Ecotossicologia: Test alternativi all uso di animali nel REACH Dr. Antonietta La Terza

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1 Ecotossicologia: Test alternativi all uso di animali nel REACH Dr. Antonietta La Terza UNICAM

2 Premessa L Ecotossicologica, sia che valuti i meccanismi d azione delle sostanze, sia che riguardi i saggi di eco-tossicità per il monitoraggio ambientale, si basa principalmente su studi in vivo. vivo in vitro - REACH Ecotossicologia studi in vivo L Ecotossicologia diversamente dalla Tossicologia, che è incentrata sull individuo e su singole specie, ha come obiettivo primario quello della valutazione degli effetti delle sostanze chimiche a livello di popolazioni, comunità ed ecosistemi. Ne consegue che un sistema in vitro, sviluppato in ambito ecotossicologico, dovrebbe essere in grado non solo di estrapolare gli effetti tossici in vivo, ma anche di fornire informazioni sulle risposte biologiche a livello di ecosistema.

3 Livelli di Organizzazione Biologica e tipologie di test/saggi ecotossicologici Da ISPRA, Manuali e Linee Guida 67/ ISBN:

4 There is no alternative to REACH, but there will be no REACH without alternatives." Il Regolamento REACH oltre a voler assicurare un elevato livello di protezione della salute umana e dell ambiente (art. 1), ha, come obiettivo, la promozione e lo sviluppo di metodi alternativi ai saggi in vivo, vivo per la valutazione dei pericoli che le sostanze chimiche comportano. Nel Regolamento REACH viene indicato che le informazioni da raccogliere in merito alla tossicità ed ecotossicità delle sostanze chimiche devono essere acquisite ricorrendo, ove possibile, a mezzi diversi dai test su animali vertebrati (art. 13). I test su animali vertebrati devono essere considerati come ultima risorsa (art. 25), adottando, inoltre, delle disposizioni volte a limitare le ripetizioni inutili dei test ad es. mediante la condivisione, all interno di ogni SIEF (Forum per lo scambio di Informazioni sulle Sostanze), dei dati ottenuti mediante le prove sperimentali sia in vivo che in vitro (art. 30). La Direttiva 86/609/EEC, precedente al Regolamento REACH, all articolo 23, già incoraggiava gli Stati Membri a sostenere/promuovere iniziative in grado di ridurre (Reduce), migliorare (Refine) e sostituire (Replace) i saggi con animali di laboratorio impiegati per scopi scientifici e di ricerca.

5 There is no alternative to REACH, but there will be no REACH without alternatives." La strategia delle 3R alternatives (3Rs strategy) (Russell & Burch,1959) fa ( riferimento a tutte quelle procedure che riducono drasticamente il numero di animali utilizzati in ciascun esperimento, alleviano o minimizzano le sofferenze loro inflitte, sostituiscono in modo parziale o completo gli animali vertebrati con diverse tipologie di colture cellulari in vitro. vitro E stato appurato che il 70% circa delle procedure che infliggono grandi sofferenze agli animali sono dovute all esecuzione di saggi di (eco)tossicità per scopi normativi. Il Regolamento REACH considera per metodi alternativi, sia idonei metodi in vitro, che modelli di relazioni qualitative o quantitative struttura-attività o dati relativi a sostanze strutturalmente affini (art. 13 e Allegato XI).

6 Statistiche relative al numero di animali annualmente impiegati a scopi scientifici in alcuni Paesi del mondo

7 Test alternativi (in vitro e in vivo) approvati o in fase di approvazione nella CE Idonei indica metodi in vitro convalidati (ad es. il saggio di mutagenicità con Salmonella typhimurium o test di Ames). Inoltre sono considerati idonei anche i saggi in fase di elaborazione sufficientemente avanzata secondo criteri riconosciuti a livello internazionale, come quelli adottati dal Centro Europeo per la Convalida dei Metodi Alternativi (ECVAM) per l immissione di una prova nel processo di pre-convalida (ECHA).

