PROGRAMMA DI RICERCA LINEA 3.6 LO STUDIO DELLA BIODIVERSITÀ PER UN EQUILIBRIO FRA CONSERVAZIONE E SFRUTTAMENTO IN LAGUNA DI VENEZIA

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1 1 PROGRAMMA DI RICERCA LINEA 3.6 LO STUDIO DELLA BIODIVERSITÀ PER UN EQUILIBRIO FRA CONSERVAZIONE E SFRUTTAMENTO IN LAGUNA DI VENEZIA Responsabile scientifico: Danilo Mainardi Dipartimento di Scienze Ambientali, Università Ca Foscari di Venezia Dipartimento di Biologia, Università degli studi di Padova Museo di Storia Naturale di Venezia CNR-ISMAR, sede di Venezia Sezione Dinamica delle Grandi Masse CNR- ISMAR, sede di Venezia Sezione Biologia del Mare CNRS - Montpellier DU IUAV (VE) ICRAM (VE)

2 INDICE 2 Sezione 1. Informazioni scientifiche e gestionali generali riassuntive 1.1 Risultati generali del progetto di ricerca (in italiano) 1.2 Risultati generali del progetto di ricerca (in inglese) 1.3 Risposte alle domande del bando Domanda Domanda Sintesi del progetto di ricerca (in italiano) 1.5 Sintesi del progetto di ricerca (in inglese) 1.6 Elenco dei contenitori dei risultati ( deliverables ) e loro tipologia di trasmissione Pubblicazioni prodotte Software Database Cartografia Altro 1.7 Composizione gruppo di ricerca 1.8 Aspetti innovativi da approfondire ulteriormente Sezione 2. Aspetti gestionali della ricerca 2.1 Macroattività (WP), unità operative coinvolte e loro integrazione 2.2 Iniziative di coordinamento specifiche 2.3 Gestione del budget Problematiche inerenti gli aspetti di budget Cofinanziamenti ricevuti da altre organizzazioni / Enti Valorizzazione del cofinanziamento da parte delle Istituzioni partecipanti Sezione 3. Informazioni di sintesi sugli argomenti rilevanti oggetto della ricerca 3.1 Descrizione degli argomenti 3.2 Argomento Composizione unità operativa Obbiettivi

3 3.2.3 Attività preliminari Attività in campo ed in laboratorio Elaborazioni Risultati ottenuti Pubblicazioni prodotte Bibliografia di riferimento 3.3 Argomento Composizione unità operativa Obbiettivi Attività preliminari Attività in campo ed in laboratorio Elaborazioni Risultati ottenuti Pubblicazioni prodotte Bibliografia di riferimento 3.4 Conclusioni e osservazioni 3 Sezione 4. Allegati Elenco allegati

4 1. INFORMAZIONI SCIENTIFICHE E GESTIONALI GENERALI RIASSUNTIVE Risultati generali del progetto di ricerca (in italiano) Lo studio della comunità ittica della laguna di Venezia (WP1) ha consentito di individuare due habitat chiave per il mantenimento della biodiversità: le praterie di fanerogame e le aree di barena (in particolare i ghebi ). Questi habitats infatti supportano un elevato numero di individui e di specie (soprattutto nella stagione estiva) e due comunità tipiche, composte da specie che rivestono ruoli ecologici differenti. Nelle praterie di fanerogame, situate in prossimità delle bocche di porto, o comunque in zone vivificate dal mare, dominano le specie di pesci ago (singnatidi) e il gò (Z. ophiocephalus), un gobide di grandi dimensioni, specie target della pesca artigianale in laguna di Venezia. Queste sono tutte specie residenti, che svolgono il loro intero ciclo vitale nell ambiente lagunare. Nei ghebi, invece, le specie dominanti, con elevate abbondanze, sono per lo più specie di piccola taglia, quali i gobidi di piccole dimensioni (localmente chiamati marsioni ) e i cefali (Mugilidi). Mentre i primi sono per lo più residenti, le specie appartenenti alla famiglia dei Mugilidi sono per lo più marine e migratrici. Esse entrano in laguna per alimentarsi ed accrescersi e spesso utilizzano il ghebo come nursery, ambiente cioè dove gli individui giovanili possono alimentarsi e accrescersi, protetti dai predatori. L individuazione di questi due habitat chiave ha messo in evidenza l importanza della capacità di strutturare l ambiente, più che di altri parametri (ambientali), nel determinare la funzionalità degli habitats all interno dell ecosistema lagunare. Le ricerche svolte presso del Dipartimento di Biologia dell Università di Padova hanno riguardato la variabilità genetica e molecolare (WP2). I risultati indicano che nella Laguna di Venezia esista un unica popolazione geneticamente omogenea del gobide Zosterissor ophiocephalus. Mentre differenti risultano le risposte individuali (alterazioni citologiche e modificazioni delle attività enzimatiche) in funzione del degrado della qualità dell ambiente lagunare. In Z. ophiocephalus sono state prodotte EST (sequenze che identificano circa 967 geni espressi nei tessuti del go ); in Mytilus. galloprovincialis sono state rese disponibili EST (circa 1746 geni trascritti in mitilo) e portato alla definizione del MYTarray 1.0 (cdna microarray a scala genomica). Entro questo progetto sono stati avviati i primi esperimenti di validazione del microarray. I rischi per l ecosistema lagunare di composti antivegetativi di nuova generazione, alternativi agli stannorganici, sono stati valutati attraverso i loro effetti sull insediamento larvale e sulla sopravvivenza degli individui usando l ascidia coloniale Botryllus schlosseri come modello sperimentale. I risultati ottenuti indicano un elevata pericolosità di queste sostanze per gli organismi, in alcuni casi simile al TBT, che rischia di avere gravi conseguenze per la biodiversità lagunare. Lo studio delle comunità bentoniche nella laguna di Venezia (WP4) è partito dalla catalogazione di dati provenienti da studi sugli invertebrati bentonici di fondo mobile effettuati nel bacino settentrionale della laguna di Venezia. Dall analisi di questi dati è risultata una lista di specie e tabelle di contingenza. Per quanto riguarda i dati più antichi, la lista di specie è stata corretta alla luce della revisione della collezione di animali depositata presso il Museo Civico di Storia Naturale di Venezia. L uso di strumenti statistici e delle conoscenze sulla autoecologia delle specie (adattamenti fisiologici, abitudini alimentari, ciclo biologico, relazioni interspecifiche) ha fornito una mappatura della distribuzione degli invertebrati bentonici in vari periodi (1948, 1968, ) e la classificazione biologica dei vari habitat. Questo lavoro è stato funzionale alla pianificazione di nuovi campionamenti, effettuati stagionalmente lungo l estuario del Dese. I risultati hanno evidenziato una distribuzione spaziale degli invertebrati determinata dall idrodinamismo e un incremento di specie tolleranti l arricchimento organico all aumento del grado di trofia delle acque dimostrando come gli invertebrati siano indicatori delle condizioni ambientali.

5 Il lavoro di monitoraggio di alcune specie bentoniche alloctone in laguna di Venezia (WP3) ha dato i seguenti risultati. L introduzione, volontaria o meno, di specie esotiche in aree non native non solo compromette in modo grave gli equilibri ecologici delle singole aree interessate ma riduce anche la diversità biologica in un processo di tipo generale. Le specie alloctone, risultando più competitive rispetto alle specie locali e non incontrando nei nuovi habitat adeguati competitori naturali, possono infatti sostituirsi più o meno rapidamente alle specie autoctone provocandone spesso la riduzione e talvolta l eventuale scomparsa. La presente ricerca ha quindi voluto fornire un quadro inedito e aggiornato sulla presenza e diffusione di alcune specie esotiche del macrozoobenthos nella laguna di Venezia, raccogliendo inoltre dati in merito alla frequenza relativa delle diverse specie rispetto alle entità autoctone e alle condizioni locali. Le prime elaborazioni sui dati raccolti in un database appositamente creato hanno consentito di individuare alcune specie candidate alla colonizzazione della laguna di Venezia, in quanto particolarmente compatibili con le caratteristiche locali. I dati forniti dalla campagna sperimentale, effettuata tra i mesi di maggio e settembre del 2002, hanno permesso la redazione di carte distributive relative a ciascuna specie oggetto di studio nelle diverse aree lagunari. I risultati ottenuti per l intero bacino sono stati analizzati per comprendere le dinamiche di diffusione e acclimatazione delle specie in esame e le interazioni evidenziabili sulle specie locali. In particolare, riguardo alle specie di interesse commerciale, sono stati rilevati effetti indotti dallo sfruttamento antropico con mezzi particolarmente impattanti per gli equilibri delle comunità bentoniche. Il quadro risultante appare articolato e piuttosto eterogeneo dal momento che l introduzione di specie esotiche in un ambiente particolare per caratteristiche ambientali ed ecologiche quale appunto la laguna di Venezia sembra produrre risultati molto diversi, in funzione di numerose variabili. Sono stati in effetti documentati diversi gradi di successo, inteso come frequenza relativa degli individui e come percentuale di ritrovamento nelle diverse stazioni, nell acclimatazione delle specie alloctone. Talvolta ad un primo insediamento segue un apparente estinzione, come nel caso del Mollusco Bivalve Saccostrea commercialis (Iredale & Roughley, 1933) la cui diffusione in laguna è risultata solo temporanea. In altri casi si sono osservati veri e propri fenomeni di esplosione demografica seguiti da un successivo assestamento su valori inferiori, come è accaduto per il Crostaceo Decapode Dyspanopeus sayi (Smith, 1869) e per il Mollusco Bivalve Scapharca inaequivalvis (Bruguière, 1789). Infine, per talune specie si è verificata una diffusione massiccia con sostanziale colonizzazione di ogni ambiente disponibile, come nei casi di Tapes philippinarum (Adams & Reeve, 1850) nei substrati mobili e Crassostrea gigas (Thunberg, 1793) in quelli solidi. Molto articolato appare anche il quadro relativo ai fenomeni di interazione. In alcuni casi l introduzione di specie alloctone non sembra produrre alcun effetto sulle specie locali, come accade per il bivalve Cerastoderma glaucum (Poiret, 1789) la cui diffusione in laguna è rimasta pressoché immutata nonostante l arrivo di Scapharca inaequivalvis negli stessi ambienti distributivi potesse dare origini a fenomeni di competizione. Analoga pare la situazione dell autoctono granchio Carcinus aestuarii Nardo, 1847, che non sembra risentire della presenza dell esotico Dyspanopeus sayi. In altri casi si è potuta invece osservare una drastica riduzione, fino alla scomparsa quasi totale o completa, delle specie autoctone in esame. Appare infatti significativa la situazione della vongola verace Tapes decussatus (Linnaeus, 1758), presente ormai solo nei siti non sottoposti all intensa pressione di pesca esercitata sull affine vongola filippina Tapes philippinarum. Ancora più pesante è stato l impatto dell ostrica Crassostrea gigas sulla locale Ostrea edulis Linnaeus, 1758, che sembra essere completamente scomparsa dall ambito lagunare. Il contenuto di DNA nucleare totale ed il contenuto nucleare di DNA composto dalle coppie di basi Adenina e Timina è stato determinato, tramite analisi citofluorimetrica in flusso, per otto specie della famiglia Syngnathidae e per otto della famiglia Gobiidae (WP5), che caratterizzano la fauna ittica della Laguna di Venezia. I dati sono originali ed in gran parte non apparsi in letteratura. 5

6 1.2 Risultati generali del progetto di ricerca (in inglese) 6 The study of the fish assemblage in the Venice Lagoon (WP1) allowed the identification of two key habitats which play a significant role in maintaning biodiversity: the seagrass meadows and the salt marsh areas (in particular the salt marsh creeks, locally named ghebi ). In fact, these habitats support high fish abundances and number of species (particularly during the Summer) and are characterized by two typical fish assemblages. In the seagrass meadows, which are located near the sea inlets or in areas where the marine influence is high, the fish assemblage is dominated by pipefishes (family Syngnathidae) and by the grass goby (Z. ophioceophalus, family Gobiidae), a large-sized goby which is the target of the artisanal fishery in the lagoon. These are resident species, wich spend their entire life cycle within the lagoon environment. In turn, the fish assemblage in the salt marsh creeks ( ghebi ) is dominated mainly by small-sized species, such as small-sized gobies (locally named marsioni ) and the mullets juveniles (family Mugilidae). The first group is composed mainly by resident species, whereas the species of mullets are marine migrants. They enter the lagoon and use this environment, the ghebi in particular, as a nursery, where the juveniles feed and grow, taking shelter from the predators. The identification of these two key habitats highlighted the importance of the habitat structure, more than other environmental abiotic variables, in determining its functional role within the lagoon ecosystem. The researches developed at the Biology Department of the Padua University have been focussed on the genetic and molecular variabilty (WP2). The results indicate that the lagoon population of the grass goby Zosterisessor ophiocephalus is genetically uniform and homogeneous. On the contrary, the individual responses (nuclear damage and modifications of biochemical activity patterns) of organisms living in badly polluted sites are consistent with the level of chemical risk. In Z. ophiocephalus ESTs (sequences univocally tagging about 967 genes transcribed in the grass goby) have been produced. Based on a previously launched collaborative study, ESTs of Mytilus galloprovincialis (about 1746 independent mussel transcripts) are now available and MYTarray 1.0 (genome-wide DNA microarray) has been defined. In addition, the colonial ascidian Botryllus schlosseri has been used as an experimental model to evaluate the risks of new antifouling compounds, alternative to organotins through the study of their effects on larval settlement and individual survival. Results indicate high potential toxicity of such antifouling compounds, sometimes similar to TBT, for aquatic life and the risk of severe consequences for the Lagoon biodiversity. The voluntary or involuntary introduction of exotic species into non-native areas not only seriously compromises the ecological balance of the single areas interested but also reduces the biodiversity in a general type of process (WP3). Allochthonous species (now also named NIS - Non Indigenous Species), proving more competitive compared with local species and not finding any natural competitors up to them in the new habitats, can in fact more or less rapidly replace the autochthonous species and often cause a decrease in their number and sometimes even their disappearance. This research has therefore meant to provide an unpublished and up-to-date picture of the presence and distribution of some exotic species of the macrozoobenthos in the Venice Lagoon; in addition, it has gathered data concerning the relative frequency of the different species compared with the autochthonous entities and the local conditions. The first data processing gathered in a specially made data base has allowed to single out some species likely to colonize the Venice lagoon, in that they are particularly compatible with the local characteristics. The data provided by the experimental campaign carried out between May and September 2002, have brought to the drawing of distribution maps of each species studied in the different lagoon areas. The results obtained for the whole basin have been analysed in order to understand the diffusion and acclimation mechanisms of the examined species and the interactions shown on local species. In particular, as for commercial species, remarkable effects provoked by men s exploitation through means having a severe impact on the balance of benthic communities have been observed.

