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1 open access journal pediatric reports eissn ı Secondo Workshop AIEOP in Lab Catania, maggio 2011

2 PEDIATRIC REPORTS is an Open Access, peer-reviewed journal which publishes research articles, reviews, and case reports regarding all disorders and diseases in neonates, children and adolescents, as well as related molecular genetics, pathophysiology, and epidemiology. Editor-in-Chief Maurizio Aricò, Florence, Italy Editorial Staff Anne Freckleton, Managing Editor Cristiana Poggi, Production Editor Filippo Lossani, Technical Support Secondo Workshop AIEOP... in Lab Catania, maggio 2011 All PAGEPress journals are Open Access. PAGEPress articles are freely available online and deposited in a public archive immediately upon publication. You are free to copy, distribute, and reuse PAGEPress content as long as you credit the original author and source. Pediatric Reports 2011 [volume 3] [supplement 1] PEDIATRIC REPORTS is published by PAGEPress Publications, a division of MeditGroup and is completely free online at Publishing costs are offset by a publication fee charged to authors. Copyright Information All works published in PAGEPress journals are subject to the terms of the Creative Commons Attribution License (http: creativecommons.org/licenses/bync/3.0) unless otherwise noted. Copyright is retained by the authors. Any non-commercial reuse is permitted if the original author and source are credited. Correspondence Our publishing offices are located in via Giuseppe Belli 4, Pavia, Italy. Our telephone number is and our fax number is For more information and manuscript submission please go to http:

3 Pediatric Reports 2011;volume 3:s1 Secondo Workshop AIEOP... in Lab Catania, maggio 2011 ESPRESSIONE E FUNZIONE DI RECETTORI PER IL-17A E IL-25 SU CELLULE NEOPLASTICHE B DI DERIVAZIONE DAL CENTRO GERMINATIVO E. Ferretti, 1 E.Ognio, 2 E. Di Carlo, 3 C. Tripodo, 4 D. Ribatti, 5 C. Guarnotta, 4 C. Sorrentino, 3 M. Ponzoni, 6 V. Pistoia 1 1 Laboratory of Oncology, G. Gaslini Institute, Genova, Italia; 2 Animal Model Facility, National Institute for Cancer Research, Genova, Italia; 3 Department of Oncology and Neurosciences, "G. d'annunzio" University and Ce.S.I. Aging Research Center, "G. d'annunzio" University Foundation, Chieti, Italia; 4 Tumor Immunology Unit, Department of Health Science, Human Pathology Section, University of Palermo, Italia; 5 Department of Human Anatomy and Histology, University of Bari, Bari, Italia; 6 Istituto Scientifico San Raffaele, Unit of Lymphoid Malignancies, Department of Oncology, Milano Italia Introduzione. Il linfoma follicolare (FL), il linfoma diffuso a grandi cellule (DLCL) ed il linfoma di Burkitt (BL) sono neoplasie che originano dalle cellule B dei centri germinativi degli organi linfoidi secondari. 1 L incidenza maggiore di FL e DLCL si registra in individui di età superiore ai 60 anni, ma circa il 10% dei casi colpisce soggetti di età inferiore ai trent anni, parte dei quali si ammala in età pediatrica. 2 FL è una neoplasia che presenta, normalmente, una buona risposta al trattamento con chemioterapici, radio immunoterapia o Rituximab 3 senza però raggiungere la guarigione completa. Da ciò deriva la necessità di sviluppare nuovi approcci terapeutici. In questo studio abbiamo analizzato il possibile ruolo nella crescita tumorale di tale linfomi di due citochine facenti parte della stessa famiglia, IL-17A e IL-25 (o IL17-E), e dei loro recettori. Tali citochine, di natura pro-infiammatoria, risultano essere coinvolte in processi di natura autoimmune, in patologie allergiche, in infezione batteriche o fungine, così come in neoplasie con effetti contrastanti pro/contro tumore. 4 Per quanto riguarda i recettori, di natura eteromerica, IL- 17RA è in grado di legare sia IL-17A che IL-25, e IL-17RB è specifico per IL-255. Nulla si sa in merito ad espressione e funzione dei recettori di tali citochine in linfomi B del centro germinativo. Obiettivo di questa ricerca è stato investigare: i) l espressione e la funzione dei recettori di IL-17A e IL-25 su cellule derivate da linee e da pazienti effetti da LF; ii) il ruolo delle due citochine nella crescita tumorale, in vitro e in vivo, e iii) i meccanismi coinvolti in tali fenomeni. Materiali Metodi. L espressione in superficie della catene principali dei recettori per la IL17-A e per la IL-25 (nello specifico IL-17RA e IL17RB) è stata analizzata in vitro mediante marcatura citofluorimetrica. A tale analisi sono state sottoposte sia linee di linfoma di derivazione dal centro germinativo, quali SUDHL-4, DOHH2, LY8, Raji e RAMOS, sia cellule primarie isolate da pazienti adulti affetti da FL o DLCL (in considerazione della rarità di queste patologie in età pediatrica). Le cellule neoplastiche primarie sono state isolate dai linfonodi infiltrati mediante separazione immunomagnetica per la catena leggera monoclonale delle immunoglobuline. Le cellule neoplastiche sono state incubate per differenti tempi (24-48 e 72 ore) con ng/ml di IL-17A o IL-25 ricombinante, e sottoposte a test funzionali in vitro, per valutare l eventuale effetto delle due citochine su proliferazione e apoptosi. Quest'ultima è stata analizzata coltivando le cellule in un mezzo con ridotto apporto di siero (1%) e sottoponendole poi a marcatura con Annessina V e Ioduro di Propidio e successiva analisi citofluorimetrica. La proliferazione cellulare è stata analizzata mediante incorporazione di timidina dopo 72 ore di coltura. Per lo studio in vivo cellule SUDHL-4 sono state inoculate sottocute in 30 topi NOD/SCID, divisi in tre gruppi: un gruppo è stato trattato sottocute tre volte la settimana con 1µg di IL-17A ricombinante (R&D System), un secondo con 1µg IL-25 ricombinante (R&D System) e un terzo con PBS (controllo) seguendo il medesimo protocollo. Dopo 20 giorni, in presenza di masse sottocute, gli animali sono stati sacrificati e le masse misurate e recuperate per differenti analisi. In parte le masse sono state conservate in formalina, per consentire successive indagini istologiche ed immunoistochimiche; in parte sono state utilizzate per la preparazione di sospensioni cellulari, su cui è stata analizzata la modulazione di geni coinvolti nell angiogenesi tramite analisi con PCR array. Risultati. Lo studio si è focalizzato, inizialmente, sull'analisi dell'espressione dei recettori IL-17RA e IL-17RB sulla superficie delle cellule di linee FL e BL. Dati i valori elevati di espressione di entrambi i recettori nelle linee neoplastiche in esame (percentuale media di IL- 17RA e IL-17RB rispettivamente: SUDHL- 4: 72 e 48%; DOHH2; 89 e 82%; LY8: 60 e 74%; Raji: 49 e 61%; RAMOS: 30 e 58%) lo studio si è spostato direttamente all'analisi in vivo per valutare eventuali effetti del trattamento con IL17-A o IL-25 sulla crescita tumorale. Dall'inoculo in topi immunocompromessi SCID/NOD di 5x10 6 cellule della linea SUDHL-4 e successivo trattamento di tali animali con le citochine ricombinanti IL-17A o IL-25 è emerso come vi fosse un differente effetto delle due citochine sulla crescita della massa neoplastica. Nello specifico, la IL- 17A è in grado di aumentare in modo statisticamente significativo la crescita del tumore (P=0.026); al contrario, la IL-25 inibisce tale crescita (P=0.04). Le masse espiantate sono state analizzate anche da un punto di vista molecolare e immunoistochimico per valutare i possibili meccanismi responsabili del differente effetto delle due citochine. Da tale analisi è emerso un importante coinvolgimento dell'angiogenesi, che, come dimostrato sia dalle colorazioni su tessuto, che dall'analisi dei geni coinvolti nel meccanismo angiogenico, risulta essere potenziata negli animali trattati con la IL-17A e diminuita in quelli trattati con la IL-25. Nell'ultima parte dello studio, ci siamo concentrati sull'analisi di linfociti B neoplastici isolati da pazienti affetti da linfoma follicolare. Tali cellule presentavano un'elevata espressione di superficie dei recettori IL-17RA e IL-17RB, in modo del tutto analogo a quanto evidenziato nelle linee (percentuale media di IL-17RA e IL- [Pediatric Reports 2011; 3:s1] [page 1]

4 17RB rispettivamente: 52% e 57%). Successivamente è stata analizzata anche la funzionalità di entrambe le citochine sulle cellule neoplastiche primarie con studi in vitro su possibili effetti proliferazione e apoptosi a differenti tempi di trattamento. IL-17A si è dimostrata in grado di potenziare in modo significativo la proliferazione delle cellule neoplastiche a 72 ore (P=0.013); viceversa IL-25 la diminuiva ai medesimi tempi (P=0.01). Nessuna delle due citochine ha, invece, effetti sull'apoptosi di tali cellule a nessun tempo, come evidenziato tramite marcatura citofluorimetrica per annessina V e ioduro di propidio. Conclusioni. Con questo studio si è affrontata per la prima volta l analisi dell espressione e della funzione di recettori per IL-17A e IL-25 su linfociti B neoplastici di linfomi con origine dal centro germinativo. Da ciò è emerso un effetto protumore della IL-17A, sostenuto da un aumento di angiogenesi e proliferazione delle cellule tumorali, e un effetto antitumore della IL-25, capace di inibire significativamente sia la crescita neoplastica in vivo, che angiogenesi e proliferazione. Sono in corso indagini per valutare i meccanismi coinvolti in tali differenti effetti delle due citochine e per valutare la trasduzione del segnale indotta da entrambe sulle cellule neoplastiche in esame. 1. A clinical evaluation of the International Lymphoma Study Group classification of non-hodgkin's lymphoma. The Non- Hodgkin's Lymphoma Classification Project. Blood. 1997;89: Sandlund JT, Downing JR, Crist WM. Non-Hodgkin's lymphoma in childhood. N Engl J Med. 1996;334: Cheson BD. Targeted treatment and new agents in follicular lymphoma. Int J Hematol;92: Murugaiyan G, Saha B. Protumor vs antitumor functions of IL-17. J Immunol. 2009;183: Gaffen SL. Structure and signalling in the IL-17 receptor family. Nat Rev Immunol. 2009;9: LA METILAZIONE DEL MIR-34B CONTROLLA I LIVELLI DI CREB E CARATTERIZZA L EVOLUZIONE DELLE MDS IN LMA M. Pigazzi, E. Manara, A. Beghin, C. Tregnago, S. Gelain, E. Giarin, S. Bresolin, R. Masetti, G. Basso 1 Dipartimento di Pediatria Salus Pueri Clinica di Oncoematologia Pediatrica, SSD Ematologia: Clinica Sperimentale, Univer - sità di Padova, Padova, Italia; 2 Diparti - mento di Pediatria Lella Seragnoli Unità di Oncologia-ematologia, Università di Bologna, Bologna, Italia Introduzione. Il fattore di trascrizione CREB (camp response element binding protein) è stato dimostrato essere sovraespresso nel 66% dei pazienti affetti da leucemia mieloide acuta (LMA). In vitro, CREB è capace di promuovere la proliferazione cellulare, la progressione del ciclo cellulare, e la capacità di formare colonie. Inoltre, topi transgenici per CREB hanno sviluppato una malattia mieloproliferativa dopo un anno, mo - strando anomalie severe a carico della linea mieloide. CREB è stato precedentemente dimostrato essere un bersaglio diretto del mir-34b, e una bassa espressione di mir-34b caratterizza linee cellulari di leucemia mieloide con elevata espressione di CREB. La causa dei ridotti livelli di Mir-34b in queste linee derivava da una ipermetilazione del suo promotore. In questo studio il ruolo del Mir- 34b e CREB è stato valutato in vivo. Metodi. L espressione di mir-34b è stata monitorata via Real Quantitative-PCR in un'ampia coorte di 113 pazienti affetti da LMA de novo, e in 49 pazienti con diagnosi di sindrome mielodisplastica o malattia mieloproliferativa (MDS/JMML). Per tutti i pazienti è stata inoltre eseguita la Methylation specific PCR su DNA dopo trattamento con sodio bisolfito. 4 pazienti affetti da MDS evoluti in LMA inoltre sono stati analizzati mediate GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 microarray (Affymetrix). Topi NOD-SCID IL- 2receptor gamma null (NSG) sono stati trapiantati con linee cellulari leucemiche (HL60 e K562) stabilmente esprimenti il Mir-34b. Il trapianto è stato eseguito su fianco con matrigel e via vena caudale monitorando il tumore via bioluminescenza. Risultati. L espressione del mir-34b nei pazienti LMA alla diagnosi è significativamente minore (RQ=0,176) rispetto alla popolazione sortata CD19 CD3 di un pool di midolli sani (RQ=1) confermando il trend precedentemente osservato nelle linee cellulari leucemiche. I pazienti MDS/JMML invece presentano livelli di mir-34b più alti (RQ=5.5) rispetto ai pazienti LAM alla diagnosi (RQ=1). L analisi della metilazione del promotore del mir-34b rivela che il 65,5% (74/113) dei pazienti con LMA presenta il promotore metilato, ai quali si associano i livelli più bassi di mir-34b (RQ=0,075, rispettto ai pazienti non metilati RQ=0,373, P<0.01) e più alti di proteina CREB. Viceversa, tutti i pazienti MDS/JMML e i midolli sani di controllo non hanno mai mostrato avere metilazione del promotore di mir-34b. Inoltre, l'espressione della proteina CREB non è rilevabile in western blot. Questi risultati indicano che la metilazione della regione promotoriale mir-34b/c è un fenomeno LMAspecifico e che direttamente correla e controlla i livelli proteici di CREB. Per studiare il ruolo della metilazione del mir-34b nella leucemogenesi, il DNA di 3 pazienti affetti da MDS poi evoluti in LMA è stato considerato. I risultati mostrano che il promotore del mir-34b acquisiva la metilazione al momento delll'insorgenza di LMA, così come i livelli di espressione di mir-34b diminuivano progressivamente (RQmedia-MDS = 0.41 vs RQmedia- LMA = 0,26). Per comprendere se la metilazione del mir-34b provoca l attivazione trascrizionale di CREB, il profilo di espressione genica delle MDS e delle corrispondenti LMA è stato valutato. L analisi supervisionata ha identificato 11 geni CREB-targets espressi in modo differenziale (PRKACB, FDX1, NRXN2, PROSC, ADAM10, RAB7L1, NPR3, ITM2C, LATS2, CDK6 e HOXA7, P<0.001) tra la fase di MDS e la sua evoluzione in LMA. Inoltre, l analisi non supervisionata utilizzando questi 11 geni ha suddiviso i pazienti in due cluster distinti, rivelando che l'iperespressione di CREB e dei suoi geni targets caratterizza la progressione della MDS a LMA. Il modello in vivo ha dimostrato che l attecchimento e la progressione delle linee leucemiche erano ridotte dall espressione di mir-34b, confermando il mir-34b come soppressore nella LMA. Conclusione. Infine, l ipermetilazione del promotore del mir-34b è l hit che mantiene bassi i livelli di espressione del mir-34b alterando così l'attivazione di CREB e dei suoi targets nella LMA. Questo evento si dimostra critico per l'evoluzione delle MDS in LMA. IL PICCO DI CD34 + NEL SANGUE PERIFERI- CO DURANTE LA MOBILIZZAZIONE È UN FORTE E INDIPIDENTE FATTORE PRO- GNOSTICO PER LA DFS NELLA LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA IN 1 a RC E POTREBBE ESSERE USATO PER LA SCELTA DEL TRAT- TAMENTO POSTREMISSIONALE NEI PAZIENTI A RISCHIO INTERMEDIO G. Avola, M. Poidomani, S. Leotta, A. Spadaro, S. Mercurio, M.G. Camuglia, MA. Romeo, R. Lombardo, E. Cotzia, D. Donnarumma, G. Uccello, G. Milone Unità Trapianto di Midollo Osseo, Ospedale Ferrarotto, Azienda Ospedaliera Policlinico-Vittorio Emanuele, Catania, Italia Introduzione. Nei pazienti affetti da Leucemia Mieloide Acuta (LMA) in prima remissione completa, una singola raccolta aferetica con una conta di CD34+ superiore a /kg o un alto numero di cellule CD34 infuse, dopo autotrapianto, sono risultati predittivi per un alto rischio di ricaduta indipendentemente dalla classe di rischio citogenetica. Non è [page 2] [Pediatric Reports 2011; 3:s1]