8 Implementazione della 3Rs strategy REDUCE, REFINE, REPLACEMENT (Russell and Burch, 1959) RELIABLE, RELEVANT, READY-TO-USE, ROBUST (VII Congresso Internazionale ALTEX - ALTernative to animal EXperimentation, Roma 2009) (Weighardt, 2009)

9 Qual è il costo del REACH in termini finanziari e di n di animali? Un opinione!

10 Qual è il costo del REACH in termini finanziari e di n di animali? Un n ampio di sostanze da gestire n di sostanze Costi n animali x REACH animali Secondo lo studio di Hartung & Rovida: 54 milioni di vertebrati con costi pari a 9.5 miliardi per i prossimi 10 anni cioè circa 20X animali in più e circa 6x di costi rispetto alle stime ufficiali EU.

11 Un passaggio essenziale in vivo in vitro..ed in generale verso metodologie high-throughput (HTS) ed altro! Regolamento REACH Art 40. La Commissione, gli Stati membri, l'industria e gli altri soggetti interessati dovrebbero continuare a contribuire alla promozione, a livello internazionale e nazionale, di metodi di prova alternativi alla sperimentazione animale, tra cui metodologie assistite da computer, appropriate metodologie in vitro*, vitro* metodologie basate sulla (eco)-tossicogenomica ed altre metodologie come ad es. Biomarker e Biosensori *Con il termine in vitro si fa riferimento al modo in cui le componenti di un organismo vivente (cellule, tessuti, organi) sono mantenute al di fuori dell organismo stesso, in un ambiente artificiale, controllato, isolate dai molteplici sistemi fisiologici che regolano le loro attività in vivo.

12 Metodi alternativi in vitro: colture cellulari di pesce Questo progetto ha l obiettivo di diffondere presso i laboratori delle Agenzie Regionali e Provinciali per la Protezione dell Ambiente (ARPA/APPA) dei saggi di citotossicità basale con linee cellulari stabilizzate di pesce da impiegare nello screening preliminare di valutazione dell ecotossicità delle sostanze chimiche, in alternativa al saggio di tossicità a breve termine con pesci.

13 Test Ecotossicologici previsti Da Versonnen et al (2006)

14 Considerando che il saggio più usato è quello di tossicità a breve termine che sulla base del metodo OCSE 203 (3 repliche, 5 concentrazioni e 7-10 pesci/conc. e per controllo) sono necessari dai pesci e questo per la valutazione di un singolo composto chimico!

15 Le colture di cellule animali possono essere utilizzate come strumento di screening rapido e a basso costo per la valutazione ecotossicologica di sostanze chimiche e campioni ambientali, permettendo, inoltre, la comparazione inter-specie in condizioni equivalenti di esposizione ai composti tossici. È considerate tale fino al momento in cui, con la prima sottocoltura, o passaggio, ha origine una linea cellulare che può essere propagata per un limitato numero di generazioni (linee cellulari finite), dopo le quali, va incontro a senescenza e morte. Le linee continue (o stabilizzate) possono avere origine dalle colture primarie e dalle linee cellulari a vita finita, sia spontaneamente, che per trasformazione indotta con agenti virali, chimici e fisici o mettendo in coltura, cellule provenienti da un tumore in vivo. Esse hanno la potenzialità teorica di sopravvivere per infiniti passaggi in vitro.

16 Alcuni vantaggi delle Linee cellulari continue di pesce rispetto a mammifero Possono essere incubate a temperatura ambiente (20±2 C) e in atmosfera normale Alcune di loro possono essere conservate per lunghi periodi (fino a 2 anni) a 4 C Possono essere esposte a matrici liquide di differente osmolarità Possono essere acquistate presso Enti certificati che ne garantiscono rigorosi controlli di qualità (caratteristiche morfologiche e genotipiche) e l assenza da contaminazioni.