7 The outcome appears quite articulated and heterogeneous, since the introduction of allochthonous species in such a peculiar environment like Venice lagoon, due to environmental as well as ecologic characteristics, seems to give very different results, depending on numerous variables. The research has documented different degrees of success, understood as relative frequency of the individuals, finding rates in the different stations and acclimation of the allochthonous species. Sometimes, an initial settlement is followed by an apparent extinction, as is the case with the bivalve mollusc Saccostrea commercialis (Iredale & Roughley, 1933) whose diffusion in the lagoon has proved only temporary. Other times true phenomena of demographic explosion have been observed, followed by a successive settlement phase around lower values, as with decapod crustacean Dyspanopeus sayi (Smith, 1869) and bivalve mollusc Scapharca inaequivalvis (Bruguière, 1789). Finally, for some species a massive diffusion with substantial colonization of all available environments has been noticed, as with Tapes philippinarum (Adams & Reeve, 1850) on mobile substrata and Crassostrea gigas (Thunberg, 1793) on solid ones. The picture concerning the interaction phenomena is also very articulated. In some cases the introduction of allochthonous species doesn t seem to produce any effects on the local species, as happens with the bivalve Crassostrea gigas whose diffusion in the lagoon has remained unvaried in spite of the fact that the arrival of S. i. in the same distribution areas might give rise to competition phenomena. Similar is the situation of the autochthonous crab Carcinus aestuarii Nardo, 1847, which doesn t seem to be affected by the presence of the exotic Dyspanopeus sayi. In other cases a drastic reduction has been observed, until the almost total or even complete disappearance of the autochthonous species under scrutiny. For instance, the situation of the clam Tapes decussates (Linnaeus, 1758) appears quite significative, in that it is present only on those sites which are not subject to the intense fishing pressure exerted on the similar Philippinean clam Tapes philippinarum. The impact of the ostrich Crassostrea gigas on the local Ostrea edulis Linnaeus, 1758 has been even harder, considering the latter seems to have completely disappeared from the lagoon. The study of the benthic community of the Venice lagoon (WP4) began with catalogation of data coming from soft bottom invertebrates studies carried out in northern basin of Venice lagoon; a species list and contingency tables were written out from data analysis. Concerning older data, the list was corrected after revision of animal collection kept in the Museo Civico di Storia Naturale di Venezia. Statistical tools and knowledge of species autoecology provided a map of benthic invertebrates distribution during different periods (1948, 1968, ) and biological classification of several communities. This work was useful to plannig new samplings carried out seasonally along Dese estuary. Results stressed a spatial distribution of invertebrates influenced by water dynamics and an increasing of species tolerant to excess organic matter enrichment showing as invertebrates are indicators of enviromnental conditions. Total nuclear DNA content and nuclear content of DNA composed by the base pair Adenine- Tymine were determined through flow cytrometric analysis in sixteen species of the fish fauna of the Venetian Lagoon. Eight species belong to the family Syngnathidae and eight to the family Gobiidae (WP5). Reported data are original and never reported in literature Risposte alle domande del bando Nella Laguna di Venezia è possibile effettuare valutazioni del reale rischio di erosione della biodiversità delle principali specie alieutiche oggetto di sfruttamento commerciale e quali sono le condizioni (sotto il profilo di diversità genetica, stress ed altro) delle loro popolazioni? Lo studio condotto su Zosterisessor ophiocephalus ha portato all acquisizione di un set integrato di informazioni, utili alla comprensione della biologia della specie, alla storia della popolazione della laguna di Venezia, alla valutazione delle risposte individuali alle variazioni

8 ambientali naturali e dipendenti dall azione dell uomo. Significativi al riguardo i dati sui sistemi gene-enzima, sulla variabilità di loci microsatelliti, sulle alterazioni nucleari (test Cometa), sulle attività biochimiche (P450), sulla espressione di specifici geni in rapporto allo stato funzionale. L estensione di alcune delle indagini a Mytilus galloprovicialis, e l utilizzazione di dati precedentemente ottenuti ha portato alla disponibilità delle stesse metodologie di indagine per due specie di riferimento dell ecosistema lagunare. Così, le risposte specie-specifiche alle condizioni ambientali possono essere valutate utilizzando parametri comparabili. In sintesi si tratta dei livelli di polimorfismo, indici di fissazione, indici di similarità e distanza genetica, indicatori di danno nucleare, indici di attività enzimatica. Estremamente innovativo e molto promettente è l indice basato sull analisi dell espressione genica (profili di espressione a scala genomica). Tale indice, già applicato con successo nella diagnostica clinica, potrebbe in un futuro prossimo rivelarsi uno strumento d avanguardia, diagnostico delle risposte biologiche indotte da stress nelle popolazioni lagunari di mitili. Nello stesso tempo, differenze nell espressione di specifici geni in specifici tessuti potrebbero fornire informazioni essenziali su processi biologici fondamentali (sviluppo e riproduzione) che nelle specie lagunari d interesse non sono finora stati studiati in modo adeguato. L utilizzo di pannelli di legno e acciaio, che mimano le strutture sommerse nella laguna di Venezia, rivestiti di vernici ad azione antivegetativa scelte tra quelle più in uso nel bacino lagunare, fornisce dati sulla struttura delle comunità a macrofouling di substrato duro e sulla erosione della bioiversità legata agli effetti delle combinazioni di biocidi in esse contenuti. Sono stati usati, come descrittori della biodiversità: 1. la ricchezza in specie espressa come andamento temporale del numero di specie presenti sui pannelli; 2. la struttura della comunità, espressa come percentuale dei singoli taxa rispetto al totale che forma la comunità su ogni pannello; 3. l indice di copertura-abbondanza, ottenuto dalla scala di indici di Benninghoff, che fornisce un analisi quantitativa della capacità di insediamento delle varie specie; 4. l indice di similarità, che misura la somiglianza tra due liste faunistiche col numero delle specie in comune rispetto al totale delle specie censite nei due campioni; tra i vari algoritmi è stato scelto l indice di Sørensen Esistono elementi ambientali che possono essere considerati chiave per il mantenimento della biodiversità in ambiente lagunare? L analisi della comunità ittica dei bassi-fondi lagunari, svolta nell ambito del WP1, ha permesso di individuare alcuni habitat che si possono considerare chiave, in quanto caratterizzati da peculiari combinazioni di specie, elevate abbondanze e alta diversità specifica. Il campionamento della fauna ittica, essendo stato stratificato per tipologia di habitat, ha consentito infatti di ottenere dati circa la composizione della comunità, le abbondanze totali e/o delle singole componenti la comunità e le dinamiche temporali della comunità stessa, in relazione alle caratteristiche di ciascun habitat. I risultati hanno messo in evidenza il ruolo strutturante dell habitat caratterizzato dalla copertura continua di praterie di fanerogame, in quanto esso sostiene una ben definita e peculiare comunità ittica, la cui composizione rimane costante nel tempo. Tale comunità è costituita da un ben riconoscibile e altamente specializzato gruppo di specie, che svolge l intero ciclo vitale sulle praterie stesse grazie ad una serie di peculiari adattamenti a tale habitat. Tra queste specie, le più abbondanti e tipiche sono alcuni rappresentanti della famiglia Singnatidi (Syngnathus typhle, Syngnathus abaster e Nerophis ophidion) e il gobide Zosterisessor ophiocephalus. Il pesce ago Syngnathus abaster è inserito nella red list (IUCN) quale specie di cui si ha carenza di conoscenze scientifiche ( data deficient ), mentre il gobide Zosterisessor ophiocephalus ha un interesse alieutico, essendo uno dei principali target della pesca artigianale locale. Un altro habitat che svolge un ruolo di rilievo è costituito dai fondali nudi a substrato fangoso delimitati dai ghebi : in tali habitat, la comunità ittica ha un marcato andamento stagionale, che corrisponde ad un preciso ciclo di colonizzazione da parte delle specie ittiche. Il confronto delle densità ittiche fra habitat rivela che i ghebi sostengono un più alto numero di individui rispetto alle altre tipologie, e tale differenza è 8

9 particolarmente marcata in primavera ed estate. La comunità ittica peculiare di questi habitat annovera sia forme giovanili di specie migratrici di interesse alieutico, appartenenti alle famiglie Mugilidi ed Engraulidi, per le quali tali aree rivestono un ruolo di nursery (funzione di rifugio e di accrescimento), sia specie endemiche inserite nella direttiva habitat (92/43/EEC), quali Knipowitschia panizzae, Pomatoschistus canestrinii e Aphanius fasciatus, che utilizzano tali habitat per scopi trofici, riproduttivi e/o come aree di rifugio. È proprio la struttura di questi due habitats a determinarne la funzionalità, in chiave di distribuzione e supporto della comunità ittica: la capacità di strutturare l ambiente sembra, infatti, determinare, maggiormente di quanto facciano gli altri fattori abiotici, la funzionalità degli habitat all interno dell ecosistema lagunare. Un attenzione particolare a tali habitat è quindi richiesta per l elaborazione di qualsivoglia progetto gestionale e/o conservazionistico in laguna di Venezia. Informazioni utili per l individuazione di elementi chiave per il mantenimento della biodiversità possono provenire anche da indagini a livello popolazionistico-individuale (WP2). La sopravvivenza dei singoli individui in una popolazione è requisito fondamentale per la sopravvivenza della popolazione stessa. Le risposte variate in funzione delle specie studiate sottolineano la complessità dei fenomeni e la difficoltà a trovare una soluzione unica valida per ogni taxon. Il set di metodologie messo a punto ha reso disponibile una serie di strumenti per il monitoraggio continuo della situazione. I profili di espressione genica nel mitilo e nel go sono potenziali descrittori di stato funzionale riferibile a singoli individui e a campioni di popolazione. Il sistema immunitario garantisce il riconoscimento e la eliminazione di potenziali patogeni e rappresenta un sistema altamente organizzato ed integrato, il corretto funzionamento del quale permette il mantenimento delle funzioni vitali dell organismo. Il danno individuale può essere valutato a livello nucleare e biochimico. In termini diagnostici, e con riferimento agli elementi chiave per il mantenimento della biodiversità, la condizione di sofferenza diffusa osservata, con i massimi associati alle condizioni di maggiore distorsione ambientale, sottolinea un certo grado di rischio per le popolazioni lagunari. L unicità della popolazione dal punto di vista genetico in Zosterisessor ohiocephalus suggerisce che il processo di adattamento genetico non si rifletta in cambiamenti di frequenze geniche. Fondamentale pare il mantenimento della possibilità di flusso genico fra le diverse zone lagunari e, in ogni caso, il recupero della qualità dell ambiente Quali metodi di studio possono essere utilizzati per l individuazione di descrittori della biodiversità e del ruolo svolto nel funzionamento dell ecosistema lagunare? Quale importanza rivestono i flussi di scambio mare-laguna per il mantenimento degli equilibri interni all acosistema? È difficile pensare di poter quantificare la biodiversità attraverso l impiego di una misura univoca, e quindi, anche per descrivere la diversità della fauna ittica (WP1) sembra più appropriato utilizzare una serie di indici, opportunamente scelti per condensare il maggior numero di informazioni nel modo più sintetico possibile; è chiaro che la scelta degli indici non può essere determinata a priori, ma va affrontata caso per caso. Generalmente, gli indici utilizzati sono i classici indici di diversità, che hanno il vantaggio di offrire misure facilmente confrontabili, essendo ampiamente utilizzati in molte discipline, ma ci si può affidare anche a indici più complessi, che forniscono una stima più accurata del numero di specie. La cosa più importante è che gli indici siano scelti in modo da evitare i più sensibili e quelli troppo robusti, per non enfatizzare determinati fenomeni o mascherare completamente alcuni pattern. Gli indici di diversità potrebbero essere associati ad altri parametri di carattere più generale per descrivere la comunità, perché una maggior comprensione dei meccanismi che determinano la struttura della comunità favorisce la capacità di capire la diversità e la sua distribuzione. A tal proposito, anche l indagine dell influenza dei parametri ambientali può portare un contributo alla conoscenza dei meccanismi dell ecosistema che regolano la biodiversità. Una volta stabilito l effetto delle forzanti ambientali sulla comunità ittica e sulla sua diversità, diventa più facile anche comprendere l effetto dell interazione con le acque marine, che su molti parametri ambientali è importantissimo (ad esempio per tutti i parametri di qualità dell acqua). Inoltre, lo scambio di acque tra mare e laguna è importante perché provoca (nel 9

10 caso di trasporti passivi), o comunque facilita (per gli spostamenti attivi) il movimento di individui, in entrata ed in uscita dalla laguna, influenzando direttamente il numero di specie effettivamente riscontrabili. Un altro approccio utile sia all individuazione di descrittori della funzionalità dell ecosistema lagunare, sia allo studio dei flussi mare-laguna, è quello dato dall analisi della comunità ittica in termini di composizione in guild funzionali. L uso delle guild, e cioè di raggruppamenti di specie che insistono su un set comune di risorse, permette una descrizione funzionale della comunità, che è maggiormente basata sui ruoli ecologici delle specie che sulla loro collocazione tassonomica. Per le comunità ittiche estuarine, è stato proposto l utilizzo di guild ecologico-funzionali (Elliot & Dewailly 1995) che sono basate sulle modalità con le quali le specie ittiche utilizzano l habitat lagunare. Sono stati proposti 6 raggruppamenti funzionali: residenti estuarini (intero ciclo vitale in laguna), marini occasionali (specie marine, occasionalmente presenti in ambiente lagunare), diadromi (che svolgono migrazioni sistematiche tra mare e laguna, o tra laguna e mare per scopi riproduttivi), migratori stagionali (che entrano in laguna in certe fasi stagionali per scopi trofici), migratori giovanili (che entrano in laguna come forme giovanili per accrescersi e rifugiarsi in determinati habitat, le così dette nursery), specie dulciacquicole (specie di acqua dolce, occasionalmente presenti in laguna). Le variazioni spazio-temporali del contributo percentuale, in termini di abbondanza e/o numero di specie, delle diverse guild funzionali nella comunità ittica, possono dunque essere un indicatore dei cambiamenti delle modalità di utilizzo di quel determinato habitat da parte delle specie ittiche e quindi, indirettamente, di eventuali trasformazioni subite dall habitat stesso. Per esempio, i risultati ottenuti nell ambito degli studi della comunità ittica svolti dalla WP1 indicano il ruolo di transito di alcune aree lagunari durante determinate fasi stagionali, quali la primavera e l autunno, in quanto è in questo periodo che viene registrato un maggiore contributo in termini di abbondanza del gruppo funzionale dei migratori giovanili. Analogamente, il maggior influsso marino cui determinate aree possono essere soggette, dovuto alla vicinanza alle bocche di porto o all influenza di canali di più o meno recente costruzione, può essere evidenziato da un maggior contributo del gruppo dei marini occasionali o dei migratori stagionali nella comunità ittica. Anche gli studi relativi alla biodiversità a livello di comunità bentoniche (WP4) hanno messo in luce l utilizzo dei gruppi ecologici come un metodo d indagine adeguato per valutare lo stato ed il funzionamento delle comunità biologiche. L aggregazione delle specie in gruppi ecologici omogenei da un punto di vista delle risposte all arricchimento organico, ha messo in evidenza la stretta relazione fra specie e condizioni ambientali. Il metodo richiede un maggiore dettaglio nella definizione dei gruppi vista la carenza di informazioni sul ruolo ecologico di alcune specie; questo apre nuove prospettive di ricerca volte ad approfondire il ruolo ecologico di tali specie, soprattutto in relazione alle strategie riproduttive ed al grado di sensibilità all arricchimento organico. Tali studi hanno, inoltre, messo in evidenza l influenza della vivificazione marina nel determinare struttura ed organizzazione delle comunità bentoniche. I dati sul contenuto di DNA nucleare (WP5) possono, innanzi tutto, essere utilizzati direttamente nella stima dell exergia degli ecosistemi, secondo quanto proposto da Fonseca et al. [2000]. Le stime dell exergia (quantità massima di energia che, in un sistema, può essere trasformata in altre forme di energia) consentono di valutare lo stato di salute degli ecosistemi e l impatto ambientale dovuto all eutrofizzazione. Inoltre il contenuto di DNA nucleare si è dimostrato avere un effetto diretto su alcuni parametri biologici fondamentali quali, ad esempio, tasso di ricombinazione dei caratteri, tasso metabolico, velocità di sviluppo, e longevità. Tale effetto ha conseguenze dirette ed indirette sulla biodiversità (diversità genetica e nella di risposta all azione dell ambiente). 10

11 1.3.4 Come può essere quantificato in termini di biodiversità l effetto dell introduzione di specie alloctone in ambiente lagunare? Quali potrebbero essere gli effetti dello sfruttamento di possibili nuove risorse? L introduzione di specie alloctone può essere considerato una delle cause principali di alterazione della biodiversità. Da una sostanziale coabitazione senza ripercussioni evidenti sulle specie locali si passa a fenomeni di interazione molto pesanti, fino alla pressoché totale o completa sostituzione delle specie autoctone occupanti le stesse nicchie ecologiche, come riscontrato ad esempio per l indigena vongola verace Tapes decussatus e per l ostrica locale Ostrea edulis nei confronti, rispettivamente, delle alloctone Tapes philippinarum e Crassostrea gigas. In ambienti acquatici l introduzione è spesso un azione consapevole e volontaria, volta a migliorare la resa dello sfruttamento di specie allevate. In Laguna di Venezia questo processo può essere esemplificato attraverso il caso dell introduzione di Tapes philippinarum, avvenuta, in via sperimentale, nei primi anni 80. Dal punto di vista della molluschicoltura questa introduzione si è rivelata sicuramente un successo, diventando ben presto una risorsa sfruttabile commercialmente, tanto da arrivare a rappresentare il 50% della produzione nazionale di vongole. Tuttavia gli effetti sulla biodiversità si sono manifestati altrettanto velocemente, tanto che T. philippinarum è diventata una specie dominante, causando una drastica riduzione della diversità della macrofauna bentonica. Inoltre, agli effetti determinati dalla competizione diretta tra le specie, talvolta si possono aggiungere fenomeni di impatto determinati dallo sfruttamento delle nuova risorsa da parte dell uomo. Nel caso della vongola filippina Tapes philippinarum l impatto sull ecosistema lagunare e sulle popolazioni bentoniche causato dall azione umana sembra in effetti essere determinante anche nel ridurre ulteriormente la fitness della specie locale. Inoltre, lo sfruttamento di questa risorsa influenza anche le altre tipologie di pesca: in particolare per la pesca con i cogolli, è stato registrato un calo delle catture, anche se non direttamente imputabile alla pesca alle vongole. Simulazioni effettuate grazie all utilizzo di un modello a bilancio di massa della rete trofica della laguna di Venezia, permettono di affermare che la sospensione della pesca meccanica alle vongole comporterebbe un sensibile aumento delle catture degli attrezzi tradizionali (30% in peso, corrispondente ad un aumento del guadagno del 50%), mantenendo costante lo sforzo di pesca In che modo i diversi metodi di sfruttamento delle risorse naturali possono influenzare la diversità biologica in ambiente lagunare? I principali sistemi di sfruttamento delle risorse alieutiche in Laguna di Venezia sono due: la pesca meccanica al Tapes philippinarum e la pesca tradizionale con i cogolli. L effetto sulla biodiversità provocato da queste due tipologie di pesca è molto diverso, non solamente perché la composizione delle catture è molto diversa, ma soprattutto perché la principale fonte di intaccamento della diversità è imputabile all alterazione dell ambiente lagunare. L impatto maggiore, infatti, è quello che la pesca alle vongole provoca in relazione alla distruzione degli habitat in cui è praticata, alcuni dei quali, così come è spiegato anche nella risposta alla domanda 1.3.2, sono delle strutture fondamentali al mantenimento della diversità in ambiente lagunare Sintesi del progetto di ricerca (in italiano) Il progetto di ricerca ha affrontato lo studio della biodiversità nella laguna di Venezia a 4 livelli: di comunità (ittica e bentonica), di specie, di popolazione e genetica. Questo studio ha tentato non solo di monitorare alcune componenti della biodiversità lagunare e costiera, ma anche di comprendere i meccanismi che ne sottendono la regolazione e il mantenimento. Di seguito si riporta una sintesi dei risultati ottenuti ai diversi livelli. Comunità ittica (WP1): l analisi della comunità ittica è stata condotta mediante l integrazione di due diversi metodi di campionamento, che si sono rivelati complementari, e che hanno dunque permesso la raccolta di dati rappresentativi di questa componente della biodiversità lagunare e