5 noto se la misurazione del picco delle cellule CD34 nel sangue periferico durante la mobilizzazione, possa avere una maggiore capacità predittiva rispetto a queste due variabili, né se il valore prognostico di un alto picco di CD34 alla mobilizzazione sia indipendente da altri fattori prognostici o se sia evidente anche in pazienti sottoposti a trapianto allogenico. Metodi. In 96 pazienti adulti affetti da LMA in prima remissione completa (RC) dopo chemioterapia di induzione è stato valutato il picco di cellule CD34 + nel sangue periferico raggiunto durante la mobilizzazione e raccolta. In tutti i casi la mobilizzazione delle cellule staminali nel sangue periferico era indotta tramite G- CSF dopo al primo ciclo chemioterapico di consolidamento. È stata determinata la distribuzione del picco delle cellule CD34 + e i pazienti sono stati raggruppati sulla base del 50 e 75 percentile: Gruppo A, i pazienti aventi un picco di CD /L (n.48); Gruppo B i pazienti aventi un picco CD34 + compreso tra 70 e /L (n.24); Gruppo C: i pazienti aventi un picco CD34 + > /L (n.24). La caratterizzazione leucemica alla diagnosi comprendeva l analisi citogenetica e in 50 casi lo studio dell FLT3-ITD. 41 pazienti hanno effettuato un allotrapianto in 1a RC, 40 pazienti un autotrapianto in 1a RC mentre 15 pazienti o sono ricaduti prima di essere trapiantati o trapiantati non in 1a RC per varie cause. Sono stati valutati anche gli effetti prognostici del numero delle cellule CD34 + raccolte (n.70) e il numero delle cellule CD34 + infuse negli autotrapiantati con cellule staminali raccolte da sangue periferico (PBSC) (n.20). Risultati. Indipendentemente dal trattamento post remissionale ricevuto, il Gruppo A ha mostrato una sopravvivenza libera dalla malattia (DFS) del 73%, il Gruppo B una DFS del 51% e il Gruppo C del 30% (P=0.0003). Nel gruppo dei pazienti a citogenetica intermedia, quelli che hanno effettuato un trapianto autologo hanno mostrato una DFS nel gruppo A, B e C, rispettivamente, del 68%, 33% e 14% (P=0.01) mentre dopo trapianto allogenico la DFS è stata 87% nel Gruppo A+B contro 50% nel gruppo C (P=0.009). Nel gruppo a citogenetica intermedia i pazienti supermobilizzatori, così definiti quelli mostranti un picco di cellule CD34 + > a /L, hanno mostrato un alto tasso di ricaduta precoce, verificatasi entro i primi 6 mesi mentre erano in attesa del trapianto, infatti il tasso di ricaduta precoce era del 15% nel gruppo dei supermobilizzatori contro il 2% nel gruppo di tutti gli altri pazienti, (P=0.04). Tutti e tre i fattori CD34 dipendenti, picco di CD34 + nel sangue periferico, cellule CD34 + raccolte e numero di cellule CD34 + infuse, mostrano un valore prognostico per la DFS. Allo scopo di identificare tra le variabili CD34 dipendenti quale sia quella più importante in relazione alla DFS, abbiamo valutato simultaneamente i fattori CD34 dipendenti in analisi multivariata stepwise secondo il proportional hazard model di Cox. Solo il picco di CD34 + nel sangue periferico, studiato come variabile continua, è emerso come significativo per la DFS (P=0.004, RR=1.001) mentre il numero delle cellule CD34 + raccolte e il numero delle cellule CD34 + infuse non sono risultati significativi nel modello di Cox. Altri fattori non legati alla mobilizzazione delle cellule CD34 +, che sono risultati importanti per la DFS in analisi univariate, sono stati: età (P=0.10), rischio citogenetico sfavorevole (P=0.01), classificazione FAB M4-M5 (P=0.03) e mutazione FLT3-ITD (P=0.08). Quando tutti i fattori, CD34 dipendenti e CD34 ındipendenti, sono stati considerati in analisi multivariata di rischio proporzionale di Cox, il picco delle cellule CD34 + nel sangue periferico, considerato come variabile continua, è risultato l unico fattore ımportante per la DFS (P=0.0009, RR=1.001). Il valore predittivo del picco CD34 raggiunto durante la mobilizzazione è rimasto evidente anche quando sono stati selezionati solo i pazienti aventi alla diagnosi un fenotipo delle cellule leucemiche CD34 negativo. Conclusioni. Il picco delle cellule CD34 + raggiunto dopo il 1 ciclo di consolidamento è un potente e affidabile fattore prognostico nei pazienti LMA. Pazienti CD34 supermobilizzatori mostranti rischio citogenetico intermedio potrebbero meritare uno specifico approccio post-remissionale comprendente un immediato trapianto allogenico, condizionamento intensificato, e un rapido tapering dell immunosoppressione dopo il trapianto. Al contrario, pazienti a rischio citogenetico intermedio mostranti una cattiva capacità mobilizzante potrebbero avere una buona prognosi dopo trapianto autologo con cellule staminali periferiche o midollari. Il valore prognostico dell entità del picco CD34 è stato validato in ulteriori studi e comparato ad altri fattori prognostici noti come WT1, livelli di LAIP e marker molecolari di aggressività presenti all esordio. Le basi biologiche per queste osservazioni potrebbero riguardare la variabilità dell effetto chemio-protettivo delle cellule del microambiente sulle cellule ematopoietiche non leucemiche residue e ipotizziamo che questo effetto variabile potrebbe essere modulato dai livelli di cellule leucemiche MRD presenti in RC. Infine, mancano dati, nei pazienti pediatrici affetti da LAM, sul valore prognostico del picco CD34 raggiunto durante la mobilizzazione. Milone G, Poidomani M, Leotta S, Avola G, Camuglia MG, Privitera A, Consoli C, Mercurio S, Romeo MA, Di Marco A, Di Mercurio S, Spadaro A, Palumbo GA, Tedeschi P. Prognostic value of CD34+ peak in peripheral blood during mobilization in intermediate-risk AML patients treated in first CR by autologous or allogeneic transplantation. Bone Marrow Transplant Mar 14. [Epub ahead of print] Keating S, Suciu S, De Witte T et al. The stem cell mobilizing capacity of patients with acute myeloid leukemia in complete remission correlates with relapse risk: results of the EORTC-GIMEMA AML-10 trial. Leukemia 2003; 17: Feller N, Schuurhuis GJ, Van der Pol MA et al. High percentage of CD34-positive cells in autologous AML peripheral blood stem cell products reflects inadequate in vivo purging and low chemotherapeutic toxicity in a subgroup of patients with poor clinical outcome. Leukemia 2003; 17: Lee J, Lee MH, Park KW, Kang JH, IM DH, Kim K et al. Influential factors for the collection of peripheral blood stem cells and engraftment in acute myeloid leukemia patients in first complete remission. Int J Hematol 2005; 81: Ragusa M, Avola G, Angelica R, Barbagallo D, Guglielmino MR, Duro L et al. Expression profile and specific network features of the apoptotic machinery explain relapse of acute myeloid leukemia after chemotherapy. BMC Cancer 2010; 10: RICERCA DELLE BASI GENETICHE DEL NEUROBLASTOMA M. Capasso, G. Petrosino, F. Totaro, A. Iolascon Dipartimento di Biochimica e Biotecno - logie Mediche, Università di Napoli Federico II CEINGE Biotecnologie Avanzate, Italia Introduzione. Allo scopo di determinare l eziologia genetica del 99% dei casi di neuroblastoma sporadico, un importante malattia pediatrica che rappresenta circa il 15% della mortalità attribuibile ai tumori infantili, stiamo eseguendo uno studio di genomica su larga scala detto Genome-Wide Association Study (GWAS) che prevede l analisi di circa 550 mila single nucleotide polymorphisms (SNPs) su una popolazione di circa 5000 pazienti con neuroblastoma e controlli sani. Ipotizziamo che il neuroblastoma è una malattia genetica complessa e che la suscettibilità ad ammalarsi è legata all interazione di variazioni genetiche comuni che influenzano pathway critici per il normale sviluppo del sistema nervoso [Pediatric Reports 2011; 3:s1] [page 3]

6 simpatico. Abbiamo già ottenuto importanti risultati in un lasso di tempo relativamente breve; infatti, in un paio di anni abbiamo identificato diversi locus genetici nei cromosomi: 6p22 contenente i geni predetti FLJ22536 and FLJ44180 (Maris et al., N Engl J Med. 2008), 2q35 contenente il gene BARD1 (Capasso et al., Nat Genet. 2009) e 11p15.4 contenente il gene LMO1 (Wang et al., Nature 2010) che erano altamente associati con lo sviluppo del neuroblastoma e le sue forme più aggressive e ognuna di queste associazioni è stata poi replicata in altre popolazioni di diversa origine. In questo periodo stiamo applicando, ai dati di GWAS, specifici metodi statistici per individuare ulteriori siti genici associati a questa devastante malattia e ai suoi sottotipi clinici. Inoltre, sulla base dei risultati ottenuti, stiamo ora affrontando altri due importantissimi aspetti relativi alla genetica del neuroblastoma. Da una parte stiamo provando ad individuare, utilizzando i dati GWAS, quelle interazioni gene-gene che predispongono allo sviluppo del neuroblastoma e dall altra parte stiamo cercando di identificare, mediante sequenziamento di seconda generazione, mutazioni somatiche e varianti germinali che occorrono nella famiglia dei geni delle tirosin-chinasi che sono geni estremamente rilevanti nello sviluppo del cancro e importanti target terapeutici. Materiali e Metodi. GWAS del neuroblastoma. Questa parte del progetto è svolta in collaborazione con un gruppo americano al The Children s Hospital of Philadel - phia (USA). Campioni di DNA costituzionale di circa 2000 casi e 3000 controlli di origine caucasica e residenti in USA sono stati già genotipizzati per 550 mila SNPs, sparsi su tutto il genoma e che comprendono più del 90% della variabilità genetica, mediante gli arrays Illumina 550k. Per identificare varianti genetiche associate al neuroblastoma stiamo eseguendo le analisi utilizzando il software PLINK che contiene diverse metodi statistici specifici per gli studi GWAS. Interazioni genegene. Per individuare le interazioni genegene che sottostanno allo sviluppo del neuroblastoma stiamo utilizzando un approccio metodologico basato su analisi in silico e in vivo. Mediante l uso di 4 database pubblici (STRING, NCBI, MINT, UniHi) abbiamo svolto analisi bioinformatiche e abbiamo selezionato 83 proteine che risultano interagire con la proteina BARD1. Mediante l uso dei dati GWAS (1627 casi e 2572 controlli) e specifiche analisi basate su test parametrici (regressione logistica) e non parametrici (Multifactor Dimensionality Reduction, MDR) stiamo verificando se esistono interazioni statistiche, tra gli SNPs nel gene BARD1 e quelli localizzati nei geni codificanti per le 83 proteine selezionate, che predispongono all insorgenza del neuroblastoma. Le interazioni statistiche più significative saranno poi replicate in una popolazione italiana di circa 300 casi di neuroblastoma e 700 soggetti sani. Sequenziamento massiccio (high-throughput sequencing) dei geni codificanti le tirosin-chinasi. Per identificare le mutazioni somatiche causative dell inizio della tumorigenesi stiamo sequenziando i domini chinasici di 90 geni appartenenti alla famiglia delle tirosin-chinasi in DNA somatici e i corrispettivi DNA germinali estratti da 100 pazienti affetti da neuroblastoma. Per identificare, invece, le varianti genetiche predisponenti saranno sequenziati gli stessi geni in 20 DNA germinali estratti da soggetti sani. Per effettuare il sequenziamento massiccio stiamo utilizzando la piattaforma 454 GS FLX Titanium della Roche presente nel nostro Istituto CEINGE. Le mutazioni più frequenti e quelle predette essere causative saranno sottoposte a studi funzionali in vitro per verificare il loro reale coinvolgimento nella tumorigenesi. Risultati e Conclusioni. GWAS del neuroblastoma. Abbiamo analizzato un sottogruppo di 574 casi a basso rischio e 1722 controlli di origine statunitense. L analisi mostrava che i geni DUSP12, DDX4, IL31RA, HSD17B12 erano associati al neuroblastoma clinicamente categorizzato come low-risk. I segnali di associazione nei geni DUSP12 e HSD17B12 erano confermati in una popolazione italiana di 115 casi low-risk e 680 soggetti sani. Tutti i segnali di associazione avevano un p- value < nella popolazione americana e un p-value <0.05 in quella italiana. Questo studio dimostra che DUSP12, DDX4, IL31RA, and HSD17B12 sono geni di suscettibilità per l insorgenza del neuroblastoma con particolare rilevanza per quelli a basso rischio e supporta l idea che variazioni genetiche comuni nel genoma umano possono predisporre non solo ad una particolare malattia ma anche a sottogruppi della malattia clinicamente rilevanti, dimostrando, quindi, l importanza dell utilizzo dei dati fenotipici negli studi GWAS. Interazioni genegene. Le analisi di interazioni statistiche sono state effettuate sui dati GWAS di 1627 casi e 2572 controlli tra 23 SNPs di BARD1 e 657 SNPs dei 83 geni bioinformaticamente selezionati. Le interazioni dei geni UBE2D3 e PTN con BARD1 risultavano essere le più significative. UBE2D3 (ubiquitin-conjugating enzyme E2D 3) è un enzima coinvolto nel processo di ubiquitinazione insieme al complesso BRCA1/BARD1; infatti, è riportato essere facente parte del pathway "BARD1 signaling events" (Pathway Interaction Database). PTN (pleiotrophin) è indicato come fattore neurotrofico ed è stato ampiamente dimostrato che la sua elevata espressione genica è fortemente associata ai neuroblastomi con prognosi favorevole. Questo studio ha una rilevante importanza nel capire come le interazioni proteiche possono avere un ruolo nelle malattie genetiche complesse e in particolare nei tumori. Sequenziamento massiccio (high-throughput sequencing) dei geni codificanti le tirosin-chinasi. Stiamo allestendo gli esperimenti di sequenziamento e selezionando bioinformaticamente tutte le regioni genomiche codificanti per i domini chinasici dei 90 geni che dovranno essere poi sottoposti a sequenziamento massiccio in DNA estratti dal tessuto tumorale e sangue periferico di 100 pazienti affetti da neuroblastoma e in DNA costituzionali di 20 controlli sani. Supponiamo di ottenere i primi risultati nel mese di giugno I risultati di questo studio potranno condurre ad una migliore comprensione degli eventi genomici e genetici che sono coinvolti nello sviluppo del neuroblastoma e a caratterizzare i suoi fenotipi complessi. Dato che le tirosin-chinasi sono considerate potenziali target farmacologici, i risultati di questo progetto potrebbero avere un enorme rilevanza per la salute dei bambini e portare allo sviluppo di terapie personalizzate. In conclusione, è ragionevole credere che, sulla base dei risultati ottenuti, questi studi forniranno una significativa conoscenza sulle mutazioni somatiche e variazioni comuni del DNA che causano questo importante cancro infantile. Tutto ciò avrà rilevanti implicazioni nella scoperta di meccanismi molecolari che sono alla base del neuroblastoma e nello sviluppo di terapie più efficaci. Ringraziamenti. Si ringrazia Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Associazione Oncologia Pediatrica e Neuroblastoma (OPEN) e Associazione Italiana per la Lotta al Neuroblastoma per il loro supporto finanziario che ci permette di portare avanti la nostra ricerca. TP53 E MISMATCH REPAIR PRO- CESS NEI TUMORI CEREBRALI PEDIATRICI DI ORIGINE GLIALE S. Mascelli, 1 A. Raso1, P. Nozza, 2 K. Sak, 3 M. Tamme, 3 S. Pignatelli, 4 C. Milanaccio, 4 M. Ravegnani, 1 A. Consales, 1 G. Piattelli, 1 M. Pavanello, 1 A. Cama, 1 V. Capra, 1 M.L. Garrè 4 1 U.O. Neurochirurgia, Istituto Giannina Gaslini, 2 U.O. Anatomia Patologica, Istituto Giannina Gaslini, 3 Asper Biotech Company,Tartu - Estonia, 4 U.O. Neuro- Oncologia, Istituto G. Gaslini, Genova, Italia Introduzione. Le neoplasie cerebrali di [page 4] [Pediatric Reports 2011; 3:s1]

7 origine gliale hanno la più alta incidenza tra i tumori intracranici pediatrici 1 e comprendono una vasta gamma che va da forme più benigne ad altre con un comportamento aggressivo e maligno, distinte in quattro gradi di malignità secondo la tradizionale classificazione internazionale WHO. 2 Lo studio delle caratteristiche molecolari di queste neoplasie ha portato all individuazione di diversi pathways, coivolti sia nei processi di tumorigenesi che nell evoluzione prognostica dei gliomi ed ha fornito importanti indicazioni per individuare strategie terapeutiche innovative. Tra le anomalie genetiche riscontrate, la frequenza di mutazione nel gene TP53 e nei geni coinvolti nel mismatch repair process (MMR), quali hmlh1, hmsh2, hmsh6, e hpms2, 3 rimane tutt ora dibattuta. Sulla base di questa premessa, abbiamo eseguito un analisi mutazionale di tali geni su 75 tumori gliali (WHO I-IV) collezionati esclusivamente presso l Istituto Giannina Gaslini (IGG) di Genova. I casi sono stati altresì indagati per il comune polimorfismo g.215g>c in, 4 sembra essere correlato ad una maggiore suscettibilità tumorale. Materiali Metodi. Abbiamo analizzato 75 campioni di DNA tumorale isolato da tessuto fresco crio-conservato presso la Bio-Banca dell Istituto. L analisi mutazionale dei geni candidati è stata effettuata utilizzando un chip di sequenziamento e d analisi di polimorfismi sviluppato da Asper Biotech Ltd, Tartu, Estonia. La tecnologia utilizzata è quella del tipo arrayed primer extension (APEX). 5 Risultati. Sette diverse mutazioni somatiche sono state individuate (g.337t>c; 390_392delCAA; g.524g>a; g.536 A>T; g.704a>g; g.734g>t; g.818g>a) due delle quali (g.337t>c; 390_392delCAA) mai segnalate precedentemente nei tumori cerebrali pediatrici. Le mutazioni sono presenti nel 10% dei tumori: tre negli astrocitomi pilocitici (PA), una in un astrocitoma anaplastico (AA), due nei glioblastomi (GBL) ed una in un oligoastrocitoma anaplastico (OAA). Un caso particolare di GBL presenta due alterazioni distinte che interessano rispettivamente gli esoni 5 (g.734g>t) e 7 (390_392delCAA). Nessuna mutazione è emersa negli astrocitomi fibrillare (FA) e nei casi di ganglioglioma desmoplastico infantile (DIG) analizzati. Una delle due nuove mutazioni (g.337t>c), presente in due PA, provoca la sostituzione di un residuo altamente conservato di fenilalanina con una leucina. Tale alterazione è stata unicamente segnalata come mutazione somatica in tumori della cute e della vescica e non è mai stata rinvenuta come mutazione germinale. La seconda nuova mutazione (390_392delCAA), presente in un GBL, non è mai stata segnalata in letteratura. In sintesi, sei su sette alterazioni genetiche individuate sono considerate deleterie per il corretto funzionamento della proteina p53 (TP53 database IARC; http: www-p53.iarc.fr), fatta eccezione per la sostituzione g.704a>g considerata neutra. Inoltre, le frequenze genotipiche del polimorfismo g.215g>c nei tumori risultano distribuite in base all'equilibrio di Hardy-Weinberg e sono statisticamente differenti (P<0,5) da quelle degli individui di controllo CEU (http: Infine, l analisi mutazionale dei geni hmlh1, hmsh2, hmsh6, e hpms2 ha permesso d identificare esclusivamente una singola mutazione nel gene hmlh1 presente in eterozigoti in un caso di AA. Si tratta di una delezione di 3 nucleotidi che determina la perdita dell aminoacido lisina (K) in posizione 618. Conclusioni. In questo studio abbiamo identificato due nuove mutazioni in TP53: 1) g.337t>c, presente in due PA e 2) 390_392delCAA trovato in un GBL. Questi dati espandono lo spettro di mutazione in TP53 ed arricchiscono la nostra conoscenza delle relazioni genotipo-fenotipo, dovuta a mutazioni TP53, nei gliomi cerebrali. In conclusione, i nostri risultati sono complementari ed espandono i precedenti studi sui glomi suggerendo un possibile ruolo patogenetico di TP53 nell alterazione genica e nell instabilità del genoma. L anomala distribuzione delle frequenze genotipiche di g.215g>c nei tumori rispetto alla popolazione di controllo CEU lascia supporre una possibile associazione tra tale polimorfismo ed un aumento di suscettibilità ai tumori cerebrali ma, ci riserviamo di ripetere l analisi su una più ampia casistica. Inoltre, la scarsità di mutazioni in hmlh1 suggerisce che alterazioni del MMR potrebbero essere coinvolte indirettamente ed in associazione con altre anomalie genetiche nella regolazione della patogenesi dei gliomi. 1. Kaatsch P,et al. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. (2010) 36(4): D.N.Louis, et al. WHO Classification of tumours of the central nervous system, IARC, Lyon, Pollack IF, et al Children's Oncology Group. Mismatch repair deficiency is an uncommon mechanism of alkylator resistance in pediatric malignant gliomas: a report from the Children's Oncology Group. Pediatr Blood Cancer. (2010);55(6): Parhar P, et al. Possible association of p53 codon 72 polymorphism with susceptibility to adult and pediatric highgrade astrocytomas. Brain Res Mol Brain Res. (2005);137(1-2): Kurg, A, et al. Arrayed primer extension: solid-phase four color DNA resequencing and mutation detection technology. Genet. Test. (2000);4:1-7. CORRELAZIONE TRA CARATTERI- STICHE CLINICO-PATOLOGICHE ED ESPRESSIONE GENICA NEI TUMORI PEDIATRICI DI ORIGINE GLIALE S. Mascelli, 1 A. Raso, 1 P. Nozza, 2 R. Biassoni, 3 A. Rossi, 4 V. Capra, 5 A. Cama, 5 M.L. Garrè, 6 A. Verri 7 1 U.O. Neurochirurgia, Istituto G. Gaslini, Genova; U.O. Anatomia Patologica, Istituto G. Gaslini, Genova; 3 U. di Medicina Molecolare, Istituto G. Gaslini, Genova; 4 U. di Neuroradiologia, Istituto G. Gaslini, Genova; 5 U.O. Neurochirurgia, Istituto G. Gaslini, Genova; 6 U.O. Neuro-Oncologia, Istituto G. Gaslini, Genova; 7 DISI, Università di Genova, Italia Introduzione. I tumori primari del SNC costituiscono un gruppo eterogeneo di malattie rappresentanti la più comune tipologia di tumore solido dell infanzia con un incidenza di circa 7/100,000 casi all anno. 1 Le neoplasie di origine gliale hanno la più alta incidenza tra i tumori intracranici e comprendono una vasta gamma che va da forme più benigne ad altre con un comportamento aggressivo e maligno, distinte in quattro gradi di malignità secondo la classificazione internazionale WHO. 2 Alla principale caratterizzazione su base istologica, se ne aggiungono altre in base alla localizzazione del tumore (infratentoriale, sopratentoriale, del tronco, del nervo ottico e spinale) al potenziale di crescita e di invasività, alla tendenza alla progressione e al decorso clinico. L'età alla diagnosi e l associazione con sindromi su base ereditaria costituiscono, altresì, importanti fattori che influenzano sia la strategia di trattamento che la prognosi. Infatti, i bambini sotto l anno di età mostrano, per ragioni ancora controverse, una prevalenza di tumori più aggressivi a prognosi infausta. 3 Inoltre, numerose neoplasie congenite sono associate ad anomalie genetiche e si inseriscono in un quadro sindromico familiare associato ad un aumento del rischio di insorgenza di tumore. Nonostante la grande quantità di studi molecolari, volti ad acquisire conoscenze sulla patogenesi dei gliomi, abbiano riportato l'esistenza di markers molecolari legati sia al sito di lesione intracranica che all eterogeneità istotipica del tumore, 4,5 rimane ancora da analizzare in dettaglio la correlazione genotipo-fenotipo. Pertanto, rispetto ad altri tipi di tumori cerebrali pediatrici, le informazioni sulle anomalie genetiche associate sia alla formazione che alla progressione delle neoplasie gliali sono [Pediatric Reports 2011; 3:s1] [page 5]