17 Le colture cellulari, oltre il loro potenziale di sostituzione e/o riduzione del numero di animali nei saggi di tossicità, hanno altri vantaggi: 1. La valutazione rapida, di un elevato numero di sostanze potenzialmente tossiche, con l analisi spettrofluorimetrica in piastre multi-pozzetto. 1. La notevole diminuzione di quantità di sostanza potenzialmente tossica impiegata nell esecuzione dei saggi e, di conseguenza, di rifiuti prodotti dalla sperimentazione. 3. La possibilità di studiare i meccanismi d azione delle sostanze tossiche. 4. L opportunità di risparmiare anche il sacrificio dell animale donatore, se vengono utilizzate le linee cellulari continue.

18 La valutazione di tossicità nel XXI secolo: un nuovo pensiero ed una strategia Le metodologie high-throughput (HTS),

19 I Biomarkers Uno dei problemi più importanti da affrontare nelle indagini ecotossicologiche riguarda la valutazione dell'esposizione e dell'effetto di composti inquinanti sulle comunità naturali. L ecotossicologia, per affrontare queste problematiche, ha gradualmente affiancato alle indagini di biomonitoraggio, basate sulla stima dei livelli di residui negli organismi bioindicatori, un nuovo approccio metodologico basato sulla valutazione delle risposte che un organismo, una popolazione o una comunità naturale può generare, nei confronti di uno stress (fisico e/o chimico) ambientale. Ciascuna di queste risposte, comunemente definite come biomarkers, rappresenta un segnale integrato del livello di contaminazione di una determinata area e, di conseguenza, costituisce un indicatore del livello di rischio tossicologico a cui una determinata popolazione naturale può essere sottoposta.

20 I Biomarkers Una volta immesso nell ambiente, qual è il BERSAGLIO PRIMARIO di un composto inquinante? DIVERSE VIE DI ASSUNZIONE Quando un contaminante interagisce con la componente biotica di un ecosistema, terrestre, marino o di acqua dolce, può provocare una serie di alterazioni o danni a diversi livelli di complessità strutturale, i quali partendo dal danno molecolare, possono giungere a modificare la struttura dell intera popolazione e comunità.

21 Biomarker molecolari effetti sub-letali

22 I Biomarkers: alcune definizioni Viene generalmente definito come Biomarker "...quella variazione, indotta da un contaminante, a livello delle componenti biochimiche o cellulari di un processo, di una struttura o di una funzione, che può essere misurata in un sistema biologico" (NRC, 1989). Biomarker ecotossicologico che lo definisce come quella variazione biochimica, cellulare, fisiologica o comportamentale, che può essere misurata in un tessuto, in un fluido biologico o a livello dell intero organismo (individuo o popolazione), la quale fornisce l evidenza di un esposizione e/o un effetto ad uno o più composti inquinanti (e/o radiazioni). Depledge (1994) Si considera quindi una variazione a livello biochimico, fisiologico, istologico, morfologico e comportamentale Questo approccio metodologico pone alla base del suo essere il concetto di intercorrelabilità degli effetti di un inquinante ai vari livelli di complessità strutturale.

23 Dalle risposte a livello molecolare fino alle risposte a livello di popolazione si verifica un aumento del tempo di risposta, dell importanza ecologica ed infine un aumento della difficoltà nell individuazione della intercorrelabilità degli effetti.

24 Una distinzione importante: Bioindicatore e Biomarker Con il termine di bioindicatore si vuole definire un qualsiasi organismo (animale,vegetale, batterio,protista, fungo) che può essere utilizzato come indicatore del livello di contaminazione di un determinato ambiente (cioè valutare la biodisponibilità degli inquinanti); si considera come biomarker quella risposta o quelle risposte (molecolare/cellulare..) che un organismo bioindicatore manifesta verso agenti stressanti (chimici o fisici). Per lo svolgimento di una indagine ecotossicologica tramite l utilizzo di biomarkers è quindi di primaria importanza la scelta a monte di un valido organismo bioindicatore.