12 costiera. Un metodo, quello basato su reti da posta e quindi su uno strumento passivo di campionamento, ha permesso il monitoraggio della comunità ittica in quattro aree lagunari, rappresentative di diverse tipologie ambientali e dei tre diversi sotto-bacini in cui la laguna stessa è suddivisa. Il secondo metodo, basato su reti da circuizione e quindi su un sistema attivo di campionamento, ha permesso la raccolta di dati standardizzati semi-quantitativi relativamente a un reticolo di 6 stazioni distribuite su tutta l area lagunare e stratificate per tipologia di habitat. Per questo tipo di campionamento sono state individuate 5 tipologie di habitat, sulla base di caratteristiche morfologiche generali e della tipologia di substrato. L integrazione di questi due metodi ha permesso di ottenere una lista tassonomica della fauna ittica lagunare, che annovera nel complesso circa 60 specie. Sono poi stati correlati i principali descrittori della comunità ittica (indici di diversità e equitabilità, abbondanza totale o contributo relativo di alcune componenti) con la struttura degli habitat e con i fattori abiotici caratterizzanti le varie stazioni e aree campionate. La composizione della comunità è stata studiata sia in termini tassonomici che funzionali, utilizzando, per quest ultimo aspetto, dei gruppi eco-funzionali (guild), basati sul comune ruolo ecologico delle specie che li compongono. Analisi sia uni- che multivariate hanno permesso di indagare le variazioni spazio-temporali delle comunità ittiche, di studiare la relazione fra la struttura delle comunità stesse e parametri ambientali, e di quantificare l influenza relativa dei vari parametri sulla composizione tassonomica e funzionale della comunità. I risultati hanno permesso di individuare gli habitat che meglio strutturano distinte tipologie di comunità ittiche, che sono le praterie di fanerogame marine e le aree comprese fra i ghebi. I parametri che hanno una maggiore influenza sulla comunità ittica sono, infatti, risultati essere la morfologia stessa dell habitat, più che singoli fattori abiotici: se consideriamo la diversità ittica, per esempio, i risultati mostrano una correlazione fra complessità dell habitat (misurata come grado di strutturazione verticale o orizzontale) e numero di specie. Comunità bentonica (WP4 e WP3): I risultati relativi allo studio della biodiversità a livello di comunità macrobentoniche si possono riassumere nei seguenti 2 punti: 1) Modello di distribuzione spaziale: le comunità di Policheti e Molluschi dell estuario del Dese si distribuiscono lungo un gradiente ambientale che si estende dalla bocca di Lido alla palude di Cona; lungo tale gradiente si osserva la presenza di specie marine in prossimità della bocca di porto, di specie talassoidi nell area intermedia dell estuario e di specie lagunari in quella marginale. La classificazione delle comunità è legata alle specie dominanti che subiscono fluttuazioni stagionali soprattutto in funzione del grado di trofia. Il gradiente ambientale che determina la distribuzione spaziale di questi taxa, si può ricondurre all idrodinamismo come fattore principale che influenza salinità, granulometria e grado di trofia. Questo tipo di distribuzione era già stato messo in evidenza negli studi preliminari sull analisi di dati storici; il presente studio aggiunge informazioni sulla variabilità temporale. 2) Biodiversità funzionale: l aggregazione in gruppi ecologici ha messo in evidenza la prevalenza di specie tolleranti l arricchimento organico, detritivore, annuali e multiannuali da un punto di vista delle strategie riproduttive; all incremento del grado di trofia delle acque, si osserva, in alcune aree, un incremento di specie opportuniste con ciclo biologico breve, tolleranti un eccesso di arricchimento tanto da renderle adatte alla vita in sedimenti ridotti. Non sempre i gruppi ecologici sono stati efficaci per una caratterizzazione biologica dell ambiente a causa della mancanza o carenza di informazioni su alcune specie particolarmente abbondanti. Questo apre nuove prospettive di ricerca volte ad approfondire l autoecologia di tali specie, soprattutto in relazione alle strategie riproduttive ed al grado di sensibilità all arricchimento organico. Lo studio delle comunità bentoniche, inoltre si è focalizzato anche sull elaborazione di un quadro aggiornato relativo alla presenza e diffusione delle specie alloctone del macrozoobenthos nella laguna di Venezia e agli effetti eventualmente determinati sulle comunità locali. Si è pertanto proceduto all identificazione di alcune specie alloctone candidate allo studio e appartenenti a uno o più gruppi zoologici del benthos, in base ai dati disponibili sulle dinamiche di diffusione, oltre che al grado di potenziale interferenza con i popolamenti locali e con le attività antropiche (impatto con l ambiente e con le attività umane). E stata quindi realizzata una campagna di campionamenti, 12

13 articolata su 17 stazioni precedentemente individuate al fine di rappresentare le diverse tipologie lagunari, nel periodo compreso fra i mesi di maggio e settembre del I campionamenti hanno interessato sia i substrati solidi che quelli mobili con metodologie adatte alla logistica ed alle finalità della ricerca. L elaborazione dei dati raccolti ha permesso di valutare la distribuzione nel territorio lagunare e la frequenza relativa delle specie target, graficamente riprodotte sotto forma di carte tematiche. E stato inoltre possibile evidenziare fenomeni di interazione tra le specie introdotte e alcune specie autoctone di riferimento. In particolare, riguardo alle specie di interesse commerciale, si sono evidenziati effetti indotti dallo sfruttamento antropico con mezzi particolarmente impattanti sugli equilibri sviluppatisi all interno delle comunità Specie (WP1e WP5): A livello specifico, ci si è focalizzati su due famiglie di Teleostei che presentano una notevole rilevanza ecologica: la famiglia dei Gobidi e quella dei Singnatidi. Queste due famiglie annoverano rispettivamente 9 e 7 specie in laguna di Venezia. Tali specie presentano un piano morfologico e adattamenti ecologici generali molto simili nel loro complesso, ma anche tutta una serie di specializzazioni e adattamenti fini, che, favorendo la ripartizione delle risorse e l utilizzo di diverse nicchie, ne consentono la coesistenza. Tali famiglie rappresentano inoltre una porzione significativa dell intera comunità sia in termini di abbondanza che di biomassa. Il campionamento della comunità ittica sopra descritto, ha permesso di ottenere campioni rappresentativi delle popolazioni delle principali specie lagunari di Singnatidi e Gobidi. Tali campioni, opportunamente preservati, sono stati portati in laboratorio al fine di compiere su di essi misure morfometriche, misure di condizione riproduttiva e analisi di contenuti gastrici. Per mezzo della citometria a flusso, è stato inoltre studiato il contenuto di DNA nucleare nelle specie appartenenti a entrambe le famiglie. Sono stati determinati sia il contenuto di DNA totale che la frazione del genoma costituita dal paio di basi azotate Adenina-Timina. I dati raccolti sono stati correlati con altri dati cariologici provenienti dalla letteratura per confermare le relazione tassonomiche fra le specie e evidenziare alcune tappe dell evoluzione cariologica nei singnatidi e nei gobidi. Si è cercato evidenziare come i parametri citogenetici possa influenzare parametri biologici fondamentali delle specie esaminate. Inoltre, l analisi spaziale delle abbondanze relative di alcune di queste specie, basata su correlazioni e test di contingenza, ha consentito di studiare il grado di segregazione o sovrapposizione che esse presentano nell utilizzo dell habitat, una rispetto all altra. L insieme di queste misure ha consentito di studiare i meccanismi di ripartizione delle risorse e di differenziazione di nicchia all interno delle due famiglie lungo tre assi principali: spazio, cibo e riproduzione. I risultati hanno mostrato che le specie di entrambe le famiglie si segregano nell utilizzo delle risorse, rispetto ad uno o più assi. I gobidi si segregano soprattutto lungo l asse spaziale, con quelli di grandi dimensioni che utilizzano specialmente gli habitat vegetati e quelli di piccole dimensioni che utilizzano gli habitat a substrato nudo, mentre per i singnatidi è molto forte la segregazione trofica, che è anche correlata a differenti morfologie del capo e dell apparato boccale, oltre che a differenti strategie comportamentali alimentari. Particolare attenzione è stata data allo studio dell ecologia e della distribuzione di quelle specie, che sono inserite nella direttiva habitat (92/43/CEE) o nella red list (IUCN). Popolazione e genetica (WP2): Lo studio delle biodiversità genetica a livello di popolazione è stato condotto su esemplari del gobide Zosterisessor ophiocephalus (Perciformes, Gobiidae), utilizzando sistemi gene-enzima e loci microsatelliti quali caratteri marcatori delle eventuali variazioni spazio temporali delle frequenze geniche. Per questo sono stati messi a punto dei metodi di analisi originali e innovativi per 11 sistemi gene-enzima e 11 loci microsatelliti. I campioni di popolazione sono stati raccolti da 5 località della Laguna di Venezia(Ca Zane, Ponte della Libertà, Lido, Lago dei Teneri, Chioggia) in due tempi distinti (autunno 2001 e primavera 2002). Ogni individuo è stato misurato, pesato e classificato per quanto riguarda il sesso. Il grado di polimorfismo enzimatico, riferito a 19 loci è risultato praticamente assente. Questi dati riducono la possibilità di interpretazioni in quanto sono ascrivibili sia a fenomeni casuali di deriva genetica sia sia a meccanismi di adattamento per selezione con fissazione di alleli. I risultati relativi alla variabilità del DNA indicano un elevato grado di polimorfismo (eterozigosi media pari a 36,2 %). 13

14 Tuttavia, nonostante l alto grado di variabilità non è emersa una significativa differenziazione dei campioni, per cui si può ritenere che la popolazione di Z. ophiocephalus della laguna di Venezia sia costituita da un unica unità panmittica. Mentre differenti sono risultate le risposte individuali (alterazioni citologiche e modificazioni delle attività enzimatiche) in funzione del degrado della qualità dell ambiente lagunare. Il tema della biodiversità a livelo genetico è stato affrontato anche mettendo a punto tecniche innovative di genomica funzionale su due organismi di riferimento dell ambiente lagunare: Z. ophiocephalus e M. galloprovincialis. In funzione delle risorse disponibili sono stati raggiunti risultati solo intermedi ma originali e informativi (sequenze di geni espressi in go ) e risultati già illustrativi di possibili applicazioni (sequenze di geni espressi in mitilo, definizione e validazione preliminare del primo cdna microarray di mitilo a scala genomica). A partire da RNA isolato da tessuti rappresentativi dell organismo d interesse, sono state preparate librerie primarie di cdna specie-specifiche il cui sequenziamento sistematico ha consentito di avviare ricerche di similarità con le sequenze pubblicamente disponibili per altre specie (acidi nucleici e proteine). In questo modo sono stati identificati alcuni geni di mitilo e definite molte identità putative per geni mai sequenziati finora in mitilo e go. Un certo numero di sequenze EST sia di mitilo che di gò non ha mostrato similarità significative con le sequenze disponibili nei database pubblici; questo ultimo gruppo di dati rimane di per sé il più affascinante poiché potenzialmente include geni la cui espressione può spiegare le specificità funzionali più interessanti delle specie citate (es. l incredibile contrazione dei muscoli adduttori o la forza collante dei filamenti di bisso in mitilo). Questo approccio sperimentale ha aperto una direzione finora non praticata: lo sviluppo di conoscenze fondamentali per la comprensione della biologia di specie lagunari importanti e per la formulazione di spunti applicativi di cui il cdna microarray di mitilo costituisce solo un primo esempio. Un altro aspetto affrontato dal WP2 è stata la valutazione degli effetti sulla biodiversità delle biocenosi costiere di composti biocidi ad attività antivegetativa di ampio uso nel bacino lagunare, di recente introduzione in qualità di sostitutivi dei composti stannorganici, la tossicità dei quali ne ha causato il bando da parte della comunità europea. Ci siamo concentrati innanzitutto sugli effetti immunotossici, riconosciuti importanti nel caso degli stannorganici, i quali, andando a diminuire le capacità di difesa e resistenza contro potenziali patogeni e parassiti, rendono gli organismi più vulnerabili allo stress ambientale compromettendone la sopravvivenza. Sono stati scelti alcuni indici di tossicità e lo studio è stato condotto su colture a breve termine di emociti di ascidiacei coloniali comuni nella laguna di Venezia. In parallelo abbiamo valutato gli effetti di tali composti su: capacità di insediamento, metamorfosi e sviluppo iniziale post-metamorfico di larve di ascidiacei coloniali che dominano la comunità del fouling di substrato duro. Infine abbiamo voluto caratterizzare la comunità a macrofouling di substrato duro seguendone per un anno la successione ecologica su pannelli in legno e metallo ricoperti di vernici antivegetative di nuova generazione Sintesi del progetto di ricerca (in inglese) The research project investigated the biodiversity in the Venice lagoon at 4 different levels: community (fish and benthic assemblages), species, population and genes. This study aimed to survey some components of the lagoon and coastal biodiversity, as well as to understand the mechanisms underlying its maintenance and regulation. The results obtained at the different levels of investigation are reported below. Fish community (WP1): the analysis of the fish assemblage was carried out by integrating two different sampling methods, which resulted to be complementary and allowed the collection of representative data. The use of passive sampling gears (fyke nets) allowed the monitoring of the fish community in four lagoon areas, which represented different environmental types and were located in the three lagoon basins. The use of active sampling gear (seine net) allowed the collection of semi-quantitative standardized data on the species abundance and biomass in 68 sampling stations,