8 ancora insufficienti. Scopo della presente ricerca sarà quello di studiare 80 casi di tumori gliali comprensivi di diverse istologie, collezionati presso l ospedale pediatrico Giannina Gaslini dal 1990 ad oggi, utilizzando un approccio multidisciplinare (neuroradiologico, neurochirurgico, neuropatologico, neurooncologico e genetico-molocolare). In particolare, saranno utilizzate tecniche di indagine molecolare per realizzare una correlazione genotipo-fenotipo. Grazie a questo approccio, ci proponiamo d identificare specifici profili d espressione genica relativi ai processi di insorgenza e progressione dei glomi nei bambini e di correlare tali alterazioni con l'istologia, l'imaging, la presentazione clinica e la risposta ai trattamenti terapeutici. Materiali Metodi. La tecnologia del RNAmicroarray ad alta densità costituirà il metodo di riferimento, grazie al quale i profili trascrizionali delle diverse istologie tumorali potranno essere paragonati. Le procedure standardizzate, già utilizzate per ottenere i risultati preliminari, saranno applicate sugli 80 casi. I dati d espressione provenienti dagli arrays saranno, successivamente, confermati e convalidati tramite qpcr. La lista di geni candidati che ne deriverà, sarà poi sottoposta ad analisi epigenetica tramite Pyrosequencing ed i risultati saranno confermati sia sulla casistica tumorale che su controlli sani tramite sequenziamento diretto. Inoltre, in considerazione delle recenti evidenze in materia di regolazione d espressione di geni/proteine, valuteremo l'espressione di mirna utilizzando la tecnologia dei microarray. Risultati preliminari. Abbiamo eseguito un analisi d espressione genica su 60 casi di gliomi pediatrici utilizzando la tecnologia del microarray. I dati preliminari mostrano un sottoinsieme distintivo di profili d espressione tra i gliomi a basso grado (LGG) che, potrebbero rappresentare possibili marcatori genetici per queste entità. Inoltre, abbiamo rilevato un diverso profilo d espressione tra gli Astrocitomi Pilocitici (PA), l istotipo più frequente tra i LGG, particolarmente legato alla sede d insorgenza. Le alterazioni molecolari riscontrate riguardano geni associati ai meccanismi di comunicazione cellulare, d adesione focale e geni coinvolti nei processi morfogenetici e di differenziazione dei diversi distretti cerebrali. (articolo in pubblicazione). Dai nostri risultati preliminari emergono differenti profili molecolari tra i LGG, in relazione all istologia, alla sede di lesione e al decorso clinico: pertanto, sembra possibile poter realizzare una classificazione dei diversi casi anche in funzione di queste caratteristiche. Tuttavia, la rilevanza clinica di tale stratificazione molecolare non è ancora del tutto nota, in particolar modo per quei casi (circa il 10%) che esulano dal comune decorso benigno e tendono a recidivare e/o disseminare. 1 Di conseguenza, ulteriori studi di genetica molecolare sulle neoplasie gliali ed un confronto tra diversi istotipi sono necessari al fine di definire le caratteristiche biologiche di tali tumori per realizzare una più fine classificazione istologica, volta a migliorare gli strumenti diagnostici e a poter predire il decorso clinico della neoplasia. Conclusioni. La presente proposta mira a rappresentare un ampio progetto di ricerca sulla casistica pediatrica di gliomi, seguiti all'ospedale G. Gaslini dal 1990 ad oggi, avvalendosi di un approccio multimodale e multidisciplinare che va dalla diagnosi alla chirurgia, alle terapie oncologiche. I principali obiettivi di tale studio consistono in: 1) estendere l'analisi d espressione genica a 80 gliomi considerando i diversi siti di lesione cerebrale, con particolare attenzione a quei casi che mostrano una tendenza a diffondere e/o a recidivare; 2) identificare le caratteristiche genetiche responsabili dei processi patogenetici nei glomi e correlarle con le variabili cliniche, quali: l età d esordio della malattia (identificare un cut-off), il sito di lesione, decorso clinico e trattamenti terapeutici utilizzati; 3) eseguire un accurata analisi immunoistochimica al fine d identificare nuovi potenziali marcatori delle cellule gliali; 4) analizzare i casi associati a sindromi genetiche (sclerosi tuberosa, neurofibromatosi 1, sindrome di Turcot e sindrome di Li-Fraumeni); 5) confrontare i diversi istotipi tumorali (ganglioglioma e/o ependimoma) al fine di valutare se i tumori gliali condividono un intrinseca, specifica firma molecolare riflettente altresì il sito cerebrale ove la lesione ha avuto origine. 1. Kaatsch P,et al. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. (2010) 36(4): D.N.Louis, et al. WHO Classification of tumours of the central nervous system, IARC, Lyon, (2007). 3. Colosimo C, et al. in: Simonetti G et al (eds) Trattato italiano di Risonanza Magnetica. Napoli: Idelson-Gnocchi, (1998): Sharma MK, et al. Distinct genetic signatures among pilocytic astrocytomas relate to their brain region origin. Cancer Res. (2007) 67(3): Paugh BS, et al. Integrated molecular genetic profiling of pediatric high-grade gliomas reveals key differences with the adult disease. J Clin Oncol. (2010) 28(18): GENETICA MOLECOLARE ED EPIDE- MIOLOGIA DELL ANEMIA CONGENI- TA DISERITROPOIETICA DI TIPO II R. Russo, 1,2 M.R. Esposito, 1,2 A. Gambale, 1 A. Troiano, 1 R. Asci, 1 I. De Maggio, 1,2 U. Ramenghi, 3 G.L. Forni, 4 S. Perrotta, 5 A. Iolascon, 1,2 1 CEINGE Biotecnologie Avanzate, Napoli, Italia; 2 Dipartimento di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Università Fede - rico II, Napoli, Italia; 3 Unità di Ematologia, Dipartimento di Pediatria, Università di Torino, Italia; 4 Centro della Microcitemia e Anemie Congenite, Ospedale Galliera, Genova, Italia; 5 Dipartimento di Pediatria, Seconda Università di Napoli, Italia Introduzione. Le anemie congenite diseritropoietiche (CDA) sono disordini genetici ereditari caratterizzati da eritropoiesi inefficace, in cui si assiste alla paradossale associazione di iperplasia eritroide, riscontrabile a livello del midollo osseo, e stato anemico con reticolocitopenia. La forma di tipo II, la più frequente tra tutte le CDA, si manifesta con anemia di grado variabile, ittero e splenomegalia; il sovraccarico di ferro è una comune complicanza negli individui affetti, determinando l insorgenza di cirrosi epatica in circa il 20% dei pazienti. Im - portanti chiavi diagnostiche sono fornite dalle peculiari aberrazioni morfologiche riscontrate negli eritroblasti dei pazienti affetti. La diagnosi, inoltre, si avvale del contributo dell analisi biochimica, mediante la quale è possibile l identificazione dell ipoglicosilazione a carico di proteine, principalmente la banda 3 a livello della membrana plasmatica dei globuli rossi, che è patognomonica della patologia. Questa anomalia ha, da tempo, suggerito la presenza di un difetto nel traffico vescicolare alla base della patogenesi della CDA II. A sostegno di tale ipotesi, nel 2009 è stato identificato il gene causativo SEC23B, 1 codificante per un componente del complesso COP II, coinvolto nel trasporto anterogrado delle proteine neosintetizzate dal reticolo endoplasmatico al Golgi. L estensiva analisi molecolare dei pazienti ci ha consentito di (i) definire l esistenza di una correlazione genotipo-fenotipo, ovvero l osservazione che pazienti portatori del genotipo composto da una mutazione missenso e una nonsenso tendono a produrre una manifestazione clinica più grave rispetto a quelli con 2 mutazioni missenso, 2 di (ii) ampliare lo spettro di mutazioni ad oggi identificato e di (iii) affinare la diagnosi molecolare, definendo la frequenza delle mutazioni in ogni esone. 3 La CDA II è caratterizzata da una elevata eterogeneità allelica; ad oggi sono, infatti, note 53 diverse mutazioni causative nel gene SEC23B, 3 descritte in [page 6] [Pediatric Reports 2011; 3:s1]

9 86 casi, 47 dei quali di origine italiana. Nel nostro ultimo lavoro abbiamo ampliato la coorte di pazienti (109) con 17 casi Italiani e 6 Europei non Italiani (NIE). Il nostro scopo è stato quello di caratterizzare la distribuzione allelica in Italia delle mutazioni del gene SEC23B, paragonandola a quella riscontrata nei casi internazionali. Abbiamo così dimostrato che due mutazioni, E109K e R14W, descrivono circa il 54% di tutti i pazienti in Italia e, mediante analisi di aplotipi, che entrambe sono mutazioni fondatrici (Russo, in sottomissione). Tale osservazione potrebbe spiegare la frequenza relativamente elevata della CDA II nella popolazione italiana. 4,5 Materiali e metodi. Sequenziamento del gene SEC23B e valutazione della frequenza allelica relativa delle mutazioni. L analisi molecolare dei pazienti CDA II è stata effettuata mediante sequenziamento genomico diretto delle regioni codificanti, delle giunzioni fiancheggianti i siti di splicing nonché delle regioni 5 - e 3 - non tradotte del gene SEC23B. I campioni di sangue sono stati raccolti dopo l'approvazione da parte dei comitati etici locali. Il consenso scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti secondo la Dichia - razione di Helsinki. La frequenza allelica relativa delle mutazioni è stata valutata su tutti i pazienti ad oggi descritti (64 Italiani e 45 non Italiani). Selezione dei marcatori polimorfici e analisi degli aplotipi. L analisi degli aplotipi è stata realizzata utilizzando polimorfismi di singolo nucleotide (SNP). Sono stati scelti 12 tag-snp (r 2 >0.8), distribuiti su circa 1.2 Mb a ridosso del gene SEC23B. L analisi degli aplotipi è stata realizzata su 31 casi Italiani e 6 NIE. Sono stati analizzati anche 47 individui di controllo non affetti, di origine italiana. Stima dell età delle mutazioni. L età approssimativa di entrambe le mutazioni, R14W e E109K, è stata calcolata mediante l utilizzo del programma DMLE+ versione 2.3. Per la prima mutazione, R14W, ci siamo avvalsi dell analisi degli aplotipi condotta su 23 pazienti Italiani che presentavano la mutazione in stato di eterozigosi; per la seconda, E109K, sono stati analizzati gli aplotipi di 8 pazienti Italiani, tutti omozigoti per la stessa. Risultati. Valutazione della frequenza allelica relativa delle mutazioni. Come già descritto in precedenza 2,3 2 sono le mutazioni più comuni nei pazienti CDA II, E109K (28%) e R14W (26%): in particolar modo, esse descrivono oltre la metà dei casi di origine italiana. Tuttavia, mentre la frequenza relativa della mutazione E109K è simile sia in Italia che nel resto d'europa (e la mutazione è diffusa anche in Ebrei Marocchini), quella della R14W è significativamente più alta in Italia (26.3% vs 10.7%). Analisi degli aplotipi ed età delle mutazioni. L analisi degli aplotipi condotta su 23 pazienti Italiani con genotipo R14W, ha evidenziato che il 47.2% condivide un comune aplotipo (CACACCGC). Per la mutazione E109K sono stati analizzati 8 pazienti Italiani e altrettanti NIE. Tale analisi ha mostrato che quasi tutti i pazienti (96.4%) condividono un comune aplotipo (CATAGT); lo stesso è stato identificato anche in 3 pazienti Ebrei Marocchini. L età stimata per la mutazione E109K nella popolazione italiana è di 2000 anni, mentre per la R14W è di Conclusioni. Sebbene la maggior parte delle mutazioni nel gene SEC23B sia il risultato di eventi sporadici ed indipendenti, 4 mutazioni (R14W, E109K, R497C, I318T) descrivono più del 50% degli alleli mutati. Nel nostro ultimo lavoro, abbiamo fornito una spiegazione dell elevata prevalenza della CDA II in Italia. Infatti, la prevalenza cumulativa di CDA I e CDA II, recentemente stimata, mostra un picco di 2.49 casi/milione proprio in Italia. 4 Il calcolo della frequenza allelica relativa di tutte le mutazioni causative finora identificate, eseguito su 64 pazienti Italiani e 45 non Italiani, ha portato all osservazione che due mutazioni, E109K e R14W, descrivono più della metà dei casi in Italia. L analisi di aplotipi ha poi suggerito per entrambe il ruolo di mutazioni fondatrici in Italia. La variante E109K risulta essere maggiormente diffusa in tutta Europa, nonché nella popolazione degli Ebrei Marocchini. La nostra ipotesi è che tale mutazione possa aver avuto origine in Medio Oriente ( anni fa) e che poi si sia diffusa nel bacino del Mediterraneo all epoca di Cesare Augusto, nel periodo di massimo splendore dell'impero Romano. A differenza della precedente, la R14W è maggiormente ricorrente nei pazienti Italiani quando paragonati a quelli Europei non Italiani; essa si sarebbe originata in seguito ad un evento mutazionale verificatosi 2600 anni fa, probabilmente nel Sud Italia. In quel tempo gran parte del Sud Italia era una colonia greca, la Magna Graecia. Già in precedenza è stata, infatti, osservata una prevalenza maggiore di questa malattia in Italia meridionale e nel bacino del Mediterraneo. 5 I nostri dati supportano completamente questa osservazione: infatti, l 81% dei pazienti portatori della mutazione R14W, qui analizzati, provengono dall Italia centrale e meridionale. Tale osservazione potrebbe spiegare la frequenza relativamente elevata della CDA II nella popolazione italiana. Ringraziamenti. Questo studio è stato sostenuto dal Ministero Italiano dell'università e della Ricerca (PRIN 2008, PI: A. Iolascon), dal progetto Telethon GGP09044 (PI: A. Iolascon), da sovvenzioni MUR-PS /Ind e da finanziamenti della Regione Campania (DGRC 1901/2009). 1. Schwarz K, Iolascon A, Verissimo F, et al. Mutations in the human secretory COPII coat component SEC23B cause congenital dyserythropoietic anemia type II (CDA II). Nat Gen 2009;41: Iolascon A, Russo R, Esposito MR, et al. Molecular analysis of forty two CDA II patients: new mutations in the SEC23B gene. Search for a genotype-phenotype relationship. Haematologica 2010;95: Russo R, Esposito MR, Asci R, et al. Mut - ational spectrum in congenital dyserythropoietic anemia type II: identification of 19 novel mutations in SEC23B gene. Am J Hematol 2010;85: Heimpel H, Matuschek A, Ahmed M, et al. Frequency of congenital dyserythropoietic anemias in Europe. Eur J Haematol 2010;85: Iolascon A, Servedio V, Carbone R, et al. Geographic distribution of CDA-II: did a founder effect operate in Southern Italia? Haematologica 2000;85: RISPOSTA UMORALE ANTI-ALK E MALATTIA MINIMA RESIDUA NEL LINFOMA ANAPLASTICO A GRANDI CELLULE (ALCL) PEDIATRICO L. Mussolin, M. Pillon, G. Franceschetto, S. Buffardi, 1 A Lombardi, 2 A. Sala, 3 A. Zanazzo, 4 G Arcamone, 5 A. Garaventa, 6 M Arico, 7 A. Rosolen Clinica di Oncoematologia Pediatrica, Azienda Ospedaliera-Universita di Padova, Padova; 1 Ospedale Pausilipon, Napoli; 2 Ospedale Bambino Gesu, Roma; 3 Clinica Pediatrica, Ospedale S. Gerardo, Monza; 4 Dipartimento di Pediatria, Uni - versita di Trieste, Trieste; 5 Unita di 6 Ematologia Pediatrica, Istituto Gaslini, Genova; 7 Clinica di Oncoematologia Pe - diatrica, Ospedale Meyer, Firenze, Italia Introduzione. Il linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL) è stato descritto per la prima volta nel 1985 da Stein e collaboratori come una nuova entità patologica le cui cellule sono caratterizzate dall espressione dell antigene di membrana Ki-1 o CD L incidenza di questa neoplasia varia significativamente tra la popolazione pediatrica e adulta: l ALCL rappresenta circa il 2% dei linfomi non Hodgkin (LNH) nell adulto, mentre costituisce circa il 15% dei LNH pediatrici. Gli ALCL mostrano un ampio spettro di caratteristiche morfologiche che va da neoplasie composte da cellule di piccola taglia, a casi tipici in cui la popolazione neoplastica è costituita da voluminose cellule anaplastiche, ed infine a casi in cui prevalgono le cellule giganti. Dal punto di vista genetico circa il 70% dei [Pediatric Reports 2011; 3:s1] [page 7]