25 I Biomarker come strumenti diagnostici e prognostici di salute ambientale In sintesi, l utilizzo dei biomarker consente di stimare (strumento diagnostico ), attraverso lo studio di risposte immediate (induzione sistemi detossificanti, inibizioni, attività enzimatiche, formazione prodotti metabolici, alterazioni del DNA, ecc.) il tipo e/o i tipi di contaminanti ai quali l organismo bioindicatore è sottoposto, i livelli semiquantitativi dell esposizione e successivamente, in funzione dell intercorrelabilità degli effetti ai vari livelli di complessità strutturale, di prevedere (strumento prognostico ) il verificarsi di effetti negativi a lungo termine su scala ecologica e, di conseguenza, evitare eventi inaccettabili a livello ecologico, come l insuccesso riproduttivo o l incremento della mortalità nell ambito di popolazioni e comunità.

26 Non curabile r Curabile Malattia Stato di salute h: principio di stress c: incapacità di compensazione r: irreversibilità c Stressato h Sano Omeostasi Reversibile Irreversibile Compensazione Non-compensazione Morte Le diverse risposte omeostatiche e non che l'organismo genera nei confronti dello stress ambientale rappresentano quindi potenziali biomarkers utilizzabili in indagini ecotossicologiche (McCarthy e Shugart, 1990, Depledge e Fossi, 1994).

27 Biomarker specifici e generali I biomarkers, in generale possono essere suddivisi in due grandi categorie in funzione della loro specificità di risposta nei confronti degli agenti inquinanti in biomarkers specifici e biomarkers generali (Peakall & Shugart, 1993): con il termine di biomarkers specifici possono essere intesi quelle risposte molecolari e biochimiche che si manifestano in un organismo a seguito dell esposizione ad una specifica classe di contaminanti ; ad esempio, l induzione delle metallotionine rappresenta un segnale specifico della presenza di metalli pesanti come Cd, Hg, Zn; - con il termine di biomarkers generali possono essere intesi quelle risposte dell organismo a livello molecolare, cellulare e fisiologico, che non possono essere direttamente ricondotte ad una sola classe di contaminanti, ma che indicano lo stato generale di stress dell organismo ; ad esempio, danni del DNA, del sistema immunitario, variazione dei caratteri somatici,

28 Biomarker di esposizione ed effetto Biomarker di Esposizione tutte quelle risposte di un organismo, ai diversi livelli di complessità strutturale, che indicano l esposizione ad un composto chimico o ad una classe di composti chimici, ma che non forniscono nessuna indicazione sui reali effetti tossicologici sull organismo (solo esposizione) Biomarker di Effetto tutte quelle risposte di un organismo che indicano sia l esposizione ad un composto tossico che il suo effetto tossicologico... (Esposizione+effetto)

29 Biomarker I biomarkers, sono stati classificati da Hugget (1992), e Fossi (2000) in sette differenti categorie in funzione della loro diversa risposta in termini gerarchici e temporali. Tali categorie sono: 1. Alterazioni del DNA (formazione di addotti, rotture dell elica, aberrazioni cromosomiche e mutazioni) 2. Risposte di proteine (induzione, inibizione). (il sistema delle monossigenasi a funzione mista MFO,metallotioneine, le proteine da stress, esterasi cerebrali (AChE) ed ematiche) 3. Prodotti metabolici (alterazione metabolismo porfirine, pb (protoporfirine) e esaclorobenzene (uroporfirine)). 4. Variazioni leucociti) del sistema immunitario (attività citotossica dei 5. Alterazioni istopatologiche (fegato). 6. Biomarker non specifici e fisiologici (risposte endocrine, es. alterazione del rilascio delle catecolamine e ormoni corticosteroidi; risposte riproduttive, es. alterazione ormoni steroidei. 7. Biomarkers comportamentali

30 Biomarker Il segnale che si ricava, a seconda del livello strutturale interessato, è dato dalla diversa risposta temporale dell organismo che, in linea generale, è precoce (ore o giorni) nel caso di risposte molecolari e ritardata (settimane, mesi, anni) nel caso delle risposte cellulari e fisiologiche. Esiste, quindi, una serie di fattori che devono essere presi in considerazione nello studio e nella classificazione dei biomarker quali: la classe di contaminanti responsabili della risposta biologica, il tempo di risposta dell organismo, la sua applicazione come biomarkers di esposizione o di effetto ed infine il significato interpretativo del segnale.

