 60 %

51 Compatibilità HLA e Trapianto di CSA

52 Compatibilità HLA e Trapianto di CSA The updated CWD catalogue designates 1122 alleles at the HLA-A, -B, -C, -DRB1, - DRB3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1 and -DPB1 loci as being CWD, and represents 14.3% of the HLA alleles in IMGT/HLA Database release In particular, we identified 415 of these alleles as being common (having known frequencies) and 707 as being well-documented on the basis of 140,000 sequencebased typing observations and available HLA haplotype data.

53 Nuove tecnologie Luminex 500 beads Next Generation Sequencing ILLUMINA SEQUENZIAMENTO PER SINTESI THERMO FISHER ION TORRENT ION SEMICONDUCTOR SEQUENCING

54 Compatibilità HLA e Trapianto di CSA

55 Rilevanza della compatibilità HLA

56 Rilevanza della compatibilità HLA 3857 MUD Tx from unrelated adult volunteer donors Early Stage P<0.001 Intermediate Stage P<0.001 Late Stage P=0.02 (Lee, Blood 2007)

57 Rilevanza della compatibilità HLA 3857 MUD Tx from unrelated adult volunteer donors Early Stage P<0.001 Intermediate Stage P<0.001 Late Stage P=0.02 (Lee, Blood 2007)

58 Rilevanza della compatibilità HLA 3857 MUD Tx from unrelated adult volunteer donors Early Stage P<0.001 Intermediate Stage P<0.001 Late Stage P=0.02 (Lee, Blood 2007)

59 Rilevanza della compatibilità HLA Immunol Res (2008) 41:56 78 Genetics of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Role of HLA matching, functional variation in immune response genes John A. Hansen Æ Effie W. Petersdorf Æ Ming-Tseh Lin Æ Steven Wang Æ Jason W. Chien Æ Barry Storer Æ Paul J. Martin

60 Rilevanza della compatibilità HLA Immunol Res (2008) 41:56 78 Genetics of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Role of HLA matching, functional variation in immune response genes John A. Hansen Æ Effie W. Petersdorf Æ Ming-Tseh Lin Æ Steven Wang Æ Jason W. Chien Æ Barry Storer Æ Paul J. Martin

61 T Cell Epitope Matching in Unrelated HSCT Structural versus Functional Structural Matching Functional Matching TCR / MHC Nucleotide Sequencing Allelic Matching or Disparity Sequence Identity for A,B,C,DRB1 (8/8) Shared T cell epitopes (TCE) TCE matching or disparity Functional Identity for TCE groups Classical Approach for SCT In use for Solid Organ TX Innovative for SCT

62 Rilevanza della compatibilità HLA Combinazioni alleliche permissive

63 Combinazioni alleliche permissive Kawase, Blood, October 1:110(7)

64 Combinazioni alleliche permissive Identification of a permissible HLA mismatch in hematopoietic stem cell transplantation Marcelo A. Fernandez-Viña et al. Key Points Mismatches in alleles C*03:03/C*03:04 were most frequent (68.7%) among the transplants with a single allele level mismatch in HLA-C The 7/8 C*03:03/C*03:04 mismatch group was not significantly different from the 8/8 HLA matched transplants in any transplant outcome. Blood ; 2014 Feb 20: 123(8)

65 Combinazioni alleliche permissive Impatto del DPB1 sul trapianto di cellule staminali ematopoietiche

66 Combinazioni alleliche permissive TCE3 Grouping Others The Algorithm: 60% permissive 40% non-perm. Zino, Blood 2004

67 The DPB TCE Webtool Anthony Nolan Registry

68 Analisi retrospettiva su 5428 UD-HSCT (10/10) NRM Non-permissive TCE Mismatch Permissive TCE Match DPB1 Allele Mismatched Allelic DPB1 Match Fleishhauer Lancet Oncol 2012:13(4):

69 Compatibilità DPB1 e andamento del trapianto di CSE nella talassemia

70 La compatibilità HLA è certamente rilevante per il successo di un trapianto, ma non è tutto!

71 La compatibilità HLA è certamente rilevante per il successo di un trapianto, ma non è tutto! Polimorfismo Rilevanza Biologica Rilevanza Clinica Geni HLA class I e II classici Geni HLA non classici (HLA-G) Presentazione dell antigene Alloreattività Immunità Innata Evoluzione Tolleranza Immunologica Trapianti Autoimmunità Malattie Infettive Gravidanza Trapianti Gravidanza Antigeni Minori di Alloreattività Trapianti Istocompatibilità Natural Killer Receptors (KIR) Geni delle citochine e dei loro recettori Immunità Innata Risposta Immunitaria Gravidanza Trapianti Malattie Infettive Trapianti Autoimmunità Malattie Infettive Gruppi sanguigni Immunità Naturale Medicina Trasfusionale Molecole di Adesione (CTLA-4) Altri (PTX3, PTTN2, etc.) Risposta Immunitaria Attivazione cellulare Trasduzione del Segnale Trapianti Autoimmunità Malattie Infettive Autoimmunità Malattie Infettive

72 La compatibilità HLA è certamente rilevante per il successo di un trapianto, ma non è tutto! Quante variabili genetiche si evidenziano sequenziando con NGS le 3.5x10 6 bp della regione MHC di un paziente e di un suo potenziale MUD HLA 10/10 compatible..? 3025 posizioni diverse (patziente vs. donatore) 1492 in regioni intergeniche 1173 in introni 360 in esoni (59 genes) Pröll et al. DNA Res. 2011; 18: 201

73 GENOME WIDE ANALYSIS SNP genotyping Affimetrix Genome-wide, Human SNP 6.0 array

74

75 Allele BAT2 Allele BAT3 BAT2/BAT3 Haplotypes AC 9/30 (30.0) 5/190 (2.6) 1.15 x GC 0/30 (0.0) 1/190 (0.50) GT 21/30 (70.0) 184/190 (96.8) 5.94 x

76 La compatibilità HLA è certamente rilevante per il successo di un trapianto, ma non è tutto! Trapianto da donatore correlato HLA identico Trapianto da donatore non correlato HLA identico Trapianto da donatore correlato aploidentico Utilizzo di cellule T regolatorie Utilizzo di nuovi protocolli di condizionamento

77 Take Home messages L impatto della compatibilità HLA sull andamento del trapianto resta un elemento di grande rilevanza, anche se diversi elementi, come ad esempio la progressione della malattia, devono essere considerati nella scelta della strategia trapiantologica E già possibile definire una compatibilità permissiva, attraverso il concetto di epitope matching, con valore predittivo, per il DPB1 in un contesto 10/10 (9/10) Valore predittivo per altri alleli (DRB1, DQB1 e di classe I) sono stati in parte già evidenziati, ma certamente dovranno essere approfonditi in futuro La possibilità di esplorare regioni genetiche fino ad ora non coinvolte nella compatibilità è elemento nuovo e stimolante per il futuro

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