10 casi sono caratterizzati dalla traslocazione cromosomica t(2;5)(p23;q35), con una prevalenza di circa il 95% in età pediatrica. Questa aberrazione cromosomica coinvolge sul cromosoma 5 il gene NPM, che codifica per la proteina ubiquitaria nucleofosmina, e sul cromosoma 2 il gene ALK. La nucleofosmina è una proteina che si localizza a livello nucleolare e che sembra coinvolta nell assemblaggio ribosomale con funzione di trasporto. Il gene ALK codifica per un recettore tirosin-chinasico che viene espresso a livello del sistema nervoso. La traslocazione porta alla formazione sul cromosoma derivativo 5 di un gene di fusione NPM-ALK attivo dal punto di vista trascrizionale. L attività trasformante e oncogenica della proteina chimerica è stata dimostrata. 2,3 Essa è inoltre un antigene tumore-associato (TAA) capace di indurre un immunità umorale anti-alk in vivo in pazienti affetti da ALCL. 4 Gli obiettivi della nostra ricerca sono stati la caratterizzazione molecolare dei linfomi anaplastici a grandi cellule diagnosticati e trattati all interno del protocollo europeo ALCL-99, mediante RT-PCR; la valutazione prospettica della presenza di Malattia Minima Residua (MMR) all esordio e allo stop terapia mediante PCR qualitativa (RT-PCR) e quantitativa (Real- Time PCR) per determinare la cinetica della risposta al trattamento ed infine determinare la presenza di anticorpi anti-alk alla diagnosi ed allo stop terapia, valutando se esiste una correlazione tra la presenza di anticorpi anti-alk e la MMR. Materiali e Metodi. La determinazione di anticorpi anti-alk è stata eseguita alla diagnosi ed allo stop terapia, su plasma di pazienti con ALCL, mediante un saggio immunocitochimico. Il numero di copie di trascritto NPM-ALK presenti nel sangue periferico alla diagnosi è stato valutato mediante RT-PCR e Real-Time PCR. Risultati. Abbiamo analizzato 47 biopsie di ALCL pediatrici e tutte sono risultate positive per NPM-ALK in RT-PCR. Il sottotipo morfologico prevalente era la variante classica (26/47). Lo studio di MMR è stato condotto sul sangue periferico dei 47 pazienti; 28 sono risultati positivi (59%) in RT-PCR e 23/47 (49%) in Real-Time PCR. I risultati dell analisi univariata sulla Sopravvivenza Libera da Recidiva o progressione (RFS) mostrano, in una proiezione a 3 anni, una percentuale di sopravvivenza, dell 88% (±6%) per i pazienti con un numero di copie di NPM-ALK/ ABL nel sangue periferico all esordio inferiore a 10 e del 60% (±11%) per i pazienti con un numero di copie uguale o superiore a 10, P= Allo stop terapia 4/47 risultavano ancora positivi. L 89% dei pazienti ha inoltre presentato una positività anticorpale anti- ALK. Dall analisi ROC è emerso che il valore soglia del titolo anticorpale più predittivo di recidiva è 1/750. La RFS a 3 anni è risultata del 30% (±14%) per i pazienti con numero di copie di NPM- ALK nel sangue periferico uguale o superiore a 10 e titolo anticorpale uguale o inferiore a 1/750 e dell 88% per tutti gli altri pazienti (P<0.0001). Conclusioni. dall analisi multivariata condotta nel nostro studio è emerso che la combinazione di MMR e titolo anticorpale anti-alk è l'unico parametro in grado di selezionare una sottopopolazione di pazienti con prognosi significativamente peggiore. Tali pazienti potrebbero beneficiare di un diverso trattamento terapeutico, inclusa la vaccino-terapia. 1. Stein H, Mason DY, Gerdes J et al. The expression of the Hodgkin s disease associated antigen Ki-1 in reactive and neoplastic lymphoid tissue: evidence that Reed-Sternberg cells and histiocytic malignancies are derived from activated lymphoid cells. Blood 1985; 66: Fujimoto J, Shiota M, Iwahara T et al. Characterization of the trasforming activity of p80, a hyperphosphorilated protein in a Ki-1 lymphoma cell line with chromosomal translocation t(2;5). Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: Kuefer MU, Look AT, Pulford K et al. Retrovirus-mediated gene transfer of NPM-ALK causes lymphoid malignancy in mice. Blood 1997; 90: Pulford K, Falini B, Banham AH, et al. Immune response to the ALK oncogenic tyrosine kinase in patients with anaplastic large-cell lymphoma. Blood, 2000; CARATTERIZZAZIONE BIOLOGICA DEI LINFOMI LINFOBLASTICI PEDIATRICI DELLA LINEA T: DIFFERENZE E SIMILARITA CON LA LEUCEMIA LINFOBLASTICA T L. Mussolin, 1 K. Basso, 1, 2 A. Lettieri, 3 M. Brahmachary, 4 W.K. Lim, 4 A. Califano, 4 G. Basso, 1 A. Biondi, 3 G. Cazzaniga, 3 A. Rosolen 1 1 Dipartimento di Pediatria, Università di Padova, Padova, Italia; 2 Institute for Cancer Genetic, Columbia University, New York, NY, USA; 3 Centro Ricerca Tettamanti, Università Milano-Bicocca, Ospedale San Gerardo, Monza, Italia; 4 Joint Centers for Systems Biology, Columbia University, New York, NY, USA Introduzione. Il termine linfoma linfoblastico è stato coniato da Barcos e Luke per la similarità riscontrata tra le cellule tumorali di linfoma ed i blasti della leucemia linfoblastica acuta (LLA). 1 I linfomi linfoblastici T (LL-T), che originano dai linfociti T del timo, rappresentano circa un terzo dei Linfomi Non-Hodgkin dell età pediatrica; al contrario, i LL a cellule della linea B sono poco frequenti. Molte sono le analogie tra LL-T e LLA-T: oltre alla morfologia e all immunofenotipo indistinguibili, le due malattie presentano anche le stesse caratteristiche genetiche (traslocazioni cromosomiche che coinvolgono fattori trascrizionali). La principale discriminante clinica tra LL-T e LLA-T riguarda la presentazione di malattia, con presenza di massa mediastinica nel LL-T ed infiltrazione massiva del midollo osseo nella LLA-T. Operativamente, la percentuale di cellule tumorali nel midollo osseo distingue LL- T (<25%) da LLA-T ( 25%). Rispetto alla LLA-T, il LL si manifesta in pazienti di età media maggiore, con un picco di incidenza nella seconda decade di vita; inoltre mostra una prevalenza nei maschi rispetto alle femmine (rapporto 2:1). Le elevate analogie cliniche suggeriscono che LL- T e LLA-T possano costituire presentazioni (o evoluzioni) diverse di un unica entità biologica e che possano beneficiare della stessa terapia. In genere, le neoplasie emopoietiche con fenotipo T presentano una prognosi più severa rispetto a quelle che originano da precursori delle cellule B. L utilizzo in questi ultimi anni di trattamenti chemioterapici specifici per gruppo di rischio ha significativamente aumentato la probabilità di guarigione di pazienti sia con LL-T che LLA-T, passando da una Event-Free Survival del 50% al 70%. 2,3 Tuttavia poco si conosce in merito agli aspetti biologici dei LL e quindi sul ruolo che alcune caratteristiche genetiche potrebbero avere sulla prognosi. Recentemente è stato dimostrato che più del 50% delle LLA-T del bambino presenta mutazioni attivanti del gene NOTCH1, 4 indicando un ruolo centrale dei segnali trasmessi dal gene stesso nella patogenesi delle LLA-T. Non è noto se mutazioni del gene NOTCH1 sono anche presenti in LL-T e se tali mutazioni hanno un impatto prognostico nei pazienti portatori. Tali mutazioni causano un attivazione del gene NOTCH1 ed aumentano l attivazione proteolitica della proteina da esso codificata, un evento che richiede l intervento dell enzima γ-secretasi. È stato dimostrato in vitro che gli effetti delle mutazioni a livello del gene NOTCH1 vengono repressi utilizzando inibitori specifici della γ- secretasi, che potrebbero quindi essere utilizzati in futuro come farmaci specifici per patologie caratterizzate da mutazioni attivanti il segnale di NOTCH1. Studi clinici sono in corso per verificare questa ipotesi. Il presente studio ha come scopo principale l analisi di aspetti biologici e genetici che caratterizzano i LL-T, al fine di individuare marcatori molecola- [page 8] [Pediatric Reports 2011; 3:s1]

11 ri con significato prognostico. Mediante l analisi integrata di SNP e gene expression array, sono stati confrontati il genotipo e l espressione genica di una serie di pazienti affetti da LL-T e da LLA-T, con lo scopo di meglio caratterizzare analogie e differenze tra le due patologie. Materiali e Metodi. Le analisi del genotipo e del profilo di espressione genica di 20 biopsie tumorali di LL-T e 10 aspirati midollari all esordio di LLA-T sono state eseguite mediante tecnologia Affymetrix: i) Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 oligonucleotide microarrays, e Affymetrix GeneChip Human Mapping 100K SNP arrays. L analisi mutazionale di NOTCH1 è stata eseguita al livello degli esoni 26, 27 e 34 utilizzando PCR Expand Long Template Kit (Roche). Risultati. Lo studio ha messo in evidenza che il LL-T e la LLA-T condividono la gran parte del profilo di espressione genica, tuttavia una piccola quota di geni (78) appaiono differenzialmente espressi. In particolare geni coinvolti nella chemiotassi e nell angiogenesi, come EPAS1 e PTPRB, risultano up-regolati nei LL-T. Inoltre geni già noti per essere espressi nei tumori solido con metastasi linfonodali sono risultati up-regolati nelle biopsie di LL-T. L analisi genotipica è stata condotta utilizzando 3 algoritmi diversi: PartekGS, CRMA e CNAG. Nel complesso sono state individuate 42 regioni con alterazioni del numero di copie (22 amplificazioni, 20 delezioni) in almeno due pazienti. L aberrazione più comune è risultata essere la delezione dei geni CDKN2A/B a livello del cromosoma 9. Sono state rinvenute inoltre aberrazioni solo esclusivamente nei campioni di LL-T o LLA-T. La correlazione di Spearman è stata utilizzata per stabilire la relazione tra i risultati ottenuti dall analisi del genotipo e del profilo di espressione genica. Più del 38% dei geni testati mostravano una correlazione positiva (Rho 0.3) e solo il 3.2% una correlazione negativa. L analisi mutazionale di NOTCH1 ha evidenziato la presenza di mutazioni in 7/11 casi di LL-T e 4/7 casi di LLA-T. L analisi del genotipo è stata rivalutata sulla base dello stato mutazionale di NOTCH1; abbiamo trovato che alcune aberrazioni cromosomiche come l amplificazione di alcune regioni del cromosoma 1 e 5p sono tipiche solo dello stato non mutato di NOTCH1, e viceversa delezioni della regione 6q solo dello stato mutato. Conclusioni. I dati ottenuti mostrano che il LL-T e la LLA-T rappresentano due entità biologiche distinte con peculiari caratteristiche genetiche e di espressione genica e solo la conoscenza completa di queste anomalie potrà permetterci di disegnare protocolli terapeutici più mirati ed efficaci nella cura di queste neoplasie. 1. Thomas DA and Kantarjian HM. Lymphoblastic lymphoma. In: Advances in the treatment of adult acute lymphocytic leukemia-part II. Hematology/Oncology Clinics of North America, Vol 15 (1), Feb 2001: Amylon MD, Shuster J, Pullen J, et al. Intensitive high-dose asparaginase consolidation improves survival for pediatric patients with T cell acute lymphoblastic leukaemia and advanced stage lymphoblastic lymphoma: a Pediatric Oncology Group study. Leukemia. 1999; 13: Reiter A, Scharappe M, Ludwig WD et al. Intensive ALL-type therapy without local radiotherapy provides a 90% event-free survival for children with T- cell lymphoblastic lymphoma: a BFM group report. Blood 2000; 95: Weng AP, Ferrando AA, Lee W, Morris JP 4th, Silverman LB, Sanchez-Irizarry C, Blacklow SC, Look AT, Aster JC. Activating mutations of NOTCH1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia. Science Oct 8;306(5694): IL SISTEMA SLEEPING BEAUTY: MODIFICAZIONE GENETICA TRA- SPOSONE- MEDIATA DI CELLULE T PRIMARIE PER L IMMUNOTERAPIA DELLE LEUCEMIE ACUTE G.M.P. Giordano Attianese, 1,2 H.Huls, 2 V.Marin, 1 S. Tettamanti, 1 A. Biondi, 1 L. Cooper, 2 E. Biagi 1 1 Centro di Ricerca Matilde Tettamanti, Dipartimento di Pediatria, Universita degli Studi Milano-Bicocca, Ospedale San Gerardo, via Pergolesi 33, 20052, Monza, Italia; 2 M.D.Anderson Cancer Center, CooperLab, 7455 Fannin, SCR1.2212, Houston, TX 77054, USA Introduzione. L introduzione stabile di trans-geni terapeutici in cellule T umane puo essere ottenuta sia mediante metodi virali che attraverso sistemi non-virali. Nonostante l uso di virus ricombinanti clinical grade si sia dimostrato altamente efficiente nella moficazione genica di cellule primarie, la sua applicabilita ad ampio spettro presenta diversi svantaggi tra cui il costo estremamente elevato di produzione in condizioni clinical grade e la propensione ad un pattern di integrazione non random, possibile causa sia di mutagenesi inserzionale che di silenziamento del gene terapeutico.1 La applicazione ex-vivo del trasferimento genico mediato da trasposoni (elementi mobili presenti naturalmente all interno del genoma), offre ad oggi una valida alternativa all uso di vettori virali, presentando diversi vantaggi: 1 il DNA plasmidico puo essere prodotto in larga scala in condizioni clinical grade, a costi ridotti e con basso grado di immunogenicita;1 le dimensioni del transgene sono meno limitate poichè il DNA non viene incluso in un capside virale; inoltre, perchè il plasmide venga integrato, non è necessaria una previa attivazione delle cellule T, riducendo la manipolazione ex-vivo che condiziona il fenotipo e la funzionalita delle cellule T modificate. Per quanto riguarda il pattern di integrazione, questo puo essere efficientemente incrementato mediante la coespressione di un enzima Transpotasi iperattivo insieme al Trasposone. Il sistema Sleeping Beauty (SB) è un esempio di un metodo basato sui trasposoni, che è stato adattato per la terapia genica nell uomo. 2 Le cellule T rappresentano un target ideale per valutare l applicabilita nell uomo del sistema SB in quanto sono state geneticamente modificate sia attraverso metodi virali 3 che mediante metodi non-virali 4 per differenti approcci terapeutici. 1 Un transgene candidato per l inserzione trasposizionale è un recettore chimerico (CAR) specifico per un antigene tumore associato (CD19), in grado di dirigere l attivita delle cellule T verso un antigene di superficie espresso dalle cellule di leucemia linfoblastica acuta. Materiali e Metodi. Vengono preparati di PBMC per ogni reazione ed allestita la soluzione di DNA plasmidico: 2.5 μg di Traspotasi e 7.5 μg di Trasposone per ogni di PBMC (il rapporto vettori Transpotasi:Trasposone è pari a 1:3) in 100 µl di buffer specifico per la nucleofectione. I PBMC, risospesi nella soluzione di DNA plasmidico/buffer AMAXA, vengono aliquotati nella cuvetta di elettroporazione. I PBMC vengono piastrati nel medium di elettroporazione (RPMI 1640 Fenolo free + 2 mm Glutamax 1+20% Siero bovino fetale inattivato a caldo) per 2-3 ore. Dopo questa incubazione le cellule vengono piastrate in medium completo, alla concentrazione di cellule/ml e lasciate riposare a 37 C al 5% CO 2 per 24 ore. Il giorno successivo all elettroporazione i PBMC vengono contati, caratterizzati fenotipicamente e stimolati in accordo con la percentuale di espressione del CAR ad un rapporto Effettore:Target (E:T) pari a 1:2, in presenza di IL21 (30νg/mL). Il target è rappresentato da cellule presentanti l antigene artificiali (aapcs) 1 che oltre ad esprimere l antigene specifico per il CAR (CD19), presentano diverse molecole costimolatorie quail CD86, CD137L ed una variante della citochina IL15 legata alla membrana. Le cellule T vengono cosi stimolate e monitorate settimanalmente. A partire dalla seconda stimolazione insieme alla IL21 viene supplementata IL2 a 50U/mL. 1 Risultati. Al fine di valutare l efficienza del metodo SB, nella modificazione genica di [Pediatric Reports 2011; 3:s1] [page 9]