31 I principali biomarkers utilizzati per il controllo ambientale

32 Genotossicità: danno al DNA prodotto da agenti chimici o fisici: radicali liberi; xenobiotici in grado di legare il DNA (IPA); metalli in grado di legarsi ai gruppi fosfati modificando il basepairing; UV-B

33 Single Cell Gel ASSAY (COMET ASSAY) A useful tool for (eco)toxicology: evaluation of DNA breakage induced by genotoxic agents at single cell level

34 Comet assay la metodologia

35 The classification of comets by shape Le 5 classi di danno da Kobayash i et al.

36 I principali biomarkers utilizzati per il controllo ambientale

37 Risposte di proteine Induzione attività enzimatica Enzimi della fase I (Monoossigenasi a funzione mista (MFO), enzimi della fase II, enzimi antiossidanti) Inibizione attività enzimatiche (Esterasi), multixenobiotic resistance mechanism (MXR) Induzione di sintesi proteica (Vtg,proteine da stress, metallotioneine(mt)

38 Risposte di proteine: Induzione attività enzimatica Enzimi della fase I INDUZIONE DEL SISTEMA DELLE MONOOSSIGENASI A FUNZIONE MISTA (MFO) COME BIOMARKER DI ESPOSIZIONE A CONTAMINANTI LIPOSOLUBILI

39 Il sistema delle monossigenasi a funzione mista (MFO) Il sistema MFO è ubiquitariamente presente nel regno animale ed è il principale sistema enzimatico devoluto alla DETOSSIFICAZIONE di contaminanti ambientali Il suo costituente principale è il CITOCROMO P450 (CYP) composto da + di 100 isoforme e suddiviso in diverse famiglie. Es. 1A 2B 3

40 Il sistema delle monoossigenasi a funzione mista (MFO) Risposta di Induzione xenobiotici idrofobici Sistema di detossificazioene Questo sitema multienzimatico gioca un ruolo fondamentale nei processi iniziali (Fase I) della detossificazione dei composti xenobiotici. Tali enzimi attraverso reazioni di ossidazione rendono reattivo lo xenobiotico idrofobo inserendo nella molecola gruppi polari OH, -SH, -COOH. Tale attivazione del substrato rende possibile l attività degli enzimi coniuganti (Fase II) e la succesiva eliminazione dall organismo.

41 INDUCIBILITA MFO La sintesi dell MFO è indotta da alcune classi di contaminanti ambientali IPA(idrocarburi policiclici aromatici) PCBs (policlorobifenili) PCDDs/PCDFs (Diossine/furani) PBBs(polibromobifenili) Insetticidi organoclorurati SPECIFICITA DEL SUBSTRATO Ogni isoforma è indotta da una classe di contaminanti IPA DDTs CYP1 A1 CYP 2B

42 Organismo esposto Sintesi di citocromo P450 induzione attività enzimatica Test di laboratorio specifico Etossiresorufina-o-dietilasi (EROD) (Determinazione fluorimetrica dell'attività del citocromo P4501A1)

43 Induzione-Metallotioneine proteine citoplasmatiche a basso peso molecolare (6-8 kda), monomeriche e dimeriche, termostabili 30% cisteine (-SH) Elevata affinità Hg>Cu+>Cd>Cu++>Zn β α Funzione pleiotropica: a) Ruolo fisiologico legato alla regolazione intracellulare di metalli essenziali (Zn, Cu) b) Indotte dall esposizione a metalli pesanti