15 spread on the whole lagoon area. These stations were divided by type of habitat and five types of habitat were identified, based on the morphological and substrate characteristics. By integrating the data coming from these two sampling methods, a list of 60 fish species was obtained. The primary and derived community variables (species abundance, biomass, biodiversity and evennes indices) were correlated to the habitat structure and with some abiotic factors characterizing the sampling stations/areas. The fish assemblage structure was studied in both taxonomic and functional terms. The functional analysis was carried out by identifying the ecological guilds, which defined the ecological role of a species in the use of the lagoon environment. Univariate and Multivariate analyses allowed the investigation on the spatio-temporal variations in the fish assemblage, on the relationships with the abiotic factors and on their influence on the taxonomic and functional composition of the fish community. As a result, two habitats were identified, which better structured different assemblages: the seagrass meadows and the salt marsh creeks. The habitat structure, more than other abiotic variables, appeared to strongly influence the fish assemblage: as an example, a correlation was found between the fish diversity (measured by the species richness) and the habitat complexity (measured by the degree of vertical and horizontal structure). (WP3) The main objective of the research is the elaboration of an up-to-date picture of the presence and distribution of the allochthonous species of the macrozoobenthos in the Venice Lagoon and the possible effects on the local communities. First, some allochthonous species have been identified as object of study, belonging to one or more zoologic groups of the benthos, on the base of the available data concerning the mechanisms of distribution besides the degree of potential interference with local populations and anthropic activities (impact on the environment and human activities). A sampling campaign was therefore carried out, based on 17 stations previously chosen in order to represent the different lagoon typologies, in the period May-September The sampling has been conducted on both solid and mobile substrata, with methods suitable for the logistics as well as the aims of the research. The data processing has afforded to assess the distribution and relative frequency of the target species in the lagoon, graphically reproduced as theme maps. Furthermore, it has been possible to highlight interaction phenomena between introduced species and some allochthonous reference species. Particularly, as for commercial species, some effects caused by the anthropic exploitation through means having a severe impact on the balance within the communities have been highlighted. Benthic community (WP4): Primary outcomes of the study of the biodiversity at the benthic community level are reported below: 1) Spatial distribution pattern: the benthic macrofauna, distributed along an environmental gradient from the Lido inlet to the Dese river mouth, showed a zonation pattern, with marine species near the Lido inlet, eurialyne species in the central area and estuarine species in the marginal area. Communities classification is assessed by dominant species which fluctuate seasonally according to trophic status. The environmental gradient is water dynamics and it is considered the leading environmental factor influencing salinity, grain size and trophic status. 2) Functional biodiversity: ecological groups stressed a prevalence of species tolerant to excess of organic matter enrichment, deposit feeders, with reproductive strategies as annual and multiannual-forms; an increasing of opportunistic species with relatively short life span and tolerant to reduced sediments were observed, in some areas, to the growing of water trophic level. some benthic communities were dominated by species whose ecological role including sensitivity to organic enrichment is not well known, therefore, it was difficult or, in some case, dubious to put them in the right ecological group; further knowledge is still needed about autoecology of some species. Species (WP1 e WP5): At a species level, the study focused on two Teleost families: Gobiidae and Syngnathidae. In the Venice Lagoon these two families are composed of 9 and 7 species, 15

16 respectively. The species of each family share similar general morphology and ecological adaptations, showing specialized mechanisms which enhance the resources partitionig and the niches segregation, allowing their coexistence in the lagoon environment. Moreover, these two families represent a quantitative significant portion of the lagoon fish assemblages, in terms of both biomass and abundance. The sampling of the fish assemblages in the Venice lagoon, as described above, provided representative samples of the lagoon populations of Singnathidae and Gobiidae species. They were preserved appropriately and the morphology, reproductive condition and stomach contents were measured in laboratory for each specimen. The nuclear DNA contents were studied in the fish species by means of flow cytometry. Both the genome size and the fraction of the genome made by Adenine-Thymine base pair were evaluated. The collected data were related to other karyological data coming from literature in order to confirm taxonomical relationship among species and to outline some of the pathways of the karyological diversification in syngnathid and goby fishes. It was tried to be evinced how the cytogenetical parameters may influence the life history parameters of analyzed species. Furthermore, the spatial distribution of the fish abundances was analysed by means of correlations and contingency tests, allowing the identification of the degree of spatial segregation (in terms of habitat use) among the species. Through these analyses, the mechanisms of resource partitioning and niche differentiation were studied along three axes (space, food and reproduction). As a result, the goby species showed a strong spatial segregation, the large-sized gobies using mainly the vegetated (by seagrass) habitats, whereas the small-sized species the unvegetated ones. In turn, as regards the syngnathid species, a trophic segregation was observed, and this was related to the interspecific differences in the mouth and head morphology, and in the feeding behaviour. Futhermore, particular attention was paid to the study of the spatial distribution and ecology of those species listed in the Species and Habitat Directive (92/43/CEE) and/or in the red list (IUCN). Population and genetics (WP2): The study on the genetic biodiversity at the population level in Zosterisessor ophiocephalus (Perciformes, Gobiidae) was performed using molecular markers, allozymes and microsatellites. Samples have been collected during two years (2001 and 2002) from 5 areas of the Venice Lagoon representative of different conditions (Ca Zane, Ponte della Libertà, Lido, Lago dei Teneri, Chioggia). Individual fish have been measured, weighted and sexed and tissue samples have been collected for genetic analysis. A total of 434 individuals have been analyzed by electrophoresis for 11 gene-enzyme system. corresponding to 19 loci. The analysis revealed very little polymorphism with all loci being monomorphic using the 1% criterium. The lack of variability at the protein level could be due to genetic drift, thus indicating a very small effective population size for this population, or to selection effects, indicating the importance of adaptation to extreme conditions. To further investigate the problem, specie-specific microsatellites were isolated. Microsatellites are DNA level markers that, so far, represent the most polymorphic molecular tool available for population analysis. A total of 192 individuals have been analyzed with 11 microsatellites. Eight loci proved to be polymorphic, revealing from 3 to 14 alleles. The average heterozigosity was 0,362. Despite this high level of variability no significant differentiation was found between the Venice Lagoon samples, that behave as a single panmittic unit. Furthermore, no differences were found when samples were pooled by sampling date, sampling area, or sex. Finally, a significant value of differentiation was found when small (less than one year old) and big (more than one year old) males were compared. In general our result shows that the Z. ophiocephalus population in the Venice lagoon is very homogeneous, indicating significant movement of individuals and mixing of genotypes. On the contrary, the individual responses (nuclear damage and modifications of biochemical activity patterns) of organisms living in badly polluted sites are consistent with the level of chemical risk. The study of biodiversity at genetic level has been additionally approached by setting up innovative protocols of functional genomics on two reference organisms of the lagoon environment: Z. ophiocephalus e M. galloprovincialis. Related to the available resources, different results have been reached. Intermediate still original and informative results (sequences of expressed genes in 16

17 the grass goby) and results already useful for problem-focussed studies (sequences of expressed genes and preliminary validation of the first genome-wide cdna microarray in M. galloprovincialis). RNA purification from representative tissues of the organism of interest was the starting point for preparing species-specific primary cdna libraries (Fig. 1). The subsequent systematic sequencing and the similarity searches in the public databases of nucleic acids and proteins allowed the identification of a small number of Mytilus genes and the putative identification of still-not-sequenced genes of the mussel and grass goby (Tab. 1). In both the species, a part of the produced ESTs did not show any similarity with publicly available recorded sequences. Identification of such transcribed genes is intriguing since could explain the most peculiar functions of the cited organisms (e.g. the amazing catch status displayed by the adductor muscles or the efficient adhesion mediated by the bissus threads in mussels). The described experimental approach has launched a novel adventure: the development of new essential knowledge for understanding the biology of important lagoon species and for defining new useful tools which the mussel cdna array is just a first example. Another project target was to evaluate the effects of biocidal compounds widely used in the lagoon of Venice as an alternative to organotins, the toxicity of which is well known and caused their ban by the EC governments. We focused on immunotoxic effects, important in the case of organotins, which render organisms more vulnerable to environmental stress and endanger their survival by reducing the capability of defence and resistance against potential pathogens and parasites. We defined some toxicity indexes and the study was carried out on short-term cultures of haemocytes of compound ascidian common in the lagoon of Venice. We also evaluated the effects of such compounds on: settlement capability, metamorphosis and post-metamorphic development of larvae of colonial ascidians which dominate the community of hard-substrate fouling. Lastly, we moved to the characterisation of the hard-substrate macrofouling community following its ecological progression on wood and steel panels coated with newly introduced antifouling paints Elenco dei contenitori dei risultati ( deliverables ) e loro tipologia di trasmissione Pubblicazioni prodotte Ballarin L., Cima F., Immunotoxicity in ascidians: the case of organotin compounds. In: The Biology of Ascidians, H. Sawada, H. Yokosawa, & C. C. Lambert (eds),, Springer, Tokyo, pp Bisol P.M., 2002 Ecogenetic biodiversity in Zosterisessor ophiocephalus from the lagoon of Venice: I Gene-enzyme polymorphisms Scientific research and safeguarding of Venice. P.P. Campostrini (ed.),.istituto Veneto SSLLAA, Venezia, La Garangola (PD),, pag Bisol P.M., Lo studio della biodiversità per un equilibrio fra conservazione e sfruttamento in laguna di Venezia. Secondo convegno annuale CoRiLa Bisol P.M., Prevedello S., Rianna E., A. Gallini, L. Zane, Ecogenetic biodiversity in Zosterisessor ophiocephalus from the lagoon of Venice: III. Allozymes population analysys. (manuscript in preparation, 2004) Bisol P.M., Franco A., Gallini A., Rianna E., Prevedello S., Zane L., 2004 Biodiversity at the population level in the Venice lagoon: a polymorphism analysis of Zosterisessor ophiocephalus. Inviato per partecipazione a Lagoons and coastal wetlands in the global change context: impacts and managemant issues.venezia aprile Cima F., Ballarin L., TBT-sulfhydryl interaction as a cause of immunotoxicity in Tunicates. Ecotoxicol. Environ. Saf., in press Cima F., Ballarin L., Burighel P., Biodiversity in the lagoon of Venice: effects of biocidal compounds on the survival of benthic filter-feeding organisms, with particular reference to compound ascidians. In: Scientific Research and Safeguarding of Venice, P. Campostrini ed., Istituto Veneto di Scienze Lettere ed Arti, Venezia, pp

18 Cima F., Ballarin L., Burighel P., Calcium and thiol roles in cells exposed to organotins. ELSO 2002, Nice (France),, June, 29 July, 3, 81. Cima F., Burighel P., Ballarin L., Immunotoxicity of Cu(I), and Irgarol 1051 in ascidians. 9 th International Congress of the International Society of Developmental and Comparative Immunology ((ISDCI),, St Andrews, Scotland, June 29 - July, 4, 180. Cima F., Dominici D., Ballarin L., Burighel P., Influence of TBT on the activity of the detoxicant enzymes, GST and GPX, from haemocytes of the colonial ascidian Botryllus schlosseri. 11 th International Symposium on Environment Pollution and its Impact on Life in the Mediterranean Region, Limassol (Cyprus),, October, 6-10, C8. Cima F., Dominici D., Ballarin L., Burighel P., Influence of TBT on activity of detoxifying enzymes from haemocytes of a colonial ascidian. Fres. Environ. Bull., 11: Cima F., Dominici D., Mammi S., Ballarin L., Butyltins and calmodulin: which interaction? Appl. Organometal. Chem., 16: Cima F., P. Burighel, L. Ballarin, Biodiversità nella laguna di Venezia: effetto di composti antivegetativi su insediamento e sopravvivenza di specie sessili. Presentazione al secondo convegno annuale CoRiLa Franco A., Malavasi S., Pranovi F., Franzoi P. and Torricelli P., Preliminary data on gonadal development and fecundity in the grass goby, Zosterisessor ophiocephalus (Pallas, 1811) from the Venice lagoon (northern Italy). Acta Adriatica, 43, Franco A., Fiorin R., Malavasi S., Franzoi P. and Torricelli P., Spatial and temporal variation in reproductive and somatic investment of Zosterisessor ophiocephalus (Pisces, Gobiidae) in the Venice lagoon. Biologia Marina Mediterranea, 10, Franco A., Malavasi S., Fiorin R., Zucchetta M. and Torricelli P., Habitat characteristics of two endangered gobies in the Venice Lagoon, in Proceedings of the Six International Conference on the Meditearranean Coastal Environment, MEDCOAST 03, 7-11 October 2003, Ravenna, Italy, by Őzhan E. (ed.), MEDCOAST, Middle East Technical University, Ankara, Turkey, vol. 1, pp Franco A., Franzoi P., Malavasi S., Riccato F. and Torricelli P. Fish assemblages in different shallow water habitats of the Venice Lagoon. Hydrobiologia Submitted. Franco A., Fiorin R., Franzoi P. and Torricelli P. Threatened fishes of the world: Pomatoschistus canestrinii Ninni, 1883 (Gobiidae). Environ. Biol. Fish., Submitted. Franzoi P., Riccato F., Franco A. and Torricelli P. Dietary differences in three pipefish species (Osteichthyes, Syngnathidae) related to the snout morphology. Biologia Marina Mediterranea, Submitted. Franzoi P., Riccato F., Franco A. and Torricelli P. Feeding habits and morphological-dietary relationships of three co-occurring pipefish species (Osteichthyes, Syngnathidae) in a sea grass meadow of the Venice Lagoon. Hydrobiologia, Submitted. Gallini A., Zane L., Bisol P.M, Isolation and characterization of microsatellites in Zosterisessor ophiocephalus (Perciformes, Gobiidae)Atti Secondo convegno annuale CoRiLa, in stampa. Gallini A., Zane L., Campagnolo P., Rianna E., Bisol P.M, Ecogenetic biodiversity in Zosterisessor ophiocephalus from the lagoon of Venice: II Microsatellites population analisys. (submitted to J. Exp. Mar. Biol. Ecol.) Keppel E., (Relatori Marin, M.G. e Maggiore F.) Distribuzione spazio-temporale della comunita a Policheti, lungo l estuario del dese (Bacino settentrionale, Laguna di Venezia) Tesi di Laurea Universita degli Studi di Padova, Facoltà di scienze MM.FF.NN.Corso di Laurea in Scienze Naturali (formato elettronico WP4_ allegato7). Libertini A., Franzoi P., Torricelli P., Contenuto nucleare di DNA totale ed in basi Adenina- Timina in tre specie del genere Syngnathus (Teleostei, Syngnathidae). Abstract 32 Congresso S.I.B.M., Numana (AN), 4-9 Giugno 2001:

19 Libertini A., Franzoi P., Torricelli P., Contenuto nucleare di DNA totale ed in basi Adenina- Timina in tre specie del genere Syngnathus (Teleostei, Syngnathidae). Biol. Mar. Medit., 9: Libertini A., Franzoi P., Torricelli P., Genome Size And AT-DNA nuclear content in three species of Syngnathus and one of Nerophis (Teleostei, Syngnathidae). Abs. 10th European Congress of Ichthyology, Prague, September 3-7, Maggiore F., Benthic community distribution in the lagoon of Venice in the years 1948 and 1968 Bollettino del Museo Civico di Storia Naturale, Venezia 53: (già in possesso di CORILA in forma cartacea) Maggiore F., Puppini S., Mizzan L., Il genere Abra Lamarck, 1818 (Mollusca: Bivalvia) nella laguna di Venezia. Bollettino del Museo Civico di Storia Naturale, Venezia. (in stampa) (formato elettronico WP4_ allegato4). Maggiore F., Puppini S., Mizzan L., La biodiversita : un percorso di studio XIII Settimana della Scienza 31 marzo - 6 aprile 2003 Maggiore F., Taroni G., Biodiversity studies at macrobenthic community level in the Lido Basin (Lagoon of Venice): a review. In: Scientific Research and Safeguarding of Venice, Istituto. Veneto Scienze Lettere ed Arti CORILA Publ. Proc. Annual General Meeting of CORILA, Venezia: (già in possesso di CORILA) Maggiore F., Taroni G.C.,2000. Distribuzione della macrofauna bentonica nella laguna di Venezia negli anni 1948 e Technical Report 237. Consiglio Nazionale delle Ricerche- Istituto per lo Studio della Dinamica delle Grandi Masse: 26 pp. (già in possesso di CORILA in forma cartacea). Mainardi D., Fiorin R., Franco A., Franzoi P., Giovanardi O., Granzotto A., Libertini A., Malavasi S., Pranovi F., Riccato F. and Torricelli P., Fish diversity in the Venice lagoon: preliminary report. In Scientific research and safeguarding of Venice, Corila Research: Program 2001 results (P. Campostrini, ed.). Istituto Veneto di Scienze, Lettere ed Arti, and Corila, Venezia: Mainardi D., Fiorin R., Franco A., Franzoi P., Malavasi S., Giovanardi O., Pranovi F., Riccato F., Torricelli P., Libertini A., Lo studio della biodiversità per un equilibrio fra conservazione e sfruttamento in laguna di Venezia: analisi delle comunità ittiche. Research Programme , First annual workshop, Venezia, Italy, 4-5 April Abstract p. 81. Mainardi D., Fiorin R., Franco A., Franzoi P., Granzotto A., Malavasi S., Pranovi F., Riccato F., Zucchetta M. and Torricelli P., Linea 3.6: lo studio della biodiversità per un equilibrio fra conservazione e sfruttamento in laguna di Venezia: analisi delle comunità ittiche. Research Programme , Second annual workshop, Venezia, Italy, 31 March -2 April Abstract p Mainardi D., Fiorin R., Franco A., Franzoi P., Granzotto A., Malavasi S., Pranovi F, Riccato F., Zucchetta M. and Torricelli P. Seasonal distribution of fish fauna in the Venice Lagoon shallow waters: preliminary results. In Scientific research and safeguarding of Venice, Corila Research: Program 2002 results (P. Campostrini, ed.). Istituto Veneto di Scienze, Lettere ed Arti, and Corila, Venezia, IN PRESS. Malavasi S., Coppola J., Pranovi F., Granzotto A., Franco A. and Torricelli P., Habitat riproduttivo di Zosterisessor ophiocephalus in laguna di Venezia e osservazioni sulle caratteristiche dei riproduttori. Lavori della Società Veneta di Scienze Naturali, 27, Malavasi S., Fiorin R., Franco A. and Torricelli P. Somatic energy storage and reproductive investment in the grass goby Zosterisessor ophiocephalus. J. Mar. Biol. Ass. UK, IN PRESS Malavasi S., Fiorin R., Franco A., Franzoi P., Granzotto A., Riccato F. and Mainardi D. Fish assemblages of Venice Lagoon shallow waters: an analysis based on species, families and functional guilds. J. Mar. Systems Submitted Mizzan L., Segnalazioni 18 - Anadara demirii. Boll. Mus. Civ. Stor. Nat. Venezia, 53:

20 Mizzan L., Segnalazioni 19 - Musculista senhousia. Boll. Mus. Civ. Stor. Nat. Venezia, 53: 266 Mizzan L., Segnalazioni 20 - Corbicula fluminea. Boll. Mus. Civ. Stor. Nat. Venezia, 53: Mizzan L., Segnalazioni 41 - Gyge branchialis. Boll. Mus. Civ. Stor. Nat. Venezia, 53: Mizzan L., Segnalazioni 42 - Palaemon serratus. Boll. Mus. Civ. Stor. Nat. Venezia, 53: Mizzan L., Segnalazioni 43 - Galathea squamifera. Boll. Mus. Civ. Stor. Nat. Venezia, 53: 274 Mizzan L., Trabucco R., First results of a research project on the diffusion of allocthonous marine species (zoobenthos) in the Lagoon of Venice. Mollusks: affinities and differences with the Mediterranean situation. In: ISTITUTO VENETO DI SCIENZE, LETTERE ED ARTI & CORILA (Eds.), Scientific research and safeguarding of Venice, Corila Research Program 2001 Results, La Garangola, Padova: Puppini S., (Relatori Marin, M.G. e Maggiore F.) Studio della malacofauna nel bacino settentrionale della Laguna di Venezia. Tesi di Laurea. Universita degli Studi di Padova, Facoltà di scienze MM.FF.NN.Corso di Laurea in Scienze Biologiche. (formato elettronico WP4_ allegato3). Riccato F., Fiorin R., Franco A., Franzoi P., Libertini A., Pranovi F. and Torricelli P., Population structure and reproduction of three pipefish species (Teleostei, Syngnathidae) in a sea grass meadow of the Venice lagoon. Biologia Marina Mediterranea, 10, Riccato F., Franco A., Franzoi P., Fiorin R., Malavasi S. and Torricelli P. Influence of age and habitat type on the dietary composition of Zosterisessor ophiocephalus in the Venice Lagoon. Biologia Marina Mediterranea, Submitted. Tagliapietra G. (Relatori Bressan M. e Mizzan L.), 2002/2003. Tesi di laurea in Scienze Naturali, Università di Padova: Nuovi dati sulla presenza e distribuzione di specie alloctone del macrozoobenthos della laguna di Venezia. Tallandini L., Studies of the biodiversity in the Venice lagoon: Molecular probes of ecotoxicological susceptibility. I Validation of DNS damage detection in fish (Zosterisessor ophiocephalus, Pall), and mussel (Mytilus galloprovincialis, Lam), by means of comet assay Scientific research and safeguarding of Venice. P.P. Campostrini (ed.),.istituto Veneto SSLLAA, Venezia, La Garangola (PD), pag Tallandini L., Poletti S., Pivotti L., Effects of subacute Cd ++ exposure on nuclear integrity in red blood cells of fish (Zosterisessor ophiocephalus Pall ESCPB 22 nd European Society of Comparative Physiology and Biochemistry. Alessandria-Italy, Dec 15-19, Tallandini L., Poletti S., Varotto A., Pivotti L., P.M. Bisol, Field investigation in the lagoon of Venice by early biomarkers and allozyme survey. ESCPB 22 nd European Society of Comparative Physiology and Biochemistry. Alessandria-Italy, Dec 15-19, Tallandini L., Varotto A., Pivotti L., Biodiversità nella laguna di Venezia: risposte differenziali di biomarkers molecolari in Zosterisessor ophiocephalus. Secondo convegno annuale CoRiLa Tallandini L., Modenato M., Pivotti L., Effects of subacute Cd ++ exposure on nuclear integrity in red blood cells of fish (Zosterisessor ophiocephalus Pall),: Apoptotic and genotoxic events Atti VII Naz AISETOV Elementi Traccia nella salute dell uomo, degli animali e delle piante Chieti settembre 2002 Tallandini L., Poletti S., Pivotti L, DNA damage in fish ((Zosterisessor ophiocephalus Pall.), blood after Cd ++ exposure. 33 EEMS satellite Meeting V th International Comet Assay Worksop Aberdeen U.K. August 29-30, Venier P., A. Pallavicini, B. De Nardi, G. Lanfranchi (2003) Towards a catalogue of genes transcribed in multiple tissues of Mytilus galloprovincialis. Gene, 314C,

21 Venier P. et al., Gene identification and expression profiling in mussels (manuscript in preparation, 2004) Venier et al., Expressed Sequence tags in Zosterisessor ophiocephalus (manuscript in preparation, 2004) Venier P., C. De Pittà, F. Marsano, A. Pallavicini, A. Viarengo, N. Vitulo and G. Lanfranchi (2003) Genome-wide identification of expressed sequence tags in Mytilus galloprovincialis. 33 EEMS, Aberdeen (UK), August 24.28, p. 121 (invited communication) GIA INVIATO COME ALLEGATO ELETTRONICO Venier P., C. De Pittà, F. Marsano, A. Pallavicini, A. Viarengo, N. Vitulo and G. Lanfranchi (2003) A genome-wide project in Mytilus galloprovincialis for controlling marketable stocks and coastal pollution watching. 5 FISV meeting, Rimini, October p. 86 (invited communication). GIA INVIATO COME ALLEGATO ELETTRONICO Venier P., De Pittà C., Marsano F., Pallavicini A., Viarengo A., Romualdi C., Lanfranchi G. (2003) Gene cataloguing and preliminary gene expression profiling from multiple tissues of normal and stressed mussels (Mytilus galloprovincialis) ESCPB 22 nd Annual Conference, Biological effects of pollutants: the role of environmental genomics and proteomics, Alessandria, December p. 65. GIA INVIATO COME ALLEGATO ELETTRONICO Venier P., De Pittà C., Marsano F., Pallavicini A., Viarengo A., Romualdi C., Lanfranchi G. (2004) Gene identification and expression profiling in Mytilus galloprovincialis: a new tool for basic and applied research. VI Incontro Scientifico Società Italiana di Immunobiologia Comparata e dello Sviluppo, Padova, Febbraio, p 25. GIA INVIATO COME ALLEGATO ELETTRONICO Venier P., De Pittà C., Marsano F., Pallavicini A., Viarengo A., Romualdi C., Lanfranchi G. (2004) Massive gene identification and expression profiling in mussels: a pioneering index for coastal biomonitoring. Int. conference Lagoons and coastal wetlands in the global change context. Impacts and management issues. Venice, April 26-28, p.da AVVENIRE Venier P., A. Pallavicini, G. Lanfranchi (2002) Identification of transcribed genes in Mytilus galloprovincialis and Zosterizessor ophiocephalus. In: IVSLA/CORILA. Scientific research and safeguarding of Venice. Corila Research Program, 2001 Results, (Venice, 4-5/4/2002). pp GIA A DISPOSIZIONE Venier P., Pallavicini A., De Pittà C., Lanfranchi G. (2003) Identification of actively transcribed genes in reference organisms of the Venice lagoon: Zosterisessor ophiocephalus. Secondo convegno annuale CoRiLa, Venezia, 31/3/2003. GIA A DISPOSIZIONE Zane L., A. Gallini, S. Prevedello, P.M. Bisol. Biodiversità nella laguna di Venezia a livello di popolazione: polimorfismi genetici in Zosterissessor ophiocephalus. Presentazione al secondo convegno annuale CoRiLa Zane L., Gallini A., Campagnolo P., Rianna E. Bisol P.M.: Analisi della variazione spaziole e temporale nella biodiversità a livello genetico di Zosterisessor ophiocephalus (Perciformes, Gobidae), nella laguna di Venezia: uno studio mediante microsatelliti. XIII Convegno Societa Italiana di Ecologia, Como, Sett. 8-10, Software Database a) 3_6_database_ComunitàItticaTratta_WP1Mainardi.xls Database sulle abbondanze (totali e dei soli individui giovanili) e biomasse (totali) delle specie della comunità ittica lagunare campionate con la rete da circuizione (tratta) in 68 stazioni (x 3 stagioni) nella laguna di Venezia. Per ogni stazione sono riportati anche i valori delle variabili ambientali misurate. Nel file è riportata anche la lista delle specie campionate suddivise per famiglia e per gruppo ecologico. Dati tipo A, foglio elettronico. 21

22 22 b) 3_6_database_ComunitàItticaCogolli_WP1Mainardi.xls Database sulle abbondanze (CPUE) delle specie della comunità ittica lagunare campionate con le reti da posta (cogolli) in 4 stazioni nella laguna di Venezia. Per ogni stazione sono riportati anche i valori delle variabili ambientali misurate. Nel file è riportata anche la lista delle specie campionate suddivise per famiglia e per gruppo ecologico. Dati tipo A, foglio elettronico. c) 3_6_database_MorfometriaGobidi_WP1Mainardi.xls Caratterizzazione biometrica (lunghezza standard, lunghezza totale, peso totale, peso delle gonadi) di esemplari di Zosterisessor ophiocephalus e Gobius niger campionati nella laguna di Venezia con le reti da posta. Dati tipo A, foglio elettronico. d) 3_6_database_MorfometriaSingnatidi_WP1Mainardi.xls Caratterizzazione biometrica (lunghezza standard, lunghezza totale, peso totale, peso delle gonadi, numero di uova nelle gonadi femminili, numero di embrioni nella tasca incubatrice maschile) di esemplari di Syngnathus abaster, S. typhle e Nerophis ophidion campionati nella laguna di Venezia. Dati tipo A, foglio elettronico. e) 3_6_database_DieteGobidi_WP1Mainardi.xls Caratterizzazione delle diete degli individui appartenenti a 6 specie di Gobidi della laguna di Venezia. Dati tipo A, foglio elettronico. e) 3_6_database_DieteSingnatidi_WP1Mainardi.xls Caratterizzazione delle diete degli individui appartenenti a 3 specie di Singnatidi della laguna di Venezia. Dati tipo A, foglio elettronico. f) 3_6_database_MorfometriaCapo_Singnatidi_WP1Mainardi.xls Dati di morfometria del capo di individui appartenenti 3 specie di Singnatidi della laguna di Venezia. Dati tipo A, foglio elettronico. g) 3_6_database_Alloctone_WP3Mizzan.mdb Database sulle specie esotiche oggetto dello studio (target) con strutturazione tassonomica, contenente le informazioni di origine bibliografica e quelle provenienti dalle ricerche in corso con possibilità d implementazione dei dati ecologici, ambientali e distributivi. h) 3_6_database_Bib_alloc_WP3Mizzan.mdb Database relativo alla bibliografia specifica acquisita ed utilizzata nel progetto e nel database tassonomico. i) 3_6_database_ gòcorila_wp2bisol.xls Caratterizzazione biometrica (lunghezza standard, lunghezza totale, peso, peso del fegato) e genetica (fenotipi enzimatici e microsatellitari) di esemplari di Zosterisessor ophiocephalus delle lagune di Venezia e di Marano-Grado Dati tipo A, foglio elettronico. j) 3_6_database_DNASingnatidiGobidi_WP5Libertini.xls File excel, dati grezzi delle analisi citometriche in flusso effettutate Cartografia a) 3_6_Cartografie_WP3Mizzan.zip Mappa della distribuzione delle specie alloctone e delle specie autoctone di confronto.

23 1.6.5 Altro WP1: Tesi di laurea: Fortibuoni T. (Relatore P. Torricelli),2003/2004. Approccio funzionale allo studio della comunità ittica in laguna di Venezia. Tesi di Laurea in Scienze Ambientali, Università Ca Foscari di Venezia. WP2: n coppie di sequenze di DNA-primer (originali e specie specifiche) disegnate per l identificazione e l amplificazione di loci microsatelliti in Zosterisessor ophiocephalus Dati tipo A, foglio elettronico 12 coppie di sequenze di DNA-primer (originali e specie specifiche) sintetizzate per l identificazione e l amplificazione di loci microsatelliti in Zosterisessor ophiocephalus Dati tipo A, foglio elettronico 2 coppie di sequenze di DNA-primer (originali e specie specifiche) disegnate e sintetizzate per per l identificazione e l amplificazione del gene mitocondriale della subunità 16S in Gobius cobitis, Gobius niger, Knipowitschia panizzae, Pomatoschistus marmoratus, Pomatoschistus canestrinii e Pomatoschistus minutus. Dati tipo A, foglio elettronico. Le sequenze 3 EST di mitilo e di go prodotte dalla linea WP2.4.1 sono in parte registrate e già visibili da rete e in parte in corso di registrazione condizionale presso la banca dati pubblica dell NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Un commento ai dati di sequenza resi disponibili appare in Gene 314C: I manoscritti in preparazione renderanno disponibili i rimanenti dati di sequenza e il loro significato funzionale per le specie studiate. Una selezione delle similarità significative, ricavata da Gene 314C: (2003) é riportata nell allegato file Sequenze di mitilo.xls. Dati tipo A, foglio elettronico. Tesi di laurea Ballarin N. (Relatori Ballarin L. e Cima F.), 2002/2003. Tesi di laurea in Scienze Naturali, Università di Padova Effetti delle vernici antivegetative a rame sulla biodiversità e la capacità di insediamento della comunità a macrofouling del bacino meridionale della laguna di Venezia. Campagnolo P. (Relatore L. Zane),2002/2003 Tesi di Laurea in Biotecnologia, Università di Padova Analisi mediante marcatori microsatelliti di Zosterisessor ophiocephalus della Laguna di Venezia. Gallini A.(Relatori Bisol P.M. e Venier P.), 2002/2003. Tesi di Laurea in Scienze Biologiche,Università di Padova:Biodiversità a livello molecolare in Zosterisessor ophiocephalus nella laguna di Venezia Macor A.(Relatore Ballarin L. e Cima F.) Tesi di laurea in Scienze Naturali, Università di Padova:Immunotossicità dello zinco piritione: evidenze nell ascidia coloniale Botryllus schlosseria.a.. Menin A. (Relatore Ballarin L. e Cima F.), 2002/2003. Tesi di laurea in Scienze Naturali, Università di Padova: Immunotossicità di nuovi composti antifouling nell ascida coloniale Botryllus schlosseri: studio su Diuron e TCMS piridina. Miotto N. (Relatori Ballarin L. e Cima F.), 2001/2002. Tesi di laurea in Scienze Biologiche, Università di Padova: Immunotossicità di Cu(I), e Irgarol 1051: evidenze nell ascidia coloniale Botryllus schlosseri. Moro E. (Relatore: Venier P.; Correlatori: De Pittà C., Marsano F.) 2002/2003 Tesi di laurea in Scienze Naturali, Università di Padova: Produzione di EST e allestimento di un cdna microarray di Mytilus galloprovincialis. Poletti S. (Relatore L. Tallandini), 2002/2003. Tesi di laurea in Scienze Biologiche, Università di Padova: Effetti da esposizione subacuta a Cd++ in globuli rossi di pesce. Valutazione del danno citotossico e genotossico Prevedello S. (Relatori Bisol P.M. e Venier P.), 2001/2002. Tesi di laurea in Scienze Biologiche, Università di Padova: Analisi di Polimorfismi nel bivalve Mytilus galloprovincialis e nel teleosteo Zosterisessor ophiocephalus della laguna di Venezia. 23