12 cellule T primare mediante l introduzione di un recettore chimerico anti-cd19, PBMC derivati da donatore sano sono stati transfettati con i plasmidi SB trasposoni CD19/ζ/28, e traspotasi SB11X. A ventiquattro ore dalla nucleofezione l efficienza media di transfezione misurata come percentuale di cellule CD3+Fc+ è pari a 28% (range 14-49%, n=4) e la percentuale media di sopravvivenza delle cellule trasfettate è pari a 26% (range 10-41%, n=4). Le cellule sono state quindi stimolate con aapcs in rapporto E:T pari 1:2. Al giorno +14 è il fold increase medio delle cellule T totali è pari a 8 (range 4-20, n=4); il fold increase medio delle cellule CD3+Fc+ è pari a 21 (range 2-67, n=4). I risultati delle analisi citofluorimetriche dimostrano che sia le cellule CD4+ che le cellule CD8+ esprimono il transgene CD19.CAR e l espressione si dimostra stabile nel tempo (D+0 CD4+Fc+ 22%- CD8+Fc+ 9.8%; Day+14 CD4+Fc+ 18%- CD8+Fc+ 10%, n=4). È stato eseguito il fenotipo memoria delle cellule T al fine di valutare l effetto della stimolazione antigenica mediato dall uso di aapcs, sul profilo effettore-memoria delle cellule T CD19.CAR+. Le analisi citofluorimetriche dimostrano a seguito di due stimolazioni (D+14) mediante aapcs 1:2 E:T Ratio, la percentuale di cellule Central Memory, espressa come CD45RA-CD62L+ è significativamente aumentata rispetto ai valori iniziali (D+0) (media 34%, range 32-39%, n=3, D+14; media 7%, range 4-12%, n=3, D+0, P<0.05, rispettivamente). Allo stesso modo le percentuali di cellule effettrici e terminalmente differenziate misurate come CD45RA-CD62L- e CDRA+CD62Lsono significativamente diminuite (CD45RA-CD62L- media 6%, range 1-12, n=3, D+14; media 21%, range 17-23, n=3, D+0, P<0.05 rispettivamente e CDRA+CD62L- media 7%, range 4-10%, n=3, D+14; media 27%, range 25-30%, n=3, D+0, P<0.05). La percentuale di cellule T Naive, misurata come popolazione CD45RA+CD62L+, non presenta variazioni significative ai time points analizzati (dati non riportati). Conclusioni. I nostri dati preliminari mostrano che il sistema SB è un efficiente strumento per la modificazione genica di cellule T primarie umane a scopo terapeutico. Sebbene l efficienza di nucleofezione sia mediamente minore di quella riportata utilizzando virus ricombinati, l opportuna stimolazione con APCs artificiali è in grado di selezionare le cellule CD19.CAR+, con valori elevati fold increase, preservando ed arricchendo allo stesso tempo la componente T memoria, superando uno dei grossi limiti legati all estesiva manipolazione delle cellule T ex vivo, quale la differenziazione terminale e l esaurimento funzionale delle cellule T effettrici. 1. Hackett PB, Largaespada DA and Cooper LJN. (2010) Mol Ther 18(4): Izsvak S, Hackett PB, Cooper LJN and Ivics Z. (2010) Bioeassay 32: Ciceri, F, Bonini, C, Stanghellini et al. (2009) Lancet Oncol 10: Till, BG, Jensen, MC, Wang et al. (2008)Blood 112: MONITORAGGIO IMMUNOLOGICO DI PAZIENTI AFFETTI DA GVHD GRAVE (II-IV) RESISTENTE ALLO STEROIDE TRATTATI CON CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI (MSC) P. Vinci, 1 E. Dander, 1 G. Lucchini, 2 M. Introna, 3 S. Bonanomi, 2 A. Balduzzi, 2 G. Gaipa, 1,4 P. Perseghin, 5 * F. Masciocchi, 1 C. Capelli, 6 J. Golay, 6 A. Algarotti, 3 A. Rambaldi, MD, 3 A. Rovelli, MD, 2 A. Biondi, 1,2 E. Biagi, 2,4 G. D Amico, 1 1 Centro di Ricerca M. Tettamanti, Università degli studi di Milano-Bicocca, Monza, Italia; 2 Dipartimento di Ematologia Pediatrica, Ospedale S. Gerardo, Monza, Italia; 3 Dipartimento di Ematologia Adulta, Ospedali Riuniti di Bergamo, Bergamo, Italia; 4 Laboratorio di Terapia Cellulare "Stefano Verri", Ospedale S. Gerardo, Monza, Italia; 5 Unità di Aferesi, Ospedale San Gerardo, Monza, Italia; 6 Laboratorio di Terapia Cellulare "G. Lanzani", Dipartimento di Ematologia, Ospedali Riuniti Bergamo, Bergamo, Italia Introduzione. Negli ultimi anni è emerso come l utilizzo delle MSC rappresenti un valido strumento terapeutico per il trattamento delle forme gravi di GvHD. Purtroppo, a causa della drammatica mancanza di dati generati nei modelli animali, il meccanismo d azione con cui le MSC esplicano la loro azione antiinfiammatoria non è noto. Allo scopo di comprendere i meccanismi con cui le MSC esercitano il loro effetto nel controllo della GvHD e di individuare nuovi marcatori diagnostici e predittivi la risposta alla terapia, abbiamo affiancato alla valutazione del quadro clinico del paziente trattato con MSC il monitoraggio delle sottopopolazioni T-linfocitarie CD4+ e il dosaggio di un pannello di marcatori proinfiammatori (TNFRI, IL-2Rα ed elafin). Materiali e Metodi. Al fine di comprendere l effetto immunomodulatorio delle MSC, abbiamo studiato a livello del sangue periferico dei pazienti arruolati diversi marcatori plasmatici di GvHD e sottopopolazioni linfocitarie CD4+, prima dell infusione e dopo 7, 14 e 28 giorni la terapia cellulare. Il nostro studio, mostra i risultati ottenuti in seguito al monitoraggio immunologico di 10 pazienti affetti da GvHD resistente allo steroide, i quali hanno ricevuto dosi multiple di MSC third party. La GvHD si è presentata in 6 casi in forma acuta ed in 4 in forma cronica. Risultati. In seguito alla terapia con MSC, 2 pazienti hanno mostrato una risposta completa (CR), 4 una risposta parziale (PR), mentre 4 non hanno risposto alla terapia (NR). Abbiamo dimostrato come la concentrazione plasmatica di TNFRI e di IL-2Rα, nei pazienti con GvHD acuta e cronica prima delle infusioni di MSC sia significativamente maggiore rispetto a quella riscontrata nei donatori sani. Dopo il trattamento con MSC si assiste nei pazienti CR ad una robusta e persistente riduzione dei livelli plasmatici di tali marcatori, che diventano pari o inferiori a quelli riscontrati nei donatori sani. Tale andamento è osservabile anche per elafin, marcatore plasmatico di GVHD cutanea. In particolare, 28 giorni dopo la terapia, i livelli di TNFRI diminuiscono di circa 2 volte, mentre elafin diminuisce di 2.3 volte. Nei pazienti PR si apprezzano riduzioni di tali valori nei giorni +7 e +14, dove il quadro clinico è in miglioramento; mentre al peggioramento di quest ultimo si apprezzano rialzi dei marcatori. Nei pazienti NR si rilevano valori invariati o superiori a quelli preterapia. È stato inoltre analizzato l andamento di sottopopolazioni linfocitarie CD4+ con opposta funzione: le cellule Th1 e Th17, che hanno attività proinfiammatoria e Treg ad attività immunosoppressiva. Nei pazienti CR si osserva una riduzione sia dei Th1 che dei Th17, accompagnata da un incremento dei Treg, con diminuzione dei rapporti Th1/Treg e Th17/Treg. Nei pazienti PR si osserva un debole aumento dei Treg dopo l infusione delle MSC, accompagnato però da percentuali di Th1 e Th17 stabili o in aumento. Nei pazienti NR osserviamo valori persistentemente elevati di Th1 e Th17. In accordo alla riduzione delle cellule Th1 nel sangue periferico di pazienti CR, abbiamo osservato una riduzione significativa della concentrazione plasmatica di IFNγ, il quale raggiunge i livelli tipici dei donatori sani. Conclusioni. Come si evince dal monitoraggio immunologico, le MSC sembrano essere in grado di ripristinare nei pazienti CR l alterata omeostasi tra fattori proinfiammatori ed antinfiammatori, caratteristica dei pazienti con GvHD, riconvertendo così il background immunologico del paziente verso uno stato più fisiologico. La correlazione dei dati forniti dai marcatori con quelli forniti dal monitoraggio dei linfociti non solo supporta la bontà delle nostre osservazioni, ma rap- [page 10] [Pediatric Reports 2011; 3:s1]

13 presenterà, se convalidata da un numero maggiore di pazienti trattati, un nuovo pannello di marcatori diagnostici-prognostici su cui valutare la gravità della GvHD e la possibilità di modulare il trattamento con MSC in base alla previsione della risposta clinica a quest ultimo. APPROCCI DI DOCKING MOLECOLA- RE NELLO SVILUPPO ED ATTIVITÀ DI NUOVI INIBITORI DELLA CASEI- NA CHINASI 2 (CK2) NEI TUMORI PEDIATRICI G. Cozza, 1,2 A. Gianoncelli, 1 P. Bonvini, 3,4 E. Zorzi, 4 A. Rosolen, 4 L. Pinna, 2 F. Meggio, 2 G. Zagotto, 1 S. Moro 1 1 Molecular Modeling Section (MMS), Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Padova, Padova, Italia; 2 Dipartimento di Chimica Biologica, Università di Padova, Padova, Italia; 3 Fondazione Città della Speranza, Malo, Vicenza; 4 Clinica di Oncoematologia Pediatrica, Azienda Ospedaliera-Univer - sità di Padova, Padova, Italia Similarità chimica e screening virtuale sono concetti di base della chemioinformatica che giocano un ruolo importante nella previsione delle proprietà di un composto chimico, della sua attività e dell affinità verso un determinato target biologico. Quello che oggi è conosciuto come drug discovery, e che comprende tutti quei processi che portano allo sviluppo di una nuova molecola, fa sempre più uso di metodiche computazionali per l identificazione di composti attivi con definiti profili di attività, e quando il target è noto approcci di docking molecolare e di diffrattometria a raggi X risultano necessari per predire e risolvere la struttura 3D. In questo modo abbiamo identificato un nuovo inibitore della casein chinasi 2 (CK2), 4-bromo-3,8-dihydroxybenzo[c]chromen-6-one (22), dopo ottimizzazione chimica dell Urolitina A e validazione della sua affinità per CK2. Casein chinasi 2 è una serin/treonin chinasi ubiquitaria ed essenziale per la sopravvivenza cellulare. Con più di 300 molecole bersaglio CK2 regola ciclo cellulare, apoptosi, trascrizione e infezione virale, e la sua espressione nei tumori è strettamente associata alla progressione tumorale e alla chemioresistenza. La sua inibizione risulta in una rapida induzione dell apoptosi in vitro, attraverso l attivazione di p53 e l inibizione di AKT, e in una potente attività antitumorale in vivo. Se confrontato con inibitori competitivi di CK2, quali l acido ellagico (Ki = 20 nm) e il 3,8-dibromo-7-hydroxy-4-methylchromen-2-one (DBC, Ki = 60 nm), il composto da noi sintetizzato risulta più potente (Ki = 7 nm) e selettivo (i.e., nck μM; nck1 27 μm; GSK3β >40 μm; Aurora 39μM) dei precedenti, ed è in grado di inibire proliferazione e sopravvivenza in diversi modelli cellulari tumorali pediatrici di origine solida o ematopoietica. Il nostro studio dimostra l efficacia di 4- bromo-3,8-dihydroxy-benzo[c]chromen- 6-one e Urolitina A nell inibire la proliferazione [MTT 13%, 200μM (22)] e sopravvivenza cellulare [AV %, 200 μm (22)] di cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL) e linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL), e nel ridurre l attività in vitro di CK2 e l effetto sulla trasduzione del segnale (AKTSer129). Nelle medesime condizioni sperimentali 4-bromo- 3,8-dihydroxy-benzo[c]chromen-6-one (22) e Urolitina A sono moderatamente attivi nelle cellule non-trasformate, sia in termini di attività che di affinità per CK2, indicando quindi l importanza di questa chinasi nell omeostasi cellulare dei modelli tumorali utilizzati. In conclusione, questo studio dimostra che l impiego di metodiche computazionali nella progettazione di nuovi farmaci può essere considerato un valido approccio di ricerca e sviluppo anche nei tumori pediatrici quando sia noto il target biologico. REGOLAZIONE DELL ESPRESSIONE E FUNZIONE DI NPM-ALK NEL LIN- FOMA ANAPLASTICO A GRANDI CELLULE: ANALISI MUTAZIONALE DEL COMPLESSO NPM-ALK/HSP90 ED IMPLICAZIONE SULLA STABILITÀ PROTEICA. P. Bonvini, 1,2 E. Zorzi, 2 L. Mussolin, 1,2 G. Cozza, 3 S. Moro, 3 A. Rosolen 2 1 Fondazione Città della Speranza, Malo, Vicenza, Italia; 2 Clinica di Oncoema - tologia Pediatrica, Azienda Ospedaliera- Università di Padova, Padova, Italia; 3 Molecular Modeling Section (MMS), Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Padova, Padova, Italia Tra le modificazioni posttraslazionali importanti per l attività di molte proteine coinvolte nei meccanismi di insorgenza tumorale, la fosforilazione risulta critica per la regolazione dell attività e dell espressione proteica, sia quando coinvolga motivi catalitici che strutturali. Fosforilazione e auto-fosforilazione influiscono rispettivamente su funzione e attivazione di molte chinasi oncogene, compresa NPM-ALK nel linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL), sebbene questo risulti in una maggiore instabilità e rischio di degradazione. Per alcune di queste il mantenimento dell attività funzionale è garantito dall interazione con una proteina nota come Hsp90 (heat shock 90 kda protein), attraverso il riconoscimento di specifici motivi idrofobici del dominio catalitico. Questo studio ha valutato la possibilità che l attività chinasica di NPM- ALK influenzi l associazione con Hsp90, e quindi la stabilità proteica, e quali residui e/o domini aminoacidici siano coinvolti in questi fenomeni. A tale scopo, delezioni amino- e carbossi-terminali sono state introdotte nella sequenza del gene di NPM-ALK, così come mutazioni puntiformi sono state inserite nel sito di legame dell ATP e nel dominio di attivazione. Espressione, attività e affinità per Hsp90 dei mutanti creati sono state quindi valutate in presenza o assenza di inibitori competitivi di NPM-ALK e Hsp90, in cellule di ALCL o in cellule non tumorali. I dati ottenuti dimostrano che NPM-ALK, quando fosforilato (NPM-ALKWT), è in grado di legare stabilmente Hsp90, modificando morfologia ed espressione proteica sia in linee cellulari tumorali che non neoplastiche. Per contro, quando inattivo (NPM- ALKK210A) o mancante dell intero dominio catalitico (NPM-ALKΔ ) NPM- ALK non viene riconosciuto da Hsp90 e risulta fortemente instabile sia in condizioni fisiologiche che in presenza di inibitori di Hsp90. In particolare, il legame di NPM-ALK con Hsp90 sembra dipendere dallo stato di fosforilazione del dominio di attivazione (Tyr338/342/343), dal momento che quando reso inattivo, deleto o mutato (NPM-ALKY338/342/343A) NPM- ALK non è più in grado di legare Hsp90. Nelle stesse condizioni sperimentali, l associazione con Hsc70 e Hsp72, due chaperone molecolari coinvolti più nella maturazione e/o nella degradazione che nell attività di NPM-ALK, non cambia e risulta indipendente dallo stato mutazionale e funzionale di NPM-ALK, sia in condizioni fisiologiche che di stress cellulare. In conclusione, i nostri risultati suggeriscono che l attività catalitica di NPM-ALK rende la proteina fortemente instabile, ma favorisce l associazione con Hsp90, che ne previene la degradazione. Hsp90 mantiene NPM-ALK in uno stato costitutivamente attivo e stabile, influenzando la capacità trasformante di NPM-ALK molto più di quanto sino ad ora ipotizzato. ESPRESSIONE ED ATTIVITÀ DI HSP72 NEGLI ALCL PEDIATRICI: CONSEGUENZE SU SOPRAVVIVEN- ZA E RESISTENZA ALLO STRESS P. Bonvini, 1,2 E. Zorzi, 2 L. Mussolin, 1,2 M. Pillon, 2 C. Romualdi, 3 E. D Amore, 4 L. Lamant, 2 A. Rosolen 2 1 Fondazione Città della Speranza, Malo, Vicenza, Italia; 2 Clinica di Oncoemato - logia Pediatrica, Azienda Ospedaliera- Università di Padova, Padova, Italia.; 3 Dipartimento di Scienze Statistiche, [Pediatric Reports 2011; 3:s1] [page 11]