44 Metallotioneine come Biomarker di esposizione Essendo inducibili, in generale la loro concentrazione è relativa alla quantità di metallo presente (e biodisponibile) nell ambiente di studio; Le diverse isoforme di metallotioneine sono specifici per i singoli metalli Biomarker di esposizione, permette di dedurre la presenza di metalli nell ecosistema e la loro biodisponibilità, non necessariamente sull effetto tossico di questa esposizione per l organismo. Relativamente al loro utilizzo come biomarker, occorre tener conto che: la presenza delle metallotioneine può presentare delle fluttuazioni stagionali in relazione al ciclo riproduttivo La presenza e l induzione può essere influenzata da glucocorticoidi (ormoni da stress, prodotti dal surrene), condizioni di stress, ipossia, basse temperature.

45 I principali biomarkers utilizzati per il controllo ambientale Risposte di proteine

46 Le proteine da stress: le Heat Shock proteins HSPs Si tratta di biomarkers generali di effetto, utili per valutare se l organismo è esposto o meno a situazioni di stress. HSP70 +ATPase

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48 I principali biomarkers utilizzati per il controllo ambientale

49 Le porfirine Le porfirine sono pigmenti tetrapirrolici ampiamente distribuiti in natura. Sono presenti in alcuni tessuti animali, ad esempio in gusci e penne negli uccelli, come deposizione pigmentata dove svolgono una funzione per l'ornamento e il camuffamento. Il loro ruolo fisiologico fondamentale è comunque legato al processo di sintesi dell'eme, di cui sono metaboliti intermedi o loro prodotti di ossidazione.

50 Alterazioni del ciclo di sintesi dell eme Quando il processo di sintesi dell'eme subisce interferenze si possono creare alterazioni nel profilo delle porfirine che sono prodotte, accumulate ed escrete. Di fondamentale importanza per le analisi ecotossicologiche è la capacità che hanno molte classi di contaminanti ambientali di interferire con la sintesi dell'eme sia nei vertebrati che negli invertebrati. Alcuni contaminanti agiscono molto selettivamente su alcuni enzimi della catena biosintetica alterando il metabolismo porfirinico. Le porfirine possono quindi essere utilizzate come biomarkers di esposizione a composti tossici.

51 I principali biomarkers utilizzati per il controllo ambientale

52 Alterazioni morfologiche: il tributilstagno (TBT) TBT biodegradazione lenta (fino a 5 mesi in condizioni aerobiche e 1-2 mesi in anaerobiosi) si accumula in acqua e sedimenti (BaiePorti) Bioaccumula Vernici antifouling per navi TBT altera l quilibrio endocrino nei molluschi Diversi studi hanno evidenziato un collegamento diretto tra esposizione a TBT e incidenza di imposex In U.K. e Canada sono stati avviati programmi di biomonitoraggio. TBT induce mascolinizzazione dei pesci IMPOSEX nei molluschi (femmine che sviluppano caratteristiche maschili)

53 I principali biomarkers utilizzati per il controllo ambientale

54 Whole Cell Biosensors Tradition Tetry test Bacterial canary

55 What is a biosensor? A biosensor combines a biological component (the sensing element), which is responsible for the selectivity of the device, with a detection system (the transducer) for measuring the reaction of the biological component with the substance (analyte) being monitored. analyte Bio-component Transducer Measurable signal Biosensors: Bio-component + Transducer Biosensor are analytical device which use biological interactions to provide either qualitative or quantitative results

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57 Principle of Biosensors Antibody Cell Enzyme Nucleic Acid Tissue Electroactive Electrode Substance ph change Semiconductor ph electrode Heat Thermistor Light Photon counter Mass change Piezoelectric device Solution or Atmosphere Recognizing Materials Signal Transducers signal

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59 Biosensors can be classified on the basis of: Types of Biological Sensing Units. Molecular-based (macromolecoles and sub-cellular components: enzymes, antibodies, nucleic acids, ion channels, lipid bilayer) Cell- and tissue-based (whole cells and tissues). The biological reaction detected can be the activity of an enzyme, the binding of an analyte to an antibody or receptor, the alteration of gene expression within (genetically and no genetically modified-) cells. Detection system for measuring these biological events usually rely on elettrochemical, amperometric, optical principles.