24 Rianna E. (Relatori Bisol P.M., Venier P. e L. Zane), 2002/2003. Tesi di Laurea in Scienze Biologiche, Università di Padova: Biodiversità in Zosterisessor ophiocephalus di due lagune dell Alto Adriatico. Toniolo N. (Relatore: Venier P.; Correlatori: De Pittà C., Marsano F.), 2002/2003 Tesi di laurea in Scienze Naturali, Università di Padova: Produzione e identificazione di EST in Zosterisessor ophiocephalus. Varotto A. (Relatori Fano A.; Tallandini L.), 2002/2003 Tesi di laurea in Scienze Naturali, Università di Ferrara: Valutazione di biomarkers molecolari in ambiente lagunare: indagine su pesci (Zosterisessor ophiocephalus Pall.). WP4: WP4_allegato1.doc: protocollo di campionamento WP4_allegato 2.xls: lista di specie del bacino settentrionale WP4_allegato 3. Puppini S., (Relatori Marin, M.G. e Maggiore F.) Studio della malacofauna nel bacino settentrionale della Laguna di Venezia. Tesi di Laurea. Universita degli Studi di Padova, Facoltà di scienze MM.FF.NN.Corso di Laurea in Scienze Biologiche WP4_allegato 4. Maggiore F., Puppini S., Mizzan L. (in stampa) Il Genere Abra Lamarck, 1818 (Mollusca: Bivalvia) Nella Laguna Di Venezia Boll. Mus. Civ. St. Nat. Venezia WP4_allegato 5.xls: lista di specie dell estuario del Dese WP4_allegato 6.xls: tabelle di contingenza- estuario del Dese WP4_allegato 7. Keppel E., (Relatori Marin, M.G. e Maggiore F.) 2002,2003. Distribuzione spazio-temporale della comunita a Policheti, lungo l estuario del dese (Bacino settentrionale, Laguna di Venezia) Tesi di Laurea Universita degli Studi di Padova, Facoltà di scienze MM.FF.NN.Corso di Laurea in Scienze Naturali WP4_allegato 8..ppt Maggiore F., Puppini S., Mizzan L., La biodiversita : un percorso di studio XIII Settimana della Scienza 31 marzo - 6 aprile 2003WP5: File PDF delle pubblicazioni: PDF file: absyng_numana PDF file: syng_dna_bmm PDF file: absyng_praga PDF file: abs_corila_1 PDF file: corila3.6_testo PDF file: abs_sibm_csardo 1.7 Composizione gruppo di ricerca Cognome nome Istituto di appartenenza Mainardi Danilo DSA - UNIVE Torricelli Patrizia DSA - UNIVE Franzoi Piero DSA - UNIVE Pranovi Fabio DSA - UNIVE Malavasi Stefano DSA - UNIVE Franco Anita DSA - UNIVE Riccato Federico DSA - UNIVE Fiorin Riccardo DSA - UNIVE Zucchetta Matteo DSA - UNIVE Granzotto Angela DSA - UNIVE Libralato Simone DSA - UNIVE Da Ponte Filippo DSA - UNIVE Raicevich Sasa DSA - UNIVE Ballarin Loriano DIP. BIOLOGIA - PD Bisol Paolo Maria DIP. BIOLOGIA - PD Burighel Paolo DIP. BIOLOGIA - PD Cima Francesca DIP. BIOLOGIA - PD 24

25 Del Favero Marcello DIP. BIOLOGIA - PD Tallandini Laura DIP. BIOLOGIA - PD Venier Paola DIP. BIOLOGIA - PD Zanatta Cecilia DIP. BIOLOGIA - PD Zane Lorenzo DIP. BIOLOGIA - PD Bon Mauro Museo di Storia Naturale di Venezia Mizzan Luca Museo di Storia Naturale di Venezia Reggiani Paolo Museo di Storia Naturale di Venezia Tagliapietra Giorgia Università degli Studi di Padova Trabucco Raffaella Museo di Storia Naturale di Venezia Francesca Maggiore CNR-ISMAR Venezia Angelo Libertini CNR-ISMAR Venezia Renata Trisolini CNR-ISMAR Venezia 1.8 Aspetti innovativi da approfondire ulteriormente WP1: Un aspetto innovativo della ricerca condotta dal Dipartimento di Scienze Ambientali è stata l analisi dettagliata della comunità ittica della laguna di Venezia, in quanto dati di questo genere mancavano quasi completamente in letteratura. Il secondo aspetto innovativo è rappresentato dal fatto che tale ricerca non si è limitata ad una pura descrizione della biodiversità ittica, ma ha approfondito l analisi dei meccanismi che la promuovono e la mantengono. Tale ricerca si è quindi articolata su diversi livelli di analisi, quali lo studio delle relazioni fra le specie con particolare riferimento ai meccanismi di ripartizione delle risorse e lo studio comparativo degli adattamenti ecologici delle specie stesse. Tali studi, data la loro complessità, richiedono ulteriori approfondimenti e lunghe serie temporali di dati. Questo è uno dei motivi che ha portato il nostro WP a richiedere una proroga della ricerca per il completamento dello studio di alcuni di questi aspetti. WP2: Un aspetto innnovativo importante della ricerca condotta dal Dipartimento di Biologia dell Università di Padova è l acquisizione e l applicazione di metodologie complementari per lo studio delle risposte degli organismi alle condizioni ambientali a differenti livelli dell organizzazione biologica. Un quadro più completo può venire con l estensione delle indagini a altre specie chiave della laguna. Inoltre, proprio perché sono si è aperta una direzione nuova e promettente sia per la ricerca di base che per gli studi ambientali, l identificazione sistematica di geni attivamente trascritti in Z. ophiocephalus e M. galloprovincialis dovrebbe essere adeguatamente sostenuta da risorse nuove per potere rendere più produttiva la messa a punto di nuovi indicatori e indici da applicare nello studio dell ambiente lagunare veneziano. Quanto finora sviluppato in questo ambito linea è stato realizzato solo grazie alla coincidenza di collaborazioni scientifiche informali e può consolidarsi solo se viene riconosciuto per intero il valore scientifico degli obiettivi proposti. Infatti, sia in M. galloprovincialis che in Z. ophiocephalus serve proseguire l identificazione sistematica di EST così da definire una collezione di geni sufficientemente ampia da poter rilevare anche trascritti poco abbondanti o espressi solo in certi momenti funzionali. Un primo obiettivo sarebbe quello di utilizzare lo stesso RNA purificato da mitili trattati in laboratorio con inquinanti tossici per l ulteriore produzione di EST: gli stessi geni espressi da una cellula in condizioni normali possono drasticamente cambiare il livello di espressione in risposta all azione dei contaminanti tossici e, quelli reclutati nei meccanismi difensivi più probabilmente verrebbero individuati dal sequenziamento sistematico. Ciò può essere realizzato adeguando a questo scopo l allocazione di future risorse. D altra parte, avere a disposizione una collezione di circa 1700 geni di mitilo (MYTarray 1.0) spinge a verificare quali tra i geni stampati su vetrino siano modulati nella 25

26 loro espressione in risposta agli inquinanti tossici e nelle reali condizioni ambientali (confronto di ambienti puliti e deteriorati). WP4: Le ricerche relative agli studi sulla biodiversità a livello di comunità macrobentoniche sono volte ad approfondire il ruolo ecologico di Hemilepton nitidum (Mollusca, Bivalvia), Aphelochaeta multibranchiis e Streblospio shrubsolii (Annelida, Polichaeta) soprattutto in relazione alle strategie riproduttive ed al grado di sensibilità all arricchimento organico. WP5: Il genoma degli organismi superiori contiene DNA di diversa natura: a) DNA in singola copia, che contiene gran parte dei geni che sovrintendono alla vita, e b) DNA ripetitivo, comprendente pochissimi geni, presente in maggiore quantità del precedente e la cui funzione non è ancora del tutto chiarita. Negli ultimi anni molti studi hanno interessato il rapporto che può intercorrere tra quantità di DNA nucleare (o peso del genoma ), con particolare riferimento alla massa del DNA ripetitivo, ed altre caratteristiche funzionali dei viventi (velocità nello sviluppo, tasso metabolico, longevità, taglia corporea, complessità morfologica degli organi, ecc.). Un tale tipo di confronto sarebbe auspicabile anche per i pesci singnatidi e gobidi, alla luce dei dati raccolti nel corso del presente progetto, con l obiettivo di verificare se specifiche strategie evolutive dei parametri citogenetici hanno influito sull adattamento nell ambiente lagunare e, di conseguenza, sulla diversa distribuzione delle specie. 26

27 27 PROGRAMMA DI RICERCA LINEA 3.6 LO STUDIO DELLA BIODIVERSITÀ PER UN EQUILIBRIO FRA CONSERVAZIONE E SFRUTTAMENTO IN LAGUNA DI VENEZIA 2. ASPETTI GESTIONALI DELLA RICERCA

28 2.1 Macroattività (WP), unità operative coinvolte e loro integrazione 28 WP1: Studio della biodiversità a livello di comunità ittiche Dipartimento di Scienze Ambientali, Università Ca Foscari di Venezia, Campo della Celestia, Castello 2737/b, Venezia Le unità operative coinvolte in questo WP si sono integrate mediante periodici incontri organizzati dai ricercatori responsabili delle unità operative stesse, mirati a coordinare le attività di ricerca e a confrontare i dati acquisiti in corso d opera. WP2: Studio della biodiversità a livello genetico e di popolazione Dipartimento di Biologia, Università di Padova, Via U. Bassi, Padova WP3: Monitoraggio di alcune specie alloctone (target) in laguna di Venezia Museo civico di Storia Naturale di Venezia. S.Croce Venezia Il progetto è stato svolto autonomamente dal Museo, con proprio personale, attrezzature e laboratori. Tuttavia per tutta la parte logistica, in particolare per la campagna di campionamenti in ambiente, il Museo si è appoggiato alla linea principale (Scienze Ambientali) che ha assicurato il mezzo nautico e il personale di appoggio. La predisposizione del calendario di prelievi e tutte le operazioni sul campo svolte in collaborazione sono state rese possibili da una stretta ed efficiente pianificazione delle attività delle linee. I campionamenti sono stati effettuati congiuntamente da personale dei due Istituti. WP4: Studio della biodiversità a livello di comunità macrobentoniche CNR-ISMAR, sede di Venezia Sezione Dinamica delle Grandi Masse WP5: Quantità di DNA nucleare in Singnatidi e Gobidi Istituto d Scienze Marine Sede di Venezia, CNR, Castello, 1364/A Venezia Il WP è costituito da una sola unità operativa, pertanto non si è resa necessaria alcuna attività di integrazione. Le attività legate all'acquisizione dei campioni da analizzare dal WP5 sono state concertate con l'unità di ricerca del responsabile di progetto (WP1-DSA) che, tra l'altro, si è occupato direttamente di coordinare ed attuare le azioni di campionamento della fauna ittica lagunare. 2.2 Iniziative di coordinamento specifiche WP1: In quanto responsabile del coordinamento dell intera linea di ricerca, tale WP ha organizzato periodiche riunioni tra i responsabili dei vari WP mirate al continuo aggiornamento dello stato della ricerca. Inoltre si è svolta una specifica attività di coordinamento a livello dell attività di recerca: campionamento, smistamento dei campioni destinati ai diversi laboratori afferenti ai diversi WP (Dipartimento di Biologia dell Università di Padova, CNR-ISMAR) e stesura e integrazione dei rapporti di avanzamento e della presente relazione. WP2: L attività del gruppo di ricercatori del Dipartimento di Biologia si svolta in stretto coordinamento con riunioni periodiche, utili per fare il punto dello stato di avanzamento delle ricerche e una prima verifica critica dei risultati. Attraverso il responsabile dell unità di ricerca, si sono tenuti i rapporti con il coordinatore di progetto, anche mediante incontri organizzati specificamente. WP3: Per la pianificazione delle attività di campagna e la compatibilità delle disponibilità dei mezzi e del personale sono stati effettuati incontri di coordinamento fra gli staff interessati.

29 2.3 Gestione del budget Problematiche inerenti gli aspetti di budget WP1: La gestione finanziaria ha rispettato il piano originario, sebbene in alcuni caso sia stato necessario rimodulare la ripartizione di fondi tra le varie voci per esigenze economiche che si sono presentate durante il lavoro (necessità di formare nuovo personale scientifico e tecnico superiore a quanto previsto inizialmente; necessità di aumentare i fondi disponibili per viaggi e trasferte per consentire l acquisizione e l approfondimento delle conoscenze per lo sviluppo del progetto di ricerca ). WP2: La gestione finanziaria ha rispettato il piano originario, salvo alcune variazioni di destinazione volte ad acquisire software dedicati alla lettura di immagini, e implementazione di materiale inventariabile. Il Dipartimento di Biologia di Padova ha avuto un finanziamento aggiuntivo di ,00 euro finalizzato all ampliamento delle indagini sui microarray WP5: Si segnala come il budget messo a disposizione del WP sia nettamente inferiore, nel totale, al costo del personale impegnato e all ammontare complessivo del prezzo di mercato che il numero di analisi citometriche effettuate comporta Cofinanziamenti ricevuti da altre organizzazioni / Enti WP1: Il Dipartimento di Scienze Ambientali, Università di Venezia ha co-finanziato la presente ricerca con circa euro (a fronte di un finanziamento di circa euro da parte di CORILA) dovute al costo del personale impegnato nel WP1 del presente progetto WP2: Alcuni costi sono stati sostenuti su fondi di ricerca di Ateneo. Ai fini del sequenziamento di EST di mitilo e di go, e per la definizione del MYTarray 1.0 é stata avviata una collaborazione informale con il CRIBI-Università di Padova (rif. Gerolamo Lanfranchi e Cristiano De Pittà, con il Dipartimento di Biologia-Università di Trieste (rif. Alberto Pallavicini, ) e con il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Avanzate- Università del Piemonte Orientale (rif. Aldo Viarengo e Francesco Marsano, WP4: Il Consiglio Nazionale delle ricerche ha co-finanziato la presente ricerca con circa euro (a fronte di un finanziamento di circa euro da parte di CORILA). WP5: Il Consiglio Nazionale delle ricerche ha co-finanziato la presente ricerca con circa euro (a fronte di un finanziamento di circa euro da parte del CORILA) dovute al costo del personale impegnato nel WP5 del presente progetto Valorizzazione del cofinanziamento da parte delle Istituzioni partecipanti WP1: Costo Personale corrispondente ad un totale di 43 mesi/uomo. Eseguiti a titolo gratuito campionamenti integrativi della comunità ittica. WP2: Le metodologie originali di indagini molecolari hanno portato alla collaborazione con qualificati ricercatori dell Università di Padova (CRIBI) e di altre università, con conseguente valorizzazione della qualità dei lavoro svolto. Ricadute rilevanti si sono avute nell ambito della formazione di studenti e giovani ricercatori ospiti. WP3: Il Museo di Storia Naturale ha partecipato alla ricerca finanziando direttamente i costi relativi ad attrezzature, locali, logistica, mezzi e materiali e spese di gestione e funzionamento della struttura che tuttavia non sono stati conteggiati in sede di cofinanziamento. In tale sede sono stati valutati esclusivamente i costi relativi al personale coinvolto nel progetto e coperti direttamente dall Amministrazione di appartenenza dell Istituto. In sede di stipula del contratto è stato richiesto al CO.RI.LA un finanziamento del progetto pari a L ovvero Euro ==. A fronte di tale finanziamento si era ipotizzato un cofinanziamento da parte dell Istituto di L pari a Euro == (ca). Come dettagliato nel corso delle sei fasi di avanzamento del progetto e come risultante dalle relative relazioni amministrative, l importo di cofinanziamento garantito dall Istituto per il solo costo del personale è risultato a consuntivo di Euro ==. WP5: CNR-ISMAR: Costo Personale corrispondente ad un totale di 22 mesi/uomo. Messe a disposizione apparecchiature per oltre euro. Eseguite a titolo gratuito anche ricerche su altri

30 parametri citogenetici (numero di cromosomi e morfologia del cariotipo) di alcune delle specie studiate. 30

31 31 PROGRAMMA DI RICERCA LINEA 3.6 LO STUDIO DELLA BIODIVERSITÀ PER UN EQUILIBRIO FRA CONSERVAZIONE E SFRUTTAMENTO IN LAGUNA DI VENEZIA 3. INFORMAZIONI DI SINTESI SUGLI ARGOMENTI RILEVANTI OGGETTO DELLA RICERCA