14 Università di Padova, Padova, Italia; 4 Dipartimento di Anatomia Patologica, Ospedale San Bortolo di Vicenza, Vi - cenza, Italia; 5 INSERM, U. 563, Centre of Physiopathology Toulouse-Purpan, Tou - louse, France, University Paul-Sabatier, Toulouse, France L identificazione dei meccanismi che controllano la resistenza cellulare allo stress è fondamentale per comprendere come i tumori sviluppino resistenza alla terapia, che spesso dipende dalla capacità di ridurre il danno intracellulare mediante il mantenimento dell omeostasi proteica. Proteine note come heat shock protein (HSP) in condizioni normali regolano sintesi e maturazione della maggior parte delle proteine funzionali e strutturali, mentre in condizioni di stress proteggono dalla denaturazione e dalla degradazione proteica, preservando le cellule dall apoptosi. L anomala espressione delle HSP, ed in particolare di Hsp72 (heat shock 72 protein), è frequente in diversi tipi di tumori, ed è strettamente associata alla chemioresistenza e alla capacità metastatica delle cellule neoplastiche. In questo studio abbiamo valutato l espressione di Hsp72 in pazienti con Linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL, n=31), e la sua attività anti-apoptotica in linee cellulari di ALCL (n=5) caratterizzate dalla presenza o assenza dell oncogene NPM-ALK. A tale scopo tecniche di immunoistochimica, RT-PCR, espressione genica e proteica sono state applicate per valutare sintesi, espressione ed attività di Hsp72, in condizioni normali di crescita o in cellule sottoposte a stress, in funzione dell attività di NPM-ALK. I risultati ottenuti dimostrano che i livelli di Hsp72 sono significativamente più elevati nei tumori che esprimono NPM-ALK (P=<0.001), in particolare in quelli con outcome sfavorevole, unitamente alla capacità delle cellule ALK-positive di indurre in vitro l espressione di Hsp72 quando sottoposte a stress (ipertermia) o trattamento farmacologico. L induzione di Hsp72 inibisce attivazione ed esecuzione dell apoptosi, e favorisce la sopravvivenza cellulare in condizioni di stress o dopo trattamento con inibitori del proteosoma. In queste condizioni, Hsp72 si associa ed inibisce proteine coinvolte nel mantenimento dell omeostasi mitocondriale (Bax, citocromo c), e previene l esecuzione dell apoptosi. L inibizione funzionale di NPM-ALK riduce sintesi ed espressione costitutiva o indotta di Hsp72 in cellule di ALCL, ristabilendo la sensibilità farmacologia propria delle cellule che non esprimono Hsp72. Nei tumori e nelle linee cellulari di ALCL che non esprimono NPM-ALK, Hsp72 risulta debolmente espressa, non viene indotta in condizioni di stress e non influisce sulla sopravvivenza cellulare. Questo studio descrive per la prima volta l espressione differenziale di Hsp72 nei tumori e nelle linee cellulari di ALCL, e il suo coinvolgimento nei meccanismi anti-apoptotici regolati da NPM-ALK. Studi prospettici sono in corso per valutare la possibilità che Hsp72 possa rappresentare un bersaglio terapeutico negli ALCL, ed per definire i possibili benefici che la sua inibizione possa portare in trattamenti combinati mirati. UN CLASSIFICATORE BASATO SULL IPOSSIA PREDICE LA PROGNOSI DEI PAZIENTI DI NEUROBLASTOMA P. Fardin, 1 A. Cornero, 1 M. Acquaviva, 1 F. Blengio, 1 M.L. Belli, 1 R. Luksch, 2 A. Di Cataldo, 3 C. Gambini, 4 R. Haupt, 5 A. Garaventa, 6 L. Varesio 1 1 Laboratorio di Biologia Molecolare, IRCCS Gaslini, Genova; 2 Divisione di Oncologia Pediatrica, Istituto Nazionale Tumori, Milano; 3 Dipartimento di Ematologia e Oncologia Pediatrica, Poli - clinico Universitario, Catania; 4 U.O. Anatomia Patologica, IRCCS Gaslini, Genova; 5 Servizio di Epidemiologia e Biostatistica, IRCCS Gaslini, Genova; 6 U.O.C. Ematologia e Oncologia Pedia - trica, IRCCS Gaslini, Genova, Italia Introduzione. Il neuroblastoma, il tumore solido pediatrico più diffuso, è caratterizzato da una forte eterogeneità sia dal punto di vista istologico che clinico. Sono noti numerosi fattori di rischio clinicomolecolari associati alla prognosi. Tra questi quelli più comunemente usati nella stratificazione dei pazienti in classi di rischio sono l età alla diagnosi, lo stadio, l amplificazione del gene MYCN, l istologia e le alterazioni cromosomiche. 1 Nonostante i grandi sforzi compiuti nell ambito della ricerca e nel miglioramento dei trattamenti nella pratica clinica, permane la necessità di identificare nuovi marcatori prognostici in grado di valutare in modo più accurato la classe di rischio di appartenenza del paziente. L ipossia, ovvero la condizione di bassa tensione di ossigeno caratteristica dei tessuti poco vascolarizzati, è un fenomeno presente in condizioni patologiche quali l infiammazione e il cancro. 2 L ipossia è associata alla progressione tumorale e, nella maggior parte dei casi, è correlata ad una cattiva prognosi del paziente oncologico. 3 L identificazione di biomarcatori in grado di stimare lo stato ipossico di un tessuto tumorale risulta quindi essere di grande importanza sia per la definizione della classe di rischio del paziente, sia per lo sviluppo di protocolli terapeutici antiipossia. Recentemente abbiamo generato una signature genica dell ipossia (NBhypo) composta da 32 geni in grado di suddividere in maniera significativa una coorte di pazienti di neuroblastoma in accordo con lo stato ipossico dei loro tumori. Tale signature si è dimostrata essere un fattore di rischio indipendente. 4 Lo scopo di questo lavoro è quello di sviluppare un classificatore basato sulla NBhypo in grado di predire la prognosi dei pazienti di neuroblastoma. Materiali e metodi. Sono stati analizzati i profili di espressione genica di 182 pazienti di neuroblastoma rappresentativi di una popolazione eterogenea per la composizione in stadi, età alla diagnosi ed amplificazione del MYCN. Previa normalizzazione dei dati di espressione, i 182 campioni sono stati suddivisi in due gruppi utilizzati rispettivamente nelle fasi di allenamento (100 pazienti) e validazione (82 pazienti) del classificatore prognostico. Il modello di classificazione utilizzato è il Multilayer Perceptron (MLP), una rete neurale artificiale (ANN) con paradigma di apprendimento feed-forward. Il modello è stato allenato per predire la prognosi del paziente in base ai dati di espressione dei geni dell NB-hypo di 100 pazienti, utilizzando una validazione incrociata di tipo leave-one-out. Dopo aver allenato il modello, si è passati alla fase di validazione sul dataset indipendente formato da 82 pazienti. Per valutare l arricchimento di geni/processi ipossici nei pazienti con predizione di prognosi negativa, è stata effettuata un analisi dei profili di espressione con lo strumento bioinformatico GSEA (Gene Set Enrich - <ment Analysis). In questa analisi sono stati valutati per l arricchimento 51 set di geni correlati con il fenomeno dell ipossia. Una validazione alternativa dello stato ipossico è rappresentata dalle colorazioni di immunoistochimica di campioni di pazienti con cattiva prognosi e pazienti con buona prognosi. I campioni sono stati colorati per identificare la presenza dei marcatori CAIX, VEGF e HIF2alpha, marcatori universali dell ipossia del tessuto. Risultati. Nella fase di allenamento il classificatore basato sull NB-hypo ha predetto correttamente 63/70 pazienti con buona prognosi e 21/30 pazienti con cattiva prognosi, raggiungendo un accuratezza globale dell 82%. Il classificatore, così generato, è stato poi applicato al gruppo indipendente di 82 pazienti per la validazione esterna. In questo caso l accuratezza del classificatore è salita all 87% e ciò implica un errore di classificazione del 13%. I risultati ottenuti con il classificatore generato sono stati poi confrontati con i valori di specificità e sensibilità ottenuti suddividendo il gruppo di pazienti di vali- [page 12] [Pediatric Reports 2011; 3:s1]

15 dazione in due sottogruppi in accordo con 3 dei fattori di rischio comunemente utilizzati (età alla diagnosi, amplificazione di MYCN e stadio INSS). Nessuno dei fattori di rischio considerati è stato in grado di raggiungere i risultati ottenuti dal nostro classificatore. La suddivisione dei pazienti operata dal nostro classificatore è stata ulteriormente valutata utilizzando delle curve Kaplan-Meier che hanno dimostrato una significativa segregazione dei pazienti (P<0.0001). Nella successiva fase di analisi, è stato valutato il grado di associazione tra le predizioni ottenute dal classificatore basato su NB-hypo e lo stato di amplificazione di MYCN, lo stadio INSS e l età alla diagnosi in modo da evidenziare eventuali tendenze nelle prestazioni del classificatore. Questa analisi ha dimostrato che le predizioni ottenute sono indipendenti dagli altri fattori di rischio considerati ad eccezione dello stadio INSS. Infatti, il classificatore predice con un accuratezza del 100% i pazienti appartenenti agli stadi 1, 2, 3 e 4s. In questo gruppo di pazienti sono presenti quattro casi la cui prognosi sarebbe stata predetta erroneamente utilizzando i comuni fattori di rischio. Lo stato ipossico dei tumori localizzati dei pazienti con cattiva prognosi è stato ulteriormente confermato dalle colorazioni immunoistochimiche. L espressione di alcuni tipici biomarcatori dell ipossia nei tessuti (CAIX, VEGF e HIF2alpha) è stata valutata in campioni di tessuto di pazienti con cattiva e buona prognosi. Nei tumori dei pazienti con cattiva prognosi e predetti correttamente dal nostro classificatore ci sono estese aree di colorazione per tutti i marcatori usati, mentre tale positività non si riscontra nei campioni di pazienti con buona prognosi. Questi risultati confermano, ad un livello qualitativo, che pazienti predetti con cattiva prognosi presentano in realtà tumori ipossici. L ultima parte dell analisi è stata dedicata a valutare se l origine dell errore di classificazione fatto per il 13% dei pazienti fosse dovuto a quei tumori che pur essendo caratterizzati da un alto grado di ipossia non implicassero l esito infausto del paziente oppure a tumori poco ipossici ma comunque abbastanza aggressivi da comportare il decesso del paziente. Per valutare questa ipotesi i profili di espressione dei pazienti erroneamente classificati sono stati analizzati tramite il programma GSEA. GSEA permette di valutare il grado di arricchimento di set di geni predefiniti in base ai processi biologici ed alla letteratura. Nel nostro caso sono stati utilizzati 51 set di geni caratteristici della risposta all ipossia. I risultati ottenuti mostrano un arricchimento significativo per 25 dei suddetti set di geni nei pazienti erroneamente predetti come aventi cattiva prognosi mentre nessun set risulta arricchito nei rimanenti pazienti. Questo risultato dimostra l efficacia del classificatore nell identificare lo stato ipossico nel neuroblastoma e come l ipossia sia un importante fattore di rischio per questo tumore. Conclusioni. Abbiamo generato un classificatore basato sul profilo di espressione genica dell NB-hypo in grado di predire la prognosi dei pazienti di neuroblastoma con un errore molto basso. Inoltre abbiamo dimostrato che il nostro classificatore predice in modo rigoroso la prognosi dei pazienti con tumore localizzato e con stadio 4s. In particolare, il classificatore è efficace nel predire la prognosi di quei pazienti appartenenti alle classi di rischio intermedie e per cui i fattori di rischio tradizionali avrebbero segnalato prognosi errate. Questo classificatore è liberamente disponibile e può essere utilizzato per valutare lo stato di rischio di qualunque nuovo tumore di cui sia disponibile il profilo di espressione genica. L analisi del 13% dei casi classificati in modo erroneo rivela che il classificatore è un forte indicatore dello stato ipossico di quei tumori che però hanno una buona prognosi. In conclusione, i pazienti di neuroblastoma che vengono predetti ipossici dal nostro classificatore potrebbero trarre dei benefici da protocolli terapeutici disegnati per contrastare l ipossia del tumore. 1. Maris J. et al. Lancet, vol 369, Talks K.L. et al. Am J Pathol, vol 157, Harris L.A. et al Nat Rev Cancer, vol 2, Fardin P. et al. Mol Cancer, vol 9, 2010 NUOVA TRASLOCAZIONE T(11;16)(P15;Q23) IN UN CASO DI LEUCEMIA MIELOMONOCITICA GIO- VANILE E. Tassano, E. Tavella, C.Micalizzi, C. Morerio Dipartimento di Ematologia ed Oncologia Pediatrica, IRCCS Istituto G.Gaslini, Genova. Introduzione. La leucemia mielomonocitica giovanile (JMML), disordine mielodisplastico/mieloproliferativo, è una patologia rara ad esordio precoce (sotto ai 5 anni), caratterizzata da leucocitosi con monocitosi, organomegalia, ingrossamento dei linfonodi, presenza di precursori ematopoietici nel sangue periferico ed alti livelli di emoglobina fetale. La prognosi è rapidamente infausta e il trapianto di midollo osseo rappresenta l unica opzione terapeutica. I pazienti con JMML presentano specifiche anomalie nel pathway di segnale di RAS, che rende le cellule ematopoietiche ipersensibili al GM-CSF. Inattivazione di NF1 o mutazioni oncogeniche dei geni NRAS, KRAS2, PTPN11, possono essere dimostrate in almeno 2/3 dei pazienti affetti da JMML. 1 Recentemente mutazioni omozigotiche del gene CBL sono state identificate in pazienti JMML negativi per mutazioni dei geni del pathway di RAS. 2 Le anomalie cromosomiche sono riscontrate con analisi di citogenetica convenzionale nelle cellule midollari del 36% dei pazienti, più frequente è la monosomia 7 (26%). Pazienti con cariotipo normale all esordio, possono acquisire anomalie clonali durante il decorso clinico. Materiali e Metodi. Un bambino con quadro clinico compatibile con diagnosi di JMML è giunto alla nostra osservazione a 3 mesi di vita con: epatosplenomegalia, febbre, leucocitosi con monocitosi (GB /μl, monociti /μl), presenza di precursori mieloidi (2%), citopenia bilineare (Hb 7 g/dl, piastrine /μl) e HbF (4.5%) normale per l età. La morfologia midollare era caratterizzata da aumento della cellularità, megacariociti diminuiti, iperplasia mieloide con normale maturazione, normale serie eritroide, 5% di monociti, 1% di cellule con aspetto immaturo. I test di clonogenicità effettuati su sangue periferico mostravano crescita spontanea delle CFU-GM. Le indagini virologiche erano negative. Dopo 1 anno di follow up il bambino presenta miglioramento del quadro clinico, in particolare riduzione dell organomegalia, normalizzazione dell emoglobina e delle piastrine, ma persistenza della monocitosi, dei precursori mieloidi periferici e incremento degli elementi immaturi midollari (17%). Lo studio degli oncogeni NRAS, KRAS2, PTPN11 non ha rilevato mutazioni. Le analisi cromosomiche sono state effettuate mediante tecniche di routine su colture a breve termine (24h e 48h) di midollo osseo e di sangue periferico. L identificazione dei cromosomi è stata eseguita mediante bandeggio QFQ. Il cariotipo è stato formulato in accordo alla nomenclatura ISCN (2009). Sono stati eseguiti esperimenti di FISH con le sonde painting per i cromosomi 11 e 16, con la sonda subtelomerica 11p e con i BAC RP11-120E20 e RP11-348A20, selezionati dal genome browser UCSC (http://genome.ucsc.edu/), che mappano il gene NUP98 sul cromosoma 11p15. Risultati e discussione. Il cariotipo dell aspirato midollare, confermato dalla FISH con sonde painting per i cromosomi 11 e 16 e dalla sonda subtelomerica 11p, risultava 46,XY,t(11;16)(p15;q23). L ibri - da zione con BAC specifici per il gene NUP98 ne escludeva il riarrangiamento. I casi di JMML caratterizzati da trasloca- [Pediatric Reports 2011; 3:s1] [page 13]

16 zioni cromosomiche come uniche anomalie citogenetiche sono rari e descritti in singoli casi: t(5;17)(q33;p11.2) con fusione PDGFRB/SPECC1 alias HCMOGT- 1; 3 t(4;17)(q12;q21) con fusione FIP1L1/RARA in un bambino di 20 mesi con JMML aggressiva e resistente alla terapia, negativo per ricerca di mutazioni PTPN11, K- ed NRAS; 4 t(7;11)(p15;p15) con fusione NUP98/HOXA11 in una bambina di tre anni risultata positiva per mutazione di NRAS. 5 Non è conosciuta la relazione tra le traslocazioni cromosomiche risultanti in fusioni geniche, caratteristicamente associate alle leucemie acute, e le mutazioni dei geni coinvolti nella via RAS riscontrate nelle JMML; verosimilmente rappresenterebbero co - fattori del processo di leucemogenesi. Per quanto riguarda il nostro caso, il paziente è sotto controllo clinico periodico e sono in corso ulteriori indagini per caratterizzare la traslocazione e i possibili geni implicati. 1. Koike K, Matsuda K. Recent advances in the pathogenesis and management of juvenile myelomonocytic leukaemia. Br J Haematol 2008;141: Loh ML, Sakai DS, Flotho C, Kang M, Fliegauf M, Archambeault S, Mullighan CG, Chen L, Bergstraesser E, Bueso- Ramos CE, Emanuel PD, Hasle H, Issa JP, van den Heuvel-Eibrink MM, Locatelli F, Stary J, Trebo M, Wlodarski M, Zecca M, Shannon KM, Niemeyer CM. Mutations in CBL occur frequently in juvenile myelomonocytic leukemia. Blood 2009;114: Morerio C, Acquila M, Rosanda C, Rapella A, Dufour C, Locatelli F, Maserati E, Pasquali F, Panarello C. HCMOGT-1 is a novel fusion partner to PDGFRB in juvenile myelomonocytic leukemia with t(5;17)(q33;p11.2). Cancer Res 2004;64: Buijs A, Bruin M. Fusion of FIP1L1 and RARA as a result of a novel t(4;17)(q12;q21) in a case of juvenile myelomonocytic leukemia. Leukemia 2007;21: Mizoguchi Y, Fujita N, Taki T, Hayashi Y, Hamamoto K. Juvenile myelomonocytic leukemia with t(7;11)(p15;p15) and NUP98-HOXA11 fusion. Am J Hematol 2009;84: IL LINFOMA ANAPLASTICO A GRANDI CELLULE CON LOCALIZZA- ZIONE SNC: RISULTATI DEL PRO- TOCOLLO NAZIONALE AIEOP LNH- 97 M. Pillon, 1 F. Gregucci, 1 E. Carraro, 1 A. Lombardi, 2 N. Santoro, 3 M. Piglione, 4 A. Sala, 5 G. Franceschetto, 1 R. De Santis, 6 F. Casale, 7 M. Zecca, 8 L. Lo Nigro, 9 A. Garaventa, 10 R. Mura, 11 C. Consarino, 12 P. Tamaro, 13 L. Mussolin, 1 A. Rosolen 1 per il GdL AIEOP LNH. 1 Clinica di Oncoematologia Pediatrica, Dipartimento di Pediatria, Azienda Ospe - daliera-università di Padova, Padova; 2 Dipartimento di Onco-Emato logia Pe - diatrica e Medicina Trasfusionale, Ospedale Bambino Gesù, Roma; 3 Diparti - mento di Pediatria, Università di Bari, Bari; 4 Dipartimento Scienze Pediatriche e dell Adolescenza, Oncoematologia Pedia - trica Ospedaliera, Torino; 5 Ospedale San Gerardo, Università Milano-Bicocca, Monza; 6 Oncoematologia Pediatrica, S.G. Rotondo, Foggia; 7 Oncoematologia Pe - diatrica, Seconda Università degli Studi di Napoli, Napoli; 8 Clinica Pediatrica, Policlinico S.Matteo, Pavia; 9 Oncoemato - lo gia Pediatrica, Catania; 10 Ospedale Pediatrico G.Gaslini, Genova; 11 Onco - ematologia Pediatrica, Patologia della Coagulazione, Cagliari; 12 Dipartimento di Pediatria, Università di Catanzaro, Ca - tanzaro; 13 Oncoematologia Pediatrica, Università di Trieste, Trieste, Italia Introduzione. Il linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL) con localizzazione al sistema nervoso centrale (SNC), pur costituendo un evenienza rara, ha una prognosi sfavorevole in termini di sopravvivenza globale (OS) e libera da malattia (EFS), in linea con quanto già osservato per la leucemia acuta. Scopo del lavoro è la descrizione della prevalenza, delle caratteristiche cliniche e biologiche, e l analisi della sopravvivenza di questi pazienti trattati nel gruppo ad alto rischio del protocollo nazionale AIEOP LNH-97. Materiali e metodi. Da 10/1997 a 02/2007 sono stati arruolati nel protocollo AIEOP LNH pazienti con nuova diagnosi di ALCL di età inferiore ai 18 anni. Stadio secondo St. Jude: II 8, III 14, IV SNC neg 3, IV SNC pos 7. Il protocollo AIEOP LNH-97 prevedeva un trattamento diversificato per 3 gruppi di rischio (R1-R2-R3), suddivisi in base a stadio, resecabilità della malattia, sede, istologia. In particolare, il trattamento per il gruppo di rischio R3 con interessamento SNC consisteva in una prefase, seguita da 6 cicli di chemioterapia di 5 giorni ciascuno, di cui 4 basati sull uso di Methotrexate ad alte dosi (5 gr/mq) e 2 sulla somministrazione di Citarabina ad alte dosi (3 gr/mq x 4 somministrazioni). Il protocollo non prevedeva radioterapia craniale, ma la somministrazione di 3 rachicentesi a giorni alterni ad ogni ciclo, più una nella prefase. Risultati. Complessivamente, per tutti i pazienti trattati nel protocollo, la OS e la EFS a 5 anni era pari a 87% (SE 6%) e a 68% (SE 8%), rispettivamente. I pazienti SNC positivi (5 M/2 F, età mediana 9 anni) avevano una sopravvivenza inferiore rispetto ai pazienti SNC negativi alla diagnosi (25 casi), sia in termini di OS [71% (17%) vs 92% (6%), P=0.29] che di EFS [57% (19%) vs 71% (9%), P=0.51]. L interessamento del SNC alla diagnosi nei 7 pazienti era la seguente: 3/7 blasti nel liquor, 2/7 massa intracranica, 1/7 coinvolgimento oculare, 1/7 massa intracranica e coinvolgimento liquorale e dei nervi cranici. Tutti avevano un interessamento combinato anche di altre sedi linfonodali e/o extralinfonodali alla diagnosi e in due era presente anche un coinvolgimento del midollo osseo (BM). Alla diagnosi il valore di LDH mediano era 725 IU/L mentre l analisi immunofenotipica mostrava: 5/7 tipo T, 1/7 tipo Null e 1/7 non noto. All analisi immunoistochimica, 4/7 pazienti presentavano positività per la proteina chimerica ALK, 2/7 erano negativi e 1/7 non valutabile. Nei 4 pazienti ALK+ è stata ricercata la presenza della traslocazione t(2;5)(p23;q35) mediante RT-PCR per NPM-ALK nel prelievo bioptico della massa tumorale e in tutti è risultata positiva. NPM-ALK è stato successivamente ricercato nel midollo e nel liquor ed è risultato positivo in 1/4 pazienti a livello del liquor, e in 3/4 a livello midollare. In totale, la remissione completa (RC) è stata ottenuta in 6/7 casi, mentre un paziente ha presentato progressione di malattia senza mai raggiungere la RC. Sono state registrate 2 ricadute isolate al SNC, rispettivamente dopo 0.5 e 0.7 anni dalla diagnosi, in due pazienti rispettivamente ALK+ (NPM- ALK positivo su BM e liquor) e ALK-. In questo gruppo di pazienti SNC+, 2/7 sono deceduti per PM, mentre 5/7 sono vivi, 2 di essi dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche. Conclusione. La localizzazione al SNC è rara nel ALCL. La nostra casistica ha registrato un numero relativamente elevato di pazienti SNC positivi (22%), che rimane comunque un numero esiguo per trarre conclusioni sul valore prognostico del coinvolgimento del SNC alla diagnosi. Ciò che emerge dall analisi statistica è che la EFS è peggiore nei pazienti con questa presentazione rispetto ai pazienti senza interessamento SNC alla diagnosi. Visti i recenti lavori pubblicati in merito alla malattia minima ed al titolo anticorpale come fattori prognostici negativi [page 14] [Pediatric Reports 2011; 3:s1]