60 Enzyme-based biosensors The specificity of enzymatic action is the basis for the specificity of enyzme-based biosensors First biosensor was glucose biosensor (L.C. Clark)

61 Antibody-based biosensor.

62 The DNA biosensor uses the interaction of a superficial layer of nucleic acid (single or double stranded) with low molecular weight molecules for accumulating and detecting them. The interaction, via intercalative or electrostatic binding, can modify the structural or conformational properties of the DNA adsorbed on the electrode surface and the modification can affect the guanine oxidative process. The method uses constant current chronopotentiometry for detecting the capability of aromatic amines to modify the electrochemical behaviour of the DNA.

63 General advantages of molecular based biosensors High specificity The advantage of specific molecular bio-components is their remarkable ability to distinguish between the analyte of interest and similar substances. Speed The analyte can be directly and istantaneously measured Simplicity The uniquess of a biosensor is that the bio-component and transducer are integrated into a single sensor. This combination enables the measurement of target analytes without using reagents. Continuous monitoring capability Biosensors can regenerate and reuse the immobilized bio-reconition component. This feature allows these devices to be used for continuous or multiple assays.

64 Disadavantages of molecular based biosensors in environmental monitoring The molecular based biosensors fail to provide functional data on: Toxicity of toxicants on living systems Bioavailability of toxicants The synergistic or antagonistic effects of complex mixtures of toxicant (real environmental samples). Global parameters such as toxicity and bioavailability can be only assayed using whole cells.

65 Why use whole cell biosensors? The first and most important reason is that only by using a living component is it possible to obtain functional information, i.e. information about the effect of a stimulus on a living system. The strength of whole cell biosensing is not in the specificity of the observed responses but rather in their generality. What toxicants does the sample contain? VS How toxic is the sample?

66 A first example of whole cell biosensor : Vibrio fischeri a naturally luminescent bacteria The 30 min luminescence assay Commonly used bacterial assay Commercial kit: Microtox assay Easy to culture Marine luminescent bacteria Emission at 500 nm The Test Cells (can be freeze dried) from a log phase culture Simple saline medium 1 ml test solution, 5 concentrations plus a negative control, in triplicate Lighting: Not needed Inhibition of luminescence after 30 min chemical exposure Measurement: In a cuvette using a temperature controlled photometer, Positive control: metals or antibiotics

67 Vibrio fischeri 30 min luminescence assay Advantages Quick Reduced volume Chip Suitable for preliminary analysis Disadvantages not very sensitive results are not extrapolable to eukaryotes From naturally luminescent to genetically engineered biosensors Da Sensors 2011, 11(8),

68 The genetically engineered whole-cell biosensor: a novel class of tools for environmental monitoring and a promising alternative test for REACH How can a genetically engineered whole-cell biosensor be produced? The promoter-reporter-gene concept The general approach for producing a biosensor (using whole-cells) consists in fusing a (stress-inducible or constitutive) promoter DNA sequence (from a well characterized gene regulation pathway) to a reporter gene. Then the final genetic construct is transformed into the selected host cell. When the analyte is present, the reporter genes are expressed to produce the enzyme/protein responsible for the production of the measured signal. Commonly used reporter genes include those that code for bioluminescent proteins, such as luciferase or the Green Fluorescent Protein (GFP). hsp70 promoter gfp

69 GFP Aequorea victoria. Espressione delle proteine reporter fluorescenti in E.coli All that is required is an UV source to activate the fluorescent properties of the photoprotein. This ability to autofluoresce makes GFP highly desirable in biosensing assays since it can be used on-line and in real-time to monitor intact, living cells. Additionally, the ability to alter GFP to produce light emissions besides green (i.e., blue cyan, red, and yellow) allows it to be used as a multianalyte detector.