32 3.1 Descrizione degli argomenti 32 Argomento 1 - La comunità ittica della laguna di Venezia: descrizione ed analisi della comunità ittica della laguna di Venezia, con particolare attenzione alla funzionalità degli habitats dei bassi fondali lagunari nel supportare la comunità ittica e la sua diversità. Argomento 2 - Le guilds a Singnatidi e Gobidi: analisi delle due famiglie dominanti in laguna, i signatidi e i gobidi, con particolare attenzione alla ripartizione delle risorse spaziali, trofiche e riproduttive. Argomento 3 - Effetti dell introduzione di una specie non indigena, Tapes philippinarum, in Laguna di Venezia e impatti generati dallo sfruttamento della risorsa vongole: analisi comparativa dei database disponibili per la valutazione dell impatto sulla biodiversità lagunare dell introduzione della specie alloctona T. philippinarum. Argomento 4 - Biodiversità genetica in gobidi di ambiente lagunare e valutazioni dell eventuale associazione fra la variabilità genetica e altri indicatori biologici. Argomento 5 - Caratterizzazione genomica/genica Argomento 6 - Analisi funzionale della biodiversità in ascidie Argomento 7 Biomarcatori molecolari Argomento 8 Le specie alloctone del macrozoobenthos della laguna di Venezia: presenza e diffusione: Un fattore che incide sulla diminuzione o perdita di diversità biologica di un determinato ambiente è l introduzione di specie alloctone che spesso, risultando più competitive rispetto alle specie locali e non incontrando nei nuovi habitat adeguati competitori naturali, possono sostituirsi alle specie autoctone provocandone spesso la riduzione e talvolta l eventuale scomparsa. Le specie esotiche che hanno raggiunto la laguna di Venezia sembrano essere accomunate da un ampia valenza ecologica; esse sono infatti adattabili a variazioni di salinità, temperatura e spesso anche di ossigeno disciolto, tollerando inoltre alti tassi di polluzione delle acque. Tali caratteristiche conferiscono a molte di queste specie la capacità di colonizzare nuovi ambienti, entrando in competizione con le specie indigene [Sacchi et al., 1989]. In altri casi le nuove specie sembrano invece presentare valenze specializzate tali da permettere loro di inserirsi all interno di nicchie ancora disponibili negli ambienti di nuova colonizzazione [Sacchi e Occhipinti Ambrogi, 1992]. L aumento della frequenza di comparsa delle specie alloctone in laguna di Venezia può essere spiegato analizzando i relativi meccanismi di penetrazione, che possono essere di diversi tipi ma sostanzialmente di origine spontanea o antropica. Quelli di origine antropica possono a loro volta avvenire in maniera indiretta o diretta. Un esempio di introduzione antropica indiretta è fornito dalla penetrazione di specie esotiche nel Mar Mediterraneo attraverso il canale di Suez (specie lessepsiane) la cui realizzazione, ultimata nel 1869, ha creato un varco attraverso regioni geografiche in precedenza separate: il Mar Mediterraneo da un lato, il Mar Rosso e l Oceano Indiano dall altro. Gli organismi di provenienza tropicale (in particolare di area indopacifica) rappresentano in effetti il contingente maggiore tra le specie esotiche presenti nel bacino del Mediterraneo, favorite in questo dalle correnti ascendenti lungo il Canale, dirette verso Nord. Nettamente minore è il gruppo di organismi provenienti dall Oceano Atlantico attraverso lo stretto di Gibilterra [Mizzan e Trabucco, 2002]. Le introduzioni antropiche dirette possono essere accidentali o volontarie. Una causa frequente di introduzione accidentale è lo sviluppo di intensi traffici marittimi con naviglio di elevata stazza che, con il conseguente accorciamento dei periodi di navigazione, ha di fatto diminuito notevolmente l isolamento biogeografico di ambienti che prima potevano definirsi lontani. Il trasporto di specie alloctone può in questo caso avvenire attraverso meccanismi di stivaggio e scarico di notevoli quantitativi di acque di sentina (zavorra) delle navi cisterna o tramite il trasporto di organismi aderenti alle carene di navi, piattaforme petrolifere ed altre strutture. Oltre ai citati meccanismi di penetrazione che si può definire passiva, o comunque involontaria, si deve inoltre considerare una sempre maggiore incidenza delle introduzioni deliberate di specie esotiche per acquacoltura o per inopportune campagne di ripopolamento. L inquinamento e il diffuso degrado ambientale indeboliscono inoltre le comunità locali contribuendo all affermazione di specie esotiche spesso maggiormente competitive, soprattutto in

33 condizioni di spiazzamento delle specie indigene. Se grazie ai citati meccanismi di penetrazione si può spiegare l incremento della frequenza di comparsa delle specie alloctone in laguna, come in altri ambienti simili, l aumento del fenomeno di completa acclimazione potrebbe quindi essere localmente favorito dai profondi fenomeni di interazione umana a cui la stessa laguna di Venezia è sottoposta in modo sempre più pesante. Argomento 9 - Biodiversità a livello di comunità macrobentoniche Argomento 10 - Contenuto di DNA nucleare in pesci Singnatidi e Gobidi: per mezzo della citometria a flusso, si intendeva studiare il contenuto di DNA nucleare nelle specie ittiche della Laguna di Venezia appartenenti dalle due famiglie di Teleostei Syngnathidae e Gobiidae. Sono stati determinati sia il contenuto di DNA totale che la frazione del genoma costituita dal paio di basi azotate Adenina-Timina. 33

34 3.2 Argomento 1 (La comunità ittica della laguna di Venezia) Composizione unità operativa Elenco di ricercatori e tecnici Cognome nome Istituto di appartenenza Mainardi Danilo DSA, Università di Venezia Torricelli Patrizia DSA, Università di Venezia Franzoi Piero DSA, Università di Venezia Pranovi Fabio DSA, Università di Venezia Elenco di studenti (tesi, PhD, ecc.) Cognome nome Istituto di appartenenza Malavasi Stefano DSA, Università di Venezia Franco Anita DSA, Università di Venezia Fiorin Riccardo DSA, Università di Venezia Riccato Federico DSA, Università di Venezia Granzotto Angela DSA, Università di Venezia Zucchetta Matteo DSA, Università di Venezia Fortibuoni Tomaso DSA, Università di Venezia Obiettivi Il principale obiettivo di questo argomento è stata l analisi della comunità ittica della laguna di Venezia, quale componente significativa, ma complessivamente poco studiata fino ad oggi, della biodiversità di questo ecosistema. La comunità ittica, essendo composta da specie, che hanno in molti casi un interesse alieutico (target della pesca artigianale o della vallicultura in laguna) e, in altri, una rilevanza conservazionistica (specie inserite direttiva habitat o red list ), rappresenta un aspetto della biodiversità lagunare che necessita di un oculata gestione, alla cui base devono pertanto esserci opportuni strumenti conoscitivi. Il nostro obiettivo è stato dunque quello di fornire tali strumenti, attraverso la raccolta e l elaborazione di dati che mettano a fuoco la struttura e le dinamiche della comunità ittica lagunare. La comunità ittica non è stata soltanto studiata in termini di composizione tassonomica, ma anche in termini funzionali. Quest ultimo aspetto è stato affrontato individuando dei raggruppamenti di specie caratterizzate dall avere un ruolo ecologico simile, rispetto all utilizzo di un dato set di risorse (guild), e analizzando il contributo relativo di tali gruppi funzionali sul totale della comunità. Inoltre, è stata indagata la relazione fra la struttura della comunità e le caratteristiche degli habitat lagunari, in cui essa è stata campionata, in modo da chiarire il ruolo che i diversi habitat rivestono nel sostenere diversità e abbondanze ittiche. Si sono anche ricercati quei fattori abiotici o biotici in grado di influenzare in modo significativo i parametri della comunità stessa Attività preliminari Una prima fase del lavoro è stata quella del reperimento di tutte le informazioni bibliografiche relative a studi delle comunità ittiche in ambienti lagunari o di estuario. In tale modo si sono approfondite le conoscenze sulle tecniche di campionamento dei bassi fondali, sulle tecniche di acquisizione dei dati e di elaborazione degli stessi, con lo scopo di ottimizzare il lavoro di ricerca da svolgere in laguna di Venezia. In questa fase si sono inoltre definiti i protocolli da seguire in tutte le attività in campo e in laboratorio. E stata condotta anche una campagna di campionamento esplorativa in laguna, al fine di identificare i principali habitats di basso fondale presenti in questo ambiente. Durante questa campagna preliminare sono state inoltre individuate le stazioni di campionamento, sono stati collaudati gli strumenti per il campionamento della fauna ittica e affinate le tecniche di campionamento.

35 3.2.4 Attività in campo ed in laboratorio Il campionamento della fauna ittica nei bassi fondali della laguna di Venezia è stato effettuato mediante l utilizzo di due strumenti complementari, il cogollo (rete da posta) e la tratta da pesce novello (rete da circuizione) (Fig. 1). 35 Cogollo Tratta da pesce novello Fig. 1 Reti utilizzate per il campionamento della fauna ittica nei bassi fondali della laguna di Venezia. Campionamento con cogolli - Il campionamento con attrezzi da posta è stato effettuato in 4 stazioni nella laguna di Venezia (Fig. 2). Tali stazioni sono state scelte in primo luogo sulla base di criteri geografici in modo da rappresentare i tre sottobacini in cui viene comunemente suddivisa la laguna di Venezia, e cioè bacino settentrionale (Ca Zane, indicata come CZ), centrale (Lido e Lago dei Teneri, indicate come LD e LT, rispettivamente) e meridionale (Chioggia, indicata come CH). Le quattro stazioni sono state inoltre scelte per la diversa tipologia dell habitat che le caratterizza. La stazione CH è localizzata in un area in cui il substrato, sabbioso-fangoso, è ricoperto da una prateria omogenea di fanerogame (Zostera marina e Cymodocea nodosa) [Rismondo et al., 2003]. Tale area, essendo situata di fronte alla bocca di porto di Chioggia, risente delle influenze marine e, inoltre, si trova anche in prossimità alle zone di barena retrostanti (vedi Fig. 2). La stazione LD è anch essa situata in un area di prateria a fanerogame (prevalentemente Z. marina, Rismondo et al., 2003), sebbene qui la prateria sia meno omogenea in termini di copertura del fondale. Anche quest area è relativamente vivificata dal mare per la presenza di un canale (Canale degli Orfanelli) che la collega direttamente con la bocca di porto di Malamocco, mentre non vi sono aree di barena nelle immediate vicinanze. La stazione LT è situta nella zona retrostante le casse di colmata artificiali realizzate nella laguna centrale ed è, perciò, più confinata e risente meno delle influenze marine rispetto a CH e LD. In quest area il substrato è a granulometria più fine e non è individuabile una prateria strutturata a fanerogame, sebbene si sia osservata durante il campionamento la presenza di Z. marina a chiazze. La stazione CZ è localizzata in un area a substrato fangoso non vegetato (in termini di macrofite acquatiche), in prossimità di aree di barena interne. Nonostante tale area sia lontana dalla bocca di porto di Lido (circa 12 Km), gli apporti marini giungono in quest area grazie al canale navigabile di San Felice che la collega direttamente alla bocca di porto. Il campionamento è avvenuto mediante la collaborazione con pescatori locali professionisti che sono stati contattati al fine di programmare le uscite e il lavoro sul campo. Le reti da posta utilizzate in laguna sono denominate tresse con cogolli e sono costituite da una rete alta 1,30-1,40 m., tesa tra dei pali in numero di 60-80, distanti 1-1,20 m. uno dall altro e conficcati nei bassi fondali lagunari, terminante in una trappola (cogollo) di forma cilindrica o conica montata su anelli e completata dal corpo o dalle ali (o guide) che dirigono il pesce verso l apertura del sacco

36 terminale. Le trappole terminali ( code ) venivano issate e svuotate e le specie ittiche pescate venivano identificate e quantificate in termini di numero di individui per specie e/o peso fresco (biomassa in gr) per le specie più abbondanti. Le operazioni sul campo hanno dunque richiesto un coordinamento tra pescatori locali e campionatori DSA. I campionamenti, iniziati a Marzo 2001 nelle stazioni di CZ, LD e LT, e a Ottobre 2001 nella stazione CH (per problemi di disponibilità dell imbarcazione), sono stati svolti con cadenza mensile fino a Ottobre Sono stati inoltre effettuati due campionamenti stagionali (primaverile ed estivo) nel Laguna di Venezia 5 Km CZ VENEZIA LT LD Bocca di porto di Lido Bocca di porto di Malamocco CH Bocca di porto di Chioggia Mar Adriatico Fig. 2 Stazioni di campionamento con reti da posta (cogolli) in laguna di Venezia. (CZ=Ca Zane; LD=Lido; LT=Lago dei Teneri; CH=Chioggia) Campionamento con tratta - Il campionamento con reti da circuizione è stato condotto in 68 stazioni distribuite all'interno della laguna di Venezia (Fig. 3). Le stazioni sono state scelte in modo tale da poter campionare in ognuno dei tre sottobacini lagunari (Nord, Centrale e Sud) circa 5 repliche delle 5 tipologie principali di habitat di bassofondale individuate in laguna: prateria omogenea di fanerogame marine (P); habitat vegetato, con presenza di fanerogame a chiazze/ciuffi (F); habitat a substrato nudo sabbioso (S); habitat a substrato nudo fangoso, situato in zone aperte (BA); habitat a substrato nudo fangoso, interno alle barene (in ghebi, BC). Il campionamento con reti da circuizione è iniziato, come da programma, nel terzo semestre di attività (Aprile 2002) ed è stato condotto stagionalmente (primavera, estate ed autunno) fino a Dicembre Questo campionamento è stato effettuato dal personale del DSA, utilizzando una "tratta da pesce novello". Quest'ultima consiste in una rete di 10 x 2.5 mt, con una lima da piombi nel bordo sottostante e una lima da sugheri in quello superiore, e con maglie di 2 mm. La rete è stata trainata manualmente in condizioni di semiimmersione da due operatori DSA per una distanza di 15 metri, in modo tale da standardizzare il campionamento su un'area fissa e per ogni stazione il campionamento è stato replicato tre volte, in modo tale da campionare un area totale di 360 m 2. La rete veniva chiusa in acqua dagli operatori e quindi issata a bordo dell'imbarcazione, dove avveniva lo svuotamento della stessa, l identificazione delle specie ittiche pescate e l acquisizione del dato di abbondanza (numero di individui) e biomassa (grammi) per specie. Il pescato veniva quindi liberato, ad eccezione di Singnatidi e Gobidi, che, anestetizzati, venivano conservati in formalina (10%) per l'analisi dei contenuti stomacali, in funzione dell analisi di diete e relazioni trofiche (Argomento 2).

37 37 Fig. 3 Stazioni di campionamento con reti da circuizione (tratta) in laguna di Venezia, categorizzate per tipologia di habitat. (US=habitat non vegetato sabbioso (S); UM= habitat non vegetato fangoso in zona aperta (BA); UC= habitat non vegetato fangoso in ghebo (BC); V1=prateria fitta di fanerogame (P); V2=habitat con presenza di fanerogame a chiazze (F)). Durante i due campionamenti sono state acquisite anche misure di temperatura e salinità dell acqua nella stazione campionata, mediante l utilizzo di un termometro digitale e di un rifrattometro. Sulla base di una mappatura GIS delle stazioni di campionamento (campagna con tratta) sono state inoltre misurate le distanze di ogni stazione dalla più vicina bocca di porto e dal canale principale (profondità minima 2.5 m) più prossimo quali indici della potenziale influenza del mare Elaborazione Sulla base delle informazioni ottenute durante il campionamento è stata stilata una lista delle specie ittiche rinvenute nei bassi fondali della laguna di Venezia. Queste specie sono state raggruppate per famiglia e ad esse è stata attribuita l appartenenza ad una guild ecologica che descrive l uso che la specie fa dell ambiente lagunare. I gruppi ecologici considerati sono: (1) residenti estuarini (ER), che compiono il loro intero ciclo vitale in laguna; (2) migratori giovanili (MJ), cioè specie marine migratrici che si riproducono in mare ed entrano in laguna come giovanili per accrescersi e quindi uscire da adulti (utilizzo della laguna come nursery); (3) migratori stagionali (MS), cioè specie marine che compiono migrazioni periodiche dal mare alla laguna nel corso dell anno principalmente a scopo trofico; (4) marini occasionali (MA), specie marine che entrano occasionalmente in laguna; (5) specie dulciacquicole (FW), che si rinvengono occasionalmente in laguna; (6) diadromi (CA), specie che utilizzano la laguna come via di passaggio per le migrazioni dalle acque dolci al mare o viceversa a scopi riproduttivi (specie catadrome e anadrome). La struttura della comunità ittica nelle stazioni campionate (cogolli) e nei diversi habitats (tratta) è stata visualizzata mediante istogrammi di abbondanza percentuale delle specie, delle