17 nell ALCL, è auspicabile un approfondito studio dei markers biologici su casistiche più ampie, per definire meglio i parametri prognostici sfavorevoli e disegnare trattamenti più mirati. LE DIVERSE FORME DI NEUROBLA- STOMA METASTATICO SONO CARATTERIZZATE DA LIVELLI DI ESPRESSIONE DI TIROSINA IDROSSILASI SIGNIFICATIVAMENTE DIVERSI Barbara Carlini, 1 Stefano Parodi, 2 Giovanni Erminio, 2 Vera Morsellino, 3 Riccardo Haupt, 2 Alberto Garaventa 3 Maria Valeria Corrias 1 1 Laboratorio di Oncologia, 2 Sezione di Epidemiologia e Biostatistica e 3 Diparti - mento di Emato-Oncologia, Istituto Gian - nina Gaslini, Genova. Introduzione. La presentazione clinica del neuroblastoma (NB) all esordio è estremamente variabile, variando dalle forme localizzate (stadi 1, 2 e 3) alla forma metastatica (stadio 4). Mentre la prognosi per le forme localizzate è buona, quella della forma metastatica varia a seconda dell età del paziente alla diagnosi e, nel caso dei bambini al di sotto di un anno di età alla diagnosi, dalla localizzazione delle metastasi. Precisamente secondo il Sistema Inter - nazionale di Stadiazione del Neuro - blastoma (1) nei bambini sotto l anno si identifica uno stadio 4S (S per speciale) caratterizzato da metastasi limitate a cute fegato e midollo osseo, con infiltrazione inferiore al 10%. Questa forma di malattia metastatica è associata ad alta frequenza di regressione spontanea ed a buona prognosi con nessun o pochi interventi terapeutici. La prognosi dei bambini con stadio 4 sotto l anno di età è anch essa buona, ma richiede interventi terapeutici più importanti. Al contrario la prognosi dei bambini con stadio 4 sopra l anno di età alla diagnosi è pessima nonostante interventi terapeutici multi modali ed aggressivi. I meccanismi responsabili per queste profonde differenze nel comportamento clinico del NB metastatico in relazione all età alla diagnosi sono per la maggior parte ignoti. Poiché per definizione nei bambini sotto l anno gli stadi 4S hanno una infiltrazione midollare più bassa degli stadi 4, abbiamo voluto verificare se nei bambini con stadio 4 il livello di infiltrazione fosse più basso in quelli sotto l anno rispetto a quelli sopra l anno d età alla diagnosi. Per poter rispondere a questa domanda abbiamo utilizzato l'analisi molecolare (RT-qPCR) per marcatori NB-specifici, che essendo una metodica quantitativa e molto sensibile potrebbe migliorare la capacità diagnostica che attualmente si basa esclusivamente sull analisi morfologica degli strisci midollare e delle biopsie ossee. Materiali e Metodi. Disegno dello studio. La coorte di pazienti oggetto di studio è stata selezionata tra i pazienti con stadio 4 e 4S, registrati nel Registro Italiano NB tra gennaio 2001 e giugno 2008, di cui erano disponibili campioni di midollo (BM) e sangue periferico (PB) all esordio. Analisi molecolare dei marcatori NBspecifici. I campioni di BM e PB sono stati centralizzati presso il laboratorio di riferimento nazionale. L RNA totale è stato estratto e retrotrascritto secondo metodica standardizzata (2). Il cdna è stato quindi amplificato con i primers e probe specifici per β2-microglobulina (gene di riferimento) e per i marcatori NB-specifici Tirosina idrossilasi (TH), Double Cortin (DCX) e Phox2b per 40 cicli in triplicato. In ogni piastra sono stati inseriti opportuni controlli positivi e negativi ed i risultati dell amplificazione sono stati elaborati secondo il metodo di Livak (3) ed espressi come valori relativi di espressione ( Cq). Analisi statistica. Le differenze nella distribuzione di variabili continue sono state analizzate mediante analisi di Mann-Whitney. La correlazione tra i livelli di espressione dei tre marcatori molecolari è stata stimata mediante analisi di Spearman. L accuratezza diagnostica è stata valutata mediante le curve ROC. Risultati. Espressione di TH, DCX e Phox2b nei tre gruppi di pazienti di studio. I livelli di espressione dei tre marcatori NB-specifici sono risultati diversi nei campioni di midollo dei tre gruppi di pazienti con NB metastatico, mentre i livelli di espressione nel sangue periferico erano significativamente diversi nei bambini sotto l anno rispetto a quelli sopra l anno, ma sovrapponibili nei bambini sotto l anno con stadio 4 o 4S. Le differenze tuttavia erano significative solo per il marcatore TH. L espressione di Phox2b e DCX è risultata sovrapponibile sia nei campioni di BM sia di PB, come evidenziato dall esistenza di una perfetta correlazione dei due risultati. L analisi ROC ha confermato l accuratezza diagnostica del marcatore TH nel classificare correttamente i pazienti. Associazione dell'espressione di TH e altre caratteristiche dei pazienti. I livelli di espressione di TH misurati nei campioni di BM e PB nei tre gruppi di pazienti con NB metastatico sono risultati indipendenti da tutti gli altri fattori prognostici noti. Tuttavia nei bambini sopra l anno di età alla diagnosi i livelli di espressione di TH correlano non solo con la presenza di metastasi nel midollo ma anche con la presenza di metastasi scheletriche. Discussione. L età è un importante fattore prognostico nel NB e anche nella forma metastatica la prognosi è molto peggiore per i bambini sopra l anno di età alla diagnosi di quella dei bambini sotto l anno. Inoltre solo nei bambini sotto l anno può presentarsi una forma metastatica particolare con ottima prognosi (4). Tuttavia, il perché l età influisca pesantemente sulla prognosi rimane poco chiaro. In questo studio abbiamo dimostrato che i livelli di espressione del marcatore NBspecifico TH sono significativamente più alti nei bambini sopra l anno rispetto ai bambini sotto l anno d età sia nei campioni di midollo sia di sangue periferico. Quindi i bambini con stadio 4 sotto l anno hanno una espressione di TH intermedia tra i bambini stadio 4 sopra l anno e quelli stadio 4S. I nostri dati sostengono pertanto l utilità dell analisi molecolare quantitativa per il marcatore TH quale valida alternativa all'analisi morfologica convenzionale, che al momento è l unica riconosciuta dal Sistema di Stadiazione Internazionale del Neuroblastoma. Nei pazienti sotto l anno di età alla diagnosi, l analisi molecolare potrebbe consentire una più oggettiva classificazione dei pazienti con malattia metastatica a stadio 4 o 4S. Dato che i regimi terapeutici per questi due gruppi di pazienti sono notevolmente diversi una corretta classificazione ha importanti implicazioni cliniche, assicurando un trattamento terapeutico ai primi e risparmiando un trattamento potenzialmente tossico ai secondi. Recentemente, Benard e collaboratori (5) hanno dimostrato che i bambini con stadio 4S hanno un profilo di espressione genica particolare che li può discriminare dai bambini con stadio 4. L'analisi RT-qPCR per TH avrebbe però il vantaggio di essere una metodica standardizzata (2) di facile applicabilità in tutti i laboratori di riferimento nazionale. L utilizzo di questa metodica quantitativa ed oggettiva consentirebbe di capire se la discrepanza nell incidenza di pazienti sotto l anno di età con stadio 4 e 4S in Nord America e Europa sia dovuto ad una diversa interpretazione della soglia di infiltrazione midollare (10%) da parte dei citomorfologi e/o patologi europei o statunitensi. I valori di espressione della TH sono risultati indipendenti da tutti gli altri fattori prognostici noti, inoltre nei bambini sopra l anno i valori di espressione si associano non solo alla presenza di metastasi midollari ma anche alla presenza di metastasi ossee. È quindi possibile che l espressione di TH sopra una certa soglia sia indice di una maggiore aggressività delle cellule neoplastiche, così come è stato dimostrato nel caso delle leucemie. Nel nostro studio gli altri due marcatori NB-specifici, Phox2b e DCX, non sono risultati superiori alla TH, né il loro utilizzo ha aggiun- [Pediatric Reports 2011; 3:s1] [page 15]

18 to alcun tipo di informazione, confermando una nostra precedente osservazione a sostegno della inutilità di effettuare analisi molecolari per più marcatori. In conclusione, l introduzione dell analisi molecolare per l espressione di TH al momento della diagnosi di NB potrebbe consentire una più oggettiva stadiazione del paziente, un corretto confronto tra serie di pazienti e una maggiore comprensione del ruolo prognostico dell infiltrazione nel midollo. 1. Brodeur GM, Pritchard J, Berthold F, et al. J Clin Oncol 1993;11: Viprey V, Corrias MV, Kagedal B, et al. Eur J Cancer 2007;43: Livak KJ, Schmittgen TD. Methods 2001;25: London WB, Boni L, Simon T, et al. Cancer Lett 2005;228: Benard J, Raguenez G, Kauffmann A, et al. Mol Oncol 2008;2: EFFETTO DEI POLIMORFISMI DEI GENI ABCC2, MTHFR E TYMS SULLA TOSSICITÁ DA METHOTREXATE IN BAMBINI ONCOEMATOLOGICI L. Palumbo, 1 S Cavagnini, 1 L.D. Notarangelo, 1 V. Bennato, 1 F. Schumacher, 1 A. Panzali, 2 D. Di Lorenzo, 3 F. Porta 1 1 U.O. Oncoematologia Pediatrica e Tra - pianto Midollo Osseo Presidio Ospedale dei Bambini Spedali Civili di Brescia; 2 III Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche Spedali Civili di Brescia; 3 Laboratorio Biotecnologie III Laboratorio Analisi Spedali Civili di Brescia, Italia Il methotrexate è uno dei farmaci più impiegati nel trattamento dei tumori pediatrici e costituisce una delle principali cause di tossicità nel corso della chemioterapia. Il presente studio, pertanto, si è proposto di valutare l esistenza di una correlazione tra determinati polimorfismi genetici e lo sviluppo di reazioni avverse al methotrexate, al fine di stabilire la presenza di evidenze sufficienti a supportare l utilizzo di uno screening genetico mirato, nella fase di pianificazione del trattamento, per evitare l evoluzione in un quadro clinico di tossicità. È stata valutata, inoltre, l ipotetica correlazione tra eventi avversi al methotrexate e la concomitante assunzione di altri farmaci, la dose somministrata dell agente antifolico e l età del paziente al momento della diagnosi della patologia. I polimorfismi ricercati sono relativi ai geni ABCC2, MTHFR C677T, MTHFR A1298C e TYMS. In riferimento ad ABCC2, il polimorfismo 24C>t situato nella regione 5 non tradotta del gene sarebbe associato a una ridotta espressione di una proteina transmembrana deputata alla detossificazione cellulare del methotrexate (MRP2), quindi a una minor eliminazione dell agente antifolico, con conseguente aumento del rischio di sviluppare eventi avversi. Il genotipo normale per ABCC2 è CC, il genotipo alterato in eterozigosi CT e il genotipo alterato in omozigosi TT. Una proteina codificata da un gene particolarmente polimorfico, avente un ruolo chiave nel metabolismo e nell omeostasi dei folati, è la 5-10-metilentetraidrofolato reduttasi (MTHFR), indirettamente implicata nel meccanismo d azione del methotrexate. I polimorfismi C677T e A1298C sono associati a una ridotta attività dell enzima codificato, con conseguente alterazione della distribuzione intracellulare dei folati e sviluppo di una condizione di iperomocisteinemia, condizione potenzialmente letale, in quanto costituisce un fattore indipendente di rischio cardiovascolare e trombotico. Nel caso del polimorfismo C677T si ha una transizione da citosina a timina al nucleotide 677: tale variazione comporta la sostituzione di un alanina in valina al codone 222 e interessa il sito catalitico della MTHFR. Il genotipo normale risulta essere CC, il genotipo alterato in eterozigosi CT e il genotipo alterato in omozigosi TT. Il polimorfismo A1298C è definito, invece, da una transversione di un adenina in citosina al nucleotide 1298, con una sostituzione del glutammato con l alanina al codone 429: tale variazione coinvolge un dominio regolatore della MTHFR. Il genotipo normale risulta essere AA, il genotipo alterato in eterozigosi AC e il genotipo alterato in omozigosi CC. In entrambi i casi, i polimorfismi determinano una riduzione dell attività dell enzima e un potenziamento del blocco del metabolismo dei folati indotto dal methotrexate. Altrettanto importante è il gene che codifica la timidilatosintetasi (TYMS), un enzima chiave nell ambito della riproduzione cellulare, inibito direttamente dal methotrexate. Recenti studi hanno individuato a livello della regione enhancer del promotore del gene TYMS un polimorfismo, rappresentato da una variazione nel numero delle ripetizioni di una sequenza di 28 paia di basi. Pazienti omozigoti per la variante caratterizzata da 3 sequenze ripetute (3R/3R) presentano una maggior espressione e attività dell enzima e tendono ad avere una minore probabilità di risposta al trattamento con methotrexate, rispetto a pazienti omozigoti per la variante con 2 sequenze ripetute (2R/2R) o eterozigoti (2R/3R). Inoltre, i pazienti omozigoti 3R/3R risultano avere, in seguito al trattamento con methotrexate, un maggior rischio di recidiva ed un beneficio inferiore in termini di sopravvivenza rispetto a pazienti portatori dell allele 2R. L analisi retrospettiva è stata condotta su 44 pazienti pediatrici, seguiti dal 2006 al 2011 presso l U.O. Oncoematologia Pediatrica e Trapianto di Midollo Osseo dell Ospedale dei Bambini di Brescia. I pazienti presentavano al momento della diagnosi della malattia neoplastica un età compresa tra 2 mesi e 15 anni; nell 80% dei casi erano di nazionalità italiana, nel 13% di nazionalità albanese e nel restante 7% di nazionalità indiana o marocchina. Nel 68% dei soggetti era stata posta diagnosi di leucemia linfoblastica acuta, nel 18% di linfoma, nel 7% di osteosarcoma e nel restante 7% di tumore embrionale. Durante una visita ambulatoriale, i pazienti sono stati sottoposti a un prelievo di sangue venoso periferico; i campioni sono stati conservati a 4 C fino al momento dell estrazione del DNA, che è stata realizzata con metodica semiautomatica. In seguito si è proceduto con l amplificazione del materiale genetico, il sequenziamento e l identificazione dell eventuale polimorfismo. In riferimento al gene ABCC2, il 70% dei pazienti ha presentato genotipo normale, il 25% genotipo alterato in eterozigosi e il 5% in omozigosi. Il 20% dei soggetti non ha mostrato alcuna variazione a livello del gene MTHFR C677T, mentre il 50% ha presentato un polimorfismo in eterozigosi e il 30% in omozigosi. Il gene MTHFR A1298C è risultato normale nel 57% degli individui, alterato in eterozigosi nel 37% e in omozigosi nel 6%. Il gene TYMS si è presentato normale nel 14% dei casi, polimorfico in eterozigosi nel 54% dei bambini e in omozigosi nel 32%. Dall analisi delle cartelle cliniche è stato possibile comprendere il fenotipo, cioè il decorso clinico in seguito all assunzione del methotrexate: nel 29,5% dei casi non si sono verificate complicanze e nel 70,5% è stato riscontrato un evento avverso. Nello specifico, il 56,8% dei pazienti ha presentato un evento da noi definito major, dovuto a un ritardo nell eliminazione del methotrexate, indicato da valori ematici del farmaco >0.25 μmoli/l alla 48 ora trascorsa dall inizio dell infusione del methotrexate per via endovenosa; il 13,7% dei bambini ha mostrato un evento da noi definito severe, cioè un episodio di manifesta tossicità, a livello renale, neurologico, epatico o cutaneo. La valutazione del genotipo e del fenotipo dei pazienti che hanno presentato un evento avverso (70,5%) ha permesso di evidenziare le seguenti correlazioni: il gene ABCC2 è risultato normale nel 50% dei soggetti e alterato nel restante 20,5%; il gene MTHFR C677T si è presentato normale nel 20,5% dei pazien- [page 16] [Pediatric Reports 2011; 3:s1]