70 Reporter genes and proteins

71 Diagram of different whole cell biosensor options The switch off assay The switch on assay The reporter genes are the transducers of the signal and the response can be a fluorescent signal (gfp). The reporter genes are controlled by inducible or constitutive promoters

72 Promotori e geni regolatori che mediano l espressione del gene reporter nei sistemi di biosensing basati su cellule

73 Meccanismi molecolari coinvolti nella risposta a stress utilizzati nei sistemi di biosensing basati su cellule

74 Relevant steps for the successful development of genetically engineered whole cell bioreporter strain Selection of the (micro-) organisms that can survive in the environment under study The organism must have the proper gene-regulation system. Development of genetically engineered cell lines (bioreporter strains). The reporter gene must be integrated into the (micro)organism s genetic system without adversely affecting essential cellular functions.

75 Whole Cell Bioreporter technology offers several advantages over traditional ecotoxicological assays: high sensitivity, which enables the use of this technology as early warning system before population and communities are damaged; the whole cell bioreporters can be monitored in real time avoiding the necessity to sacrifice them;

76 Schematic representation of the cellular events that result in the expression of a reporter protein. The specificity of promoter regions for the analyte confer selectivity to the system, while the reporter protein determines the system s sensitivity and detection limits.

77 Sensing system based on bacteria Constitutive promoter Non specific biosensors General stress promoter These biosensors cannot be used to determine the type of toxicant present specific biosensors Stress specific promoter These biosensors can be used to determine the type of toxicant present, i.e. metals

78 Specific Biosensors: bacterial resistence to metals Biomet heavy metal biosensors use a modified soil bacterium (Ralstonia metallidurans) which gives a light reaction when specific heavy metals go into the cell. Apart from grinding a coarse solid sample, no other sample preparation is needed. Specific sensors are available for zinc and cadmium; copper; lead; Cr6+; nickel; mercury.

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82 Advantages of eukaryotic biosensor vs prokaryotic biosensors A distinct advantage in using eukaryotic microorganisms is that they can be used to give information more directly applicable to higher eukaryotes and humans. For example, the effect of particular toxins and mutagens may be quite different in prokaryote cells than in eukaryote cells. Furthermore, the sequencing of a large numbers of genome and the development of cloning vectors now provides the means to construct whole cell sensor elements able to respond to specific molecules as is required in any analytical sensing, for example in environmental analysis and clinical diagnosis.

83 Schema degli eventi cellulari che determinano l espressione della proteina reporter (negli eucarioti)

84 Examples of Eukaryotic Whole Cell Biosensors Yeast based biosensor Dictyostelium discodeum Dicty Test Tetry test Tetrahymena thermophila protozoan ciliate Prof. S. Bozzaro Università di Torino Drs A. La Terza, S. Barchetta, Ting Yu P. Ballarini C. Miceli Università di Camerino

85 Why Ciliates may represent a valid alternative to the use of animals? Potential for Biotech Innovation Eukaryotic, bi-nuleated, single-celled, free-living organisms, They are useful for both in vivo/in vitro tests Directly exposed to environmental change fast and sensitive responses Easy handling and fast growing (generation time: 1 hour half) Genomic data (Tetrahymena, Paramecium, Euplotes) and established molecular methods are available Excellent model for gene expression and regulation studies Cell factory: SAFE, PRODUCTIVE & CHEAP! Expression of human therapeutical enzymes, useful vaccines (e.g.: anti malaria), etc. (Eco)Toxicological studies and environmental monitoring

86 .and among them, Tetrahymena thermophila occupies a leading position! Tetrahymena provided fundamental knowledge in different fields of cellular biology as its study lead to the discovery: of the molecular structure of telomeres, telomerases enzyme; of catalytic RNA (ribozymes); of the function of histone acetylation; of the roles of RNA interference like pathway in the heterochromatin formation;

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