38 famiglie e dei gruppi ecologici, e i risultati sono stati confrontati tra le due tecniche di campionamento. La distribuzione delle specie rinvenute nei bassi fondali della laguna di Venezia nei due campionamenti è stata messa in relazione ai parametri ambientali misurati (temperatura e salinità), alla tipologia di habitat, alla stagione di campionamento e alla localizzazione delle stazioni campionate rispetto ai punti di immissione di acqua marina (bocche di porto e canali principali). Ciò è stato possibile mediante una tecnica multivariata di ordinamento dei dati, l analisi canonica delle corrispondenze (CCA). Questo tipo di analisi consente di capire quali sono le variabili ambientali che più influenzano la distribuzione osservata della comunità e consente di utilizzare sia variabili quantitative (temperatura, salinità, distanze dalle bocche di porto e canali, nel nostro caso) che qualitative (presenza-assenza nelle stagioni e nei diversi habitats) [Jongman et al., 1995]. I risultati di questa analisi sono stati riportati in diagrammi bidimensionali in cui le specie sono rappresentate da punti e le varaiabili ambientali da vettori. Per una più agevole lettura di questi grafici, di seguito si danno alcune indicazioni, riportate approfonditamente in Jongman et al. [1995]: 1. Maggiore è la lunghezza di un vettore ambientale, maggiore è la sua influenza nello spiegare la variabilità spazio-temporale osservata tra le specie. 2. Quanto più le direzioni di due vettori sono vicine maggiore è la correlazione tra le variabili ambientali corrispondenti (se i due vettori sono perpendicolari la correlazione è nulla). Lo stesso vale tra vettori ambientali e gli assi del diagramma CCA. 3. Più vicina è una specie ad un vettore, più forte è la relazione tra la distribuzione di quella specie e la variabile ambientale rappresentata dal vettore. 4. La posizione relativa di una specie lungo un vettore (la sua proiezione sul vettore) dà un indicazione del tipo di effetto di quella variabile ambientale sulla distribuzione della specie (es. aumento dell abbondanza della specie ad alti o bassi valori della variabile ambientale). 5. Le specie localizzate attorno all origine degli assi nel diagramma non mostrano una forte relazione con nessuna delle variabili misurate oppure sono rinvenute in corrispondenza del valore medio totale di ognuna delle variabili ambientali misurate. Per quanto riguarda i dati della campagna di campionamento con la rete da circuizione, sono stati calcolati degli inidci sintetici che descrivessero la comunità e la sua diversità in ognuna delle stazioni di campionamento. Indici quali l abbondanza e la biomassa medie, il numero di individui giovanili e la loro incidenza percentuale sull abbondanza totale hanno permesso di avere una visione di massima sulla distribuzione della fauna ittica nella laguna. La diversità, invece, è stata quantificata mediante indici quali il numero di specie, la ricchezza specifica (indice di Margalef) e l indice di diversità di Shannon-Wiener. Il valore di tali indici è stato confrontato tra tipologia di habitat mediante un analisi della varianza (ANOVA) fattoriale, in cui sono stati considerati i fattori habitat e stagione. Un analisi analoga è stata applicata alle abbondanze dei gruppi ecologici calcolati per ogni stazione campionata. In questo modo è stato possibile capire l importanza dei diversi habitat nel supportare la comunità ittica e la biodiversità in laguna, e la loro funzionalità nell accogliere diversi gruppi ecologici. I dati di abbondanza e biomassa sono stati trasformati con log(x+1) prima dell analisi per rispettare le assunzioni dell ANOVA. Il test di Tukey è stato applicato per i confronti post-hoc tra gli habitats. Per analizzare la presenza di particolari pattern spaziali alcuni dei principali indici sono stati spazializzati e sono state quindi prodotte delle mappe stagionali di distribuzione di tali indici. La tecnica di interpolazione utilizzata per effettuare le spazializzazioni dell abbondanza totale, del numero di specie e dell indice di Shannon è il kriging. La scelta del modello di interpolazione e dei suoi parametri è stato effettuato caso per caso dopo aver completato lo studio del semivariogramma Risultati ottenuti Il campionamento della comunità ittica ha permesso di redigere una prima completa ed aggiornata lista delle specie ittiche presenti nei bassi fondali della laguna di Venezia (Tab. 1). Tale lista, frutto dell integrazione fra i due attrezzi di campionamento (cogollo e tratta), annovera un totale di 62 specie. La maggior parte di queste specie (38, pari al 61%) sono state campionate con 38

39 entrambi gli strumenti, ma le rimanenti specie sono state catturate esclusivamente con uno dei due attrezzi (10 soltanto con il cogollo, e 14 soltanto con la tratta): ciò è la riprova della complementarietà dei due sistemi utilizzati e dell utilità di integrare diversi metodi di campionamento al fine di ottenere informazioni rappresentative dell intera comunità ittica lagunare. Le specie che compongono la comunità ittica lagunare nel suo complesso, appartengono per il 33% al gruppo funzionale dei marini occasionali, per il 28% al gruppo dei residenti estuarini, per circa un 18% ai migratori giovanili, e, infine, per un 13 ai migratori stagionali. I gruppi ecologici di diadromi e specie dulciacquicole sono invece rappresentati ognuno da un numero di specie pari al 3% del totale. E interessante notare che le uniche due specie diadrome (Anguilla anguilla e Alosa fallax) sono state catturate mediante i cogolli. La dominanza dei marini occasionali in termini di numero di specie potrebbe essere il riflesso di un processo di sempre maggior influsso marino subìto dall ambiente lagunare. Anche analizzando il contributo in termini di abbondanza percentuale delle specie, famiglie e gruppi funzionali che compongono la comunità ittica, si può dedurre che i due sistemi utilizzati permettono la raccolta di informazioni complementari, pur fornendo nel complesso un quadro generale molto simile riguardo alla composizione qualitativa della comunità (Fig. 4). In termini di abbondanza percentuale, infatti, si nota che Atherina boyeri è la specie dominante nel caso del campionamento con i cogolli, e la seconda specie più abbondante nel contesto dei dati ottenuti con la tratta (Fig. 4a e 4d); osservazione che indica l ubiquità e il generalismo ecologico di questa specie. Le specie epibentoniche, come i piccoli gobidi del genere Pomatoschistus e Knipowitschia appaiono, invece, essere meglio rappresentate nella comunità campionata con la tratta, dove infatti la specie nettamente più abbondante è Pomatoschistus marmoratus, che è invece una presenza sporadica nei cogolli. Ciò si riflette molto chiaramente anche sul contributo in abbondanza percentuale dato dalle famiglie (Fig. 4b e 4e): i gobidi sono ben rappresentati e dominanti in tutti gli habitat campionati con la tratta; i singnatidi sono, invece, la famiglia dominante nell habitat a praterie di fanerogame. Al contrario, i gobidi hanno abbondanze relative modeste nei campioni ottenuti col cogollo, e i singnatidi vengono raramente campionati con questo attrezzo. La composizione della comunità in termini di abbondanza percentuale delle diverse guild ecologico-funzionali (Fig. 4c e 4f): sembra piuttosto simile tanto per la tratta che per il cogollo, con i residenti estuarini dominanti in entrambe le situazioni, mentre, per quel che riguarda i restanti gruppi funzionali, un contributo significativo è dato dai marini giovanili nel caso dei dati ottenuti con la tratta e dai marini stagionali nel caso del cogollo. Quest ultimo gruppo è meglio rappresentato nei campioni provenienti dai cogolli, probabilmente perchè formato da specie migratrici di maggiore dimensioni, che finiscono probabilmente nelle reti da posta nel corso dei loro spostamenti lungo rotte di migrazione, che coincidono spesso con le aree sui cui i pescatori posizionano le reti stesse. Al contrario, la tratta si presta maggiormente alla cattura di specie migratrici di piccole dimensioni, quali le forme giovanili, maggiormente legati a particolari tipi di habitat, quali le zone interne e chiuse da barene e ghebi. L analisi canonica delle corrispondenze (CCA) ha consentito di mettere in relazione la distribuzione delle specie campionate con i due attrezzi da pesca con le variabili abiotiche caratterizzanti le stazioni di campionamento. In entrambi i casi (cogollo e tratta) le variabili ambientali considerate si sono rivelate significative nell influenzare la distribuzione spaziotemporale delle specie ittiche nella laguna di Venezia, spiegando circa il 36% della variabilità tra le specie osservata. Poiché i primi due assi determinati dalla CCA descrivono da soli circa il 70% di questa variabilità in entrambe le analisi, sulla base di questi due assi sono stati interpretati i risultati e sono stati costruiti i diagrammi CCA (Fig. 5 e Fig. 6). Le analisi CCA dei dati provenienti sia dal campionamento con cogolli che da quello con tratta hanno mostrato come i fattori principali nell influenzare la distribuzione delle specie ittiche nei bassi fondali lagunari siano la stagionalità insieme con la temperatura per quanto riguarda la variabilità temporale e il tipo di habitat, in termini di strutturazione dello stesso, per quanto riguarda la variabilità spaziale. La variabilità stagionale della comunità ittica della laguna di Venezia si può osservare lungo la direzione dell asse 1 in Fig. 5 39

40 e dell asse 2 in Fig. 6, ed è possibile notare come il campionamento con i due attrezzi metta in evidenza aspetti simili ma anche diversi, dimostrando un altra volta la complementarietà dei due metodi di campionamento. Dal campionamento con cogolli (Fig. 5) risulta un elevata stagionalità nell abbondanza di alcune specie, tra cui due specie residenti, il singnatide S. abaster e il blennide S. pavo, e lo sparide D. annularis (migratore stagionale), che presentano picchi di abbondanza in primavera-estate, e il gruppo dei mugilidi (le tre specie L. aurata, L. ramada e L. saliens, e soprattutto i mugilidi non identificati perché giovanili), le cui massime abbondanze si riscontrano invece durante la stagione fredda, periodo di entrata in laguna dal mare per le specie migratrici di questa famiglia e di reclutamento successivo alla riproduzione estiva per la specie residente (L. saliens). Picchi di abbondanza primaverili dei pesci piatti, S. vulgaris e P. flesus, legati al reclutamento in questo periodo della specie residente (P. flesus) e alla migrazione dal mare alla laguna di S. vulgaris (migratore giovanile), sono evidenziati in particolare dai risultati relativi al campionamento con la tratta (Fig. 6), ma sono confermati anche da quelli relativi ai cogolli, seppur in maniera meno evidente. Le specie ittiche si separano spazialmente all interno dei bassi fondali lagunari sulla base della tipologia di habitat presente nelle stazioni campionate, in particolare in relazione alla presenza di una strutturazione dell habitat stesso, sia essa verticale, dovuta alle fanerogame (in habitats di prateria e nelle stazioni CH e LD), o orizzontale come nei ghebi e nelle zone adiacenti alle barene (BC e BA, e stazione CZ). I diagrammi CCA mostrano come in aree vegetate (praterie di fanerogame, P, stazioni CH e LD) la comunità ittica sia dominata dalle specie di singnatidi (residenti delle praterie) e dalle due specie residenti di gobidi, Z. ophiocephalus e G. niger. In questi habitats si ritrovano anche alte abbondanze di labridi (Labridi non identificati nei cogolli, S. roissali nella tratta), specie marine che entrano occasionalmente in laguna, e ciò è legato alla localizzazione delle praterie in prossimità delle bocche di porto, o comunque in zone a elevata influenza marina, come evidente in Figg. 2 e 3 e come confermato dalla forte correlazione negativa tra il vettore P e i vettori Canal_dist e Seainlet_dist (Fig. 6). In aree dove le fanerogame sono assenti (habitats BA e BC) e dove si può riconoscere una struttura orizzontale (diramazioni del ghebo all interno della barena, bordi del ghebo o della barena) la comunità ittica è composta per lo più dalle specie di gobidi di piccole dimensioni, appartenenti ai generi Pomatoschistus e Knipowitschia. In questi habitats sono inoltre abbondanti anche i mugilidi, la sogliola (S. vulgaris) e la passera (P. flesus) (Fig. 6). E interessante notare come le due aree più interne di Ca Zane (CZ) e Lago dei Teneri (LT) pur condividendo questa tipologia di habitat si differenzino notevolmente l una dall altra, con LT che supporta una comunità dominata dai mugilidi e A. fasciatus durante la stagione fredda e CZ, in cui le maggiori abbondanze si rinvengono durante la stagione primaverile e sono dovute ai pesci piatti, acciughe e branzini (Fig. 5). L analisi della varianza applicata ai dati ottenuti dal campionamento con la tratta ha permesso di capire la funzionalità e l importanza dei diversi habitats individuati nei bassi fondali lagunari nel sostenere la comunità ittica e la biodiversità. L abbondanza ittica totale ha mostrato una variazione altamente significativa tra le cinque tipologie di habitat comune alle tre stagioni considerate (Habitat x Stagione: p>0.05; Habitat: F=6.11, p<0.001), con massime abbondanze nell habitat BC, seguito dall habitat P, e minime in F e S (Fig. 7a). Un risultato analogo è stato ottenuto per la biomassa totale (Habitat x Stagione: p>0.05; Habitat: F=9.48, p<0.001), sebbene in questo caso la biomassa massima sia stata trovata in prateria, seguita dall habitat BC (Fig. 7b). Questi risultati hanno permesso di identificare le praterie di fanerogame (P) e i ghebi (BC) come gli habitats che supportano quantitativamente la comunità ittica dei bassi fondali della laguna di Venezia. Nei ghebi (BC) si concentrano elevate abbondanze di individui per lo più di piccole dimensioni, dati da specie di piccola taglia (ad es. i piccoli gobidi, come visto precedentemente) e da individui giovanili di altre specie, come confermato dalla maggiore incidenza, in termini quantitativi, dei giovanili in quest habitat. Nelle praterie di fanerogame (P), invece, vi sono elevate abbondanze di individui più grandi (maggiore biomassa), probabilmente legate all abbondanza in questo habitat di specie di maggiori dimensioni come i gobidi Z. ophiocephalus e G. niger. Al contrario, l habitat S si è rivelato quello meno importante sotto l aspetto quantitativo, per la comunità ittica. Esso è probabilmente un habitat di transito per le diverse specie ittiche, e questo sembrerebbe confermato 40

41 dall assenza di una comunità ittica tipica di questo habitat, come invece osservato per le praterie e i ghebi. I cinque habitats individuati hanno mostrato differenze significative anche in termini di diversità della comunità ittica, misurata mediante l indice di Shannon-Wiener (Habitat x Stagione: p>0.05; Habitat: F=2.84, p<0.05) (Fig. 7c). Gli habitats F, P e BC hanno mostrato la maggiore diversità nella loro comunità ittica, ma, mentre in P e BC si sono ritrovate delle comunità tipiche, caratterizzanti questi ambienti (vedi risultati mostrati precedentemente), in F non è stata osservata una condizione simile. Questi risultati suggeriscono una sorta di gradiente di diversità legato alla complessità strutturale dell habitat: ad esempio la prateria rada (F), dove si ricontra il massimo di diversità, è probabilmente l habitat che contiene un più ampio numero di nicchie ecologiche disponibili, data la sua maggiore eterogeneità ( patchiness ). Il confronto tra habitats in termini di abbondanza dei gruppi ecologici ha mostrato differenze significative sempre omogenee tra le stagioni (Habitat x Stagione: p>0.05), ad eccezione dei MJ, per cui la differenza tra habitats variava con la stagione (Habitat x Stagione: F=2.55; p<0.05). Le massime abbondanze delle specie residenti si sono ritrovate in BC e P, mentre le specie marine occasionali si pescavano con maggiori abbondanze negli habitats più prossimi alle bocche di porto e perciò più vicini al mare, cioè P e S (Fig. 8b e 8c). I migratori stagionali si concentravano in habitat aperti, quali BA e S (Fig. 8b). Per quanto riguarda i migratori giovanili, la loro distribuzione tra gli habitat variava a seconda della stagione, con un massimo di abbondanza nei ghebi (BC) durante la primavera e una progressiva diminuzione dell abbondanza in questo habitat, fino a valori minimi in autunno, quando le abbondanze massime si trovavano in BA e F (Fig. 8d). Un fattore comune a tutte e tre le stagioni per quanto riguarda la distribuzione dei migratori giovanili è la costante bassa (quasi nulla) abbondanza di queste specie in prateria, a indicazione del fatto che, contrariamente a quanto osservato in altri studi [Orth and van Montfrans, 1987; Heck et al., 1997; Beck et al., 2001], le praterie nella laguna di Venezia non sembrano avere un ruolo di nursery per le specie marine, almeno per quanto rigurda le praterie dei bassi fondali lagunari. La spazializzazione dell abbonanza totale, del numero di specie e dell indice di Shannon è riportata nelle Figure 9, 10 e 11. L interpolazione dell abbondanza totale (Fig. 9), in primavera, mostra come questa sia più elevata nel bacino nord, raggiungendo i valori massimi in prossimità della foce del fiume Dese, mentre per gli altri bacini l abbondanza sembra essere bassa e distribuita omogeneamente. In estate la situazione risulta più complessa, con un deciso innalzamento dei valori medi, e maggior eterogeneità nella distribuzione, con una grossa variabilità a piccola scala. In autunno la situazione torna ad essere più simile a quella primaverile, ma il picco del bacino nord è posizionato in prossimità della bocca di