19 ti e polimorfico nel 50%; il gene MTHFR A1298C si è mostrato normale nel 34% dei bambini e alterato nel 36.5%; il gene TYMS è risultato normale nel 6,9% degli individui e polimorfico nel 63.6%. Data la complessità della chemioterapia somministrata ai nostri pazienti, per coloro in cui si è verificato un evento severe in seguito alla somministrazione del methotrexate, è stata valutata la concomitante assunzione di altri farmaci, in particolar modo di 6-mercaptopurina, trimetoprim/sulfametoxazolo, amoxicillina/ acido clavulanico, desametasone, associati a un maggior rischio di tossicità. Nella nostra casistica non è stata riscontrata tale correlazione. È stata valutata, inoltre, l associazione tra la dose del methotrexate assunta per via endovenosa e l evoluzione verso un evento major o severe. Nel 44% dei casi gli eventi major si sono presentati nei pazienti in cui sono stati somministrati 2 g/m 2 di methotrexate; nel 36% in seguito all assunzione di 5 g/m 2 ; nell 8% in bambini che avevano precedentemente assunto 8 g/m 2 ; nella restante percentuale dei casi in seguito alla somministrazione di 1 g/m 2 (4%), 3 g/m 2 (4%) e 12 g/m2 (4%). Nel 66% dei casi gli eventi severe si sono manifestati nei pazienti che avevano assunto 5 g/m 2 di methotrexate; nel restante 34% in seguito alla somministrazione di 2 g/m 2. Relativamente all età di diagnosi della neoplasia, gli eventi major sono stati più frequenti nei pazienti di età compresa tra 4 ed 6 anni, mentre gli eventi severe si sono presentati soprattutto tra 9 e 14 anni. In conclusione, l analisi dei nostri dati ha confermato l esistenza di una correlazione statisticamente significativa per il rischio di tossicità al methotrexate nei pazienti con alterazioni a carico di MTHFR C677T e TYMS. Inoltre, gli eventi major si sono mostrati più frequenti nei soggetti di età inferiore a 6 anni, in terapia con un dosaggio di methotrexate pari a 2 g/m 2 ; mentre gli eventi severe si sono presentati maggiormente in bambini più grandi (9-14 anni), ai quali sono stati somministrati 5 g/m 2 di methotrexate. Tali risultati suggeriscono la somministrazione di una terapia personalizzata, scelta in base al patrimonio genetico di ogni paziente: l auspicio, infatti, è che lo screening genetico di MTHFR C677T e TYMS venga applicato nella pratica clinica, al fine di evitare lo sviluppo di eventi avversi al methotrexate. 1. Rau T, Erney B, Gores R, Eschenhagen T, Beck J, Langer T. High-dose methotrexate in pediatric acute lymphoblastic leukemia: impact of ABCC2 polymorphism on plasma concentrations. Clin. Pharmacol. Ther. 80: ; Chiusolo P, Reddiconto G, Casorelli I et al. Preponderance of methylenetetrahydrofolate reductase C677T homozigosity among leukemia patients intolerant to methotrexate. Ann. Oncol. 2002; 13: Krajinovic M, Costea I, Chiasson S. Polymorphism of the thymidylate synthase gene and out come of acute lymphoblastic leukemia. Lancet 359: ;2002. ATTIVITA ANTI-TUMORALE IN VITRO ED IN VIVO DI CELLULE CITOTOSSICHE EBV-SPECIFICHE (EBV-CTL) CONTRO LA LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA (AML) CD33 + V. Marin, 1 * A. Dutour, 2 ** S. Valsesia- Wittmann, 2 D. Lee, 3 E Yvon, 4 H. Finney, 5 A Lawson, 5 M. Brenner, 4 R. Rousseau, 6 ** E. Biagi 1 ** 1 Centro Ricerca M.Tettamanti, Clinica Pediatrica, Università Milano Bicocca, Monza, Italia, 2 INSERM U590/Equipe Cytokines et Cancer- Centre Léon Bérard- Lione, Francia, 3 Pediatrics, Cell Therapy Section, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Houston, TX (USA), 4 Center for Cell and Gene Therapy, Texas Children s Cancer Center, Baylor College of Medicine, 5 UCB Celltech, 216 Bath Road, Slough, Berkshire SL1 3WE, United Kingdom, 6 Université Claude Bernard, Lione, Francia *V Marin ed A Dutour hanno contribuito equamente al lavoro **E Biagi e R Rousseau condividono la last authorship Introduzione. La modificazione genica di cellule T con recettori chimerici (CAR) è una strategia promettente per il trattamento dei tumori. Con questo approccio infatti, è possibile ampliare il range di antigeni da utilizzare per lo sviluppo di approcci di immunoterapia adottiva di cellule T ed inoltre i maggiori meccanismi di evasione tumorale vengono elusi.1 Abbiamo applicato questa strategia per ridirezionare cellule citototossiche specifiche per virus Esptein Barr (EBV-CTL) contro l antigene CD33 per bersagliare la leucemia mieloide acuta (AML). Tali cellule hanno mostrato risultati clinici molto soddisfacenti 2 e più recentemente uno studio clinico di fase I in pazienti con neuroblastoma, ha supportato l utilizzo degli EBV-CTL anche in seguito a modificazione genica con CAR, grazie alla loro persistenza a lungo termine in vivo, sostenuta dalla ristimolazione fisiologica fornita dalle cellule presentanti antigeni EBV. 3 Materiali e metodi. EBV-CTL sono stati ottenuti dalle cellule mononucleate del sangue periferico di 6 donatori sani mediante ristimolazione in vitro con linee cellulari linfoblastoidi autologhe (LCL) e IL-2 secondo un protocollo standard. Il giorno dopo la terza stimolazione gli EBV-CTL sono stati trasdotti con i vettori retrovirali codificanti il CAR anti- CD33-ζ ed il CAR anti-cd33-cd28-ox-40-ζ. Le cellule sono state quindi analizzate per valutare l efficienza di trasduzione mediante marcatura con anticorpo specifico per la porzione CH2-CH3 del CAR e per analizzare l attività funzionale in vitro (saggi di citototossicità di rilascio di 51Cromo a 4 ore contro LCL autologhe e linea cellulare KG-1; Elispot per IFN-γ e Granzima B dopo stimolazione con LCL e KG-1 irradiate) ed in vivo, in un modello murino di AML umana, in cui topi NOD/SCID sono stati iniettati sottocute con la linea cellulare AML-10 trasdotta con Firefly luciferasi per essere successivamente sottoposti a 4 iniezioni/settimana intravena di EBV-CTL trasdotti con CAR anti-cd33 e monitorati per la crescita tumorale mediante bioluminescenza. Risultati: abbiamo dimostrato che gli EBV-CTL possono essere efficientemente modificati con i CAR anti-cd33 (percentuale media di cellule esprimenti CAR pari a 35%±4% (n=6) e 41%±6% (n=6) rispettivamente per CAR anti-cd33-ζ e CAR anti-cd33-cd28-ζ). Gli EBV-CTL geneticamente modificati con CAR anti- CD33 mostrano doppia specificità in vitro, con una potente attività litica contro bersagli esprimenti l antigene EBV (LCL) simile alle cellule non manipolate (lisi media a rapporti effettore:target 50:1 pari a 40%±7%, 44%±6% e 48%±7% rispettivamente per EBV-CTL esprimenti CAR anti-cd33-ζ, CAR anti-cd33-cd28-ζ ed EBV-CTL non manipolati) e contro la linea cellulare esprimente CD33 KG-1, significativamente maggiore rispetto alle cellule non manipolate (lisi media a rapporti effettore:target 50:1 pari a 39%±5%, 44%±6% e 5%±3%; n=6, rispettivamente per EBV-CTL esprimenti CAR anti-cd33- ζ, CAR anti-cd33-cd28-ζ ed EBV-CTL non manipolati). Tale doppia specificità è stata confermata anche valutando il rilascio di IFN-γ e Granzima B in seguito a stimolazione con LCL e KG-1. Mentre nel primo caso il rilascio di IFN-γ e Granzima B è risultato analogo tra EBV-CTL esprimenti CAR anti-cd33 ed EBV-CTL non trasdotti, nel secondo caso, abbiamo riscontrato un aumento medio di cellule formanti spot -SFC-/105 cellule per l IFN-γ pari a 10 e 18; n=6, rispettivamente per EBV-CTL esprimenti CAR anti-cd33-ζ e CAR anti-cd33-cd28-ζ rispetto ad EBV- CTL non manipolati ed un aumento medio di SFC/105 cellule per Granzima B pari a 14 e 23; n=6, rispettivamente per EBV-CTL esprimenti CAR anti-cd33-ζ e CAR anti-cd33-cd28-ζ rispetto ad EBV- CTL non manipolati. Inoltre, abbiamo osservato che gli EBV-CTL esprimenti il [Pediatric Reports 2011; 3:s1] [page 17]

20 CAR anti-cd33-ζ iniettati nei topi NOD- SCID con AML, sono stati in grado di raggiungere il tumore ed esercitare attività anti-tumorale in vivo, con inibizione della crescita tumorale pari al 43% confrontata con il 12% dei topi trattati con EBV-CTL non manipolate. La presenza del dominio costimolatorio CD28 nel CAR anti-cd33 non ha potenziato l attività litica in vitro degli EBV-CTL né quella antitumorale in vivo, con un inibizione della crescita tumorale pari al 20%. Conclusioni. l utilizzo di EBV-CTL esprimenti CAR anti-cd33 rappresenta uno strumento promettente per fornire un beneficio terapeutico ai pazienti con AML in cui le terapie convenzionali falliscono. Studi addizionali sono necessari per individuare quali domini intracellulari siano in grado di ottimizzare ulteriormente la funzionalità antitumorale degli EBV-CTL trasdotti con CAR. : 1. Biagi E, Marin V, Giordano Attianese G, Dander E, D Amico G, Biondi A. Chimeric T-cell receptors: new challenges for targeted immunotherapy of hematological malignancies. Hematologica, 2007;92: Heslop HE, Slobod KS, Pule MA, et al., Long-term outcome of EBV-specific T- cell infusions to prevent or treat EBVrelated lymphoproliferative disease in transplant recipients. Blood, (5): p Pule MA, Savoldo B, Myers GD, et al., Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med, (11): p CONFRONTO DI DIVERSE STRATE- GIE DI GENE SUICIDA PER IL MIGLIORAMENTO DEL PROFILO DI SICUREZZA DELLE CELLULE T GENETICAMENTE MODIFICATE PER L IMMUNOTERAPIA CELLULARE ADOTTIVA V. Marin, 1 I. Pizzitola, 1 E. Cribioli, 1 A. Biondi, 1 E. Biagi, 1 M. Pule 2 1 Centro Ricerca M.Tettamanti, Clinica Pediatrica, Università Milano Bicocca, Monza, Italia e 2 Dipartimento di Emato - logia, University College London, London, United Kingdom Introduzione. l immunoterapia adottiva con cellule T geneticamente modificate con TCR esogeni o recettori chimerici potrebbe essere associata alla manifestazione di eventi tossici, scatenati dalla possibile reattività delle cellule T contro i tessuti sani o dalla eventuale mutagenesi inserzionale conseguente all utilizzo di vettori retrovirali per la manipolazione genica delle cellule T1. Quindi si rende necessario co-esprimere un gene suicida nel vettore virale utilizzato per modificare geneticamente le cellule T, che possa rendere le cellule T suscettibili all azione di uno specfico pro-farmaco, quindi selettivamente eliminabili in caso manifestino tossicità una volta infuse1. Sinora sono state indagate diverse strategie suicida, basate sull utilizzo di timidina chinasi derivata da Herpes Simplex virus (HSV-TK)2 caspasi 9 inducibile (icasp9)3, timidilato chinasi umana mutata (m-tmpk)4 e CD205. Tuttavia è difficile confrontare i risultati riportati in letteratura dai diversi gruppi di ricerca che si sono concentrati sui singoli modelli di geni suicida, a causa della inevitabile mancanza di uniformità nelle procedure sperimentali utilizzate. Pertanto, lo scopo di questo studio è stato quello di confrontare le differenti strategie di gene suicida descritte in letteratura in un modello in vitro di cellule citotossiche specifiche per il virus Epstein Barr (EBV-CTL). I risultati ottenuti consentiranno una migliore definizione della strategia suicida ottimale da utilizzare al fine di aumentare il profilo di sicurezza e quindi l applicabilità clinica dei linfociti T per i protocolli di immunoterapia adottiva. Materiali e metodi. i geni codificanti la timidina chinasi di Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase (HSV-TK)2, la caspasi 9 umana inducibile (icasp9)3, la timidilato chinasi umana mutata (mtmpk) 4 e il CD20 umano5 sono stati individualmente clonati nel vettore retrovirale SFG, in sequenza al gene codificante per l antigene CD34 troncato (dcd34), utilizzato come marcatore di trasduzione e selezione, separati dal peptide 2A, che consente l espressione equimolare del gene suicida e del gene marcatore. È stato generato inoltre un vettore di controllo codificante solo per l antigene dcd34. Tali costrutti sono stati quindi impiegati per trasdurre gli EBV-CTL, che sono stati sottoposti ad estensive analisi fenotipiche e funzionali. In primo luogo è stata valutata, mediante immunofenotipo, l efficienza di traduzione. Quindi sono state indagate eventuali alterazioni nelle caratteristiche fisiologiche degli EBV-CTL, dovute alla procedura di modificazione genica o all espressione dei geni suicida, mediante analisi del fenotipo, dell espansione in vitro, della citotossicità contro le linee linfoblastoidi cellulari (LCL) autologhe valutata mediante saggi di citotossicità di rilascio di 51Cromo contro LCL autologhe e allogeniche,e del rilascio di IFN-γ, valutato mediante citofluorimetria, in seguito a stimolazione con cellule LCL irradiate. Infine è stata indagata l attività funzionale dei diversi geni suicida valutando innanzitutto la loro cinetica di attivazione, mediante analisi citofluorimetrica della quota di cellule CD34 + residue a diversi tempi dopo la somministrazione dello specifico pro-farmaco (rispettivamente 1, 4 o 7 giorni), quindi l induzione di apoptosi dopo 24 ore di incubazione con il corrispettivo pro-farmaco, mediante marcatura con AnnessinaV e 7AAD, ed infine l effetto sulla capacità replicativa degli EBV-CTL trasdotti in seguito al trattamento farmacologico. Risultati. gli EBV-CTL sono stati efficientemente trasdotti con i costrutti retrovirali codificanti per icasp9-2a-dcd34, HSV-TK-2A-dCD34, mtmpk-2a-dcd34 e CD20-2A-dCD34 (% media di cellule CD34 +, 80%, n=5) totalmente paragonabile con la percentuale media di trasduzione ottenuta con il vettore controllo dcd34, pari a 85%±5%. L espressione del gene marcatore dcd34 è risultata essere stabile nel tempo fino a tre settimane di coltura. Inoltre, l espressione del gene suicida non ha causato alterazioni delle caratteristiche fisiologiche degli EBV- CTL, in particolare del tasso di espansione delle cellule in coltura, del loro immunofenotipo, con tipica espansione delle cellule CD3+CD8+, della loro capacità di rispondere agli antigeni EBV presentati dalle cellule LCL autologhe e della capacità di rilasciare IFN-γ dopo stimolazione con LCL, con simili valori tra cellule trasdotte e cellule non trasdotte. Per valutare la cinetica d azione dei diversi geni suicidi, gli EBV-CTL trasdotti con i diversi geni suicida sono stati incubati con i rispettivi pro-farmaci, alle concentrazioni ottimali precedentemente stabilite. Dopo solo 24 ore di incubazione, si è osservata una significativa riduzione della quota di cellule CD34 + residue nella cellule trasdotte con icasp9-2a-dcd34 dopo somministrazione dell Induttore Chimico di Dimerizzazione -CID- (media di sopravvivenza pari a 11%±3% dopo 24 ore, 5%±1% dopo 7 giorni; n=7). Le cellule trasdotte con il costrutto HSV-TK-2AdCD34 trattate con Ganciclovir hanno mostrato risultati simili a quelli ottenuti con icasp9-2a-dcd34, ma a tempi di incubazione più lunghi (dopo 4 giorni); i costrutti mtmpk-2a-dcd34 e CD20-2AdCD34 a tutti i time point analizzati hanno mostrato un efficacia minore nell indurre morte cellulare (media di sopravvivenza dopo 7 giorni di incubazione pari rispettivamente a 32% ±10%e 84%±7%; n=5). Gli stessi risultati sono stati ottenuti analizzando l induzione di apoptosi precoce e tardiva attraverso marcatura con Anessina V e 7-AAD: dopo incubazione con il CID, le cellule trasdotte con il costrutto icasp9-2a-dcd34 hanno raggiunto livelli di apoptosi quasi del 100%, mentre, con gli altri costrutti suicida, sono stati ottenuti valori significativamente più bassi. Infine, quando è [page 18] [Pediatric Reports 2011; 3:s1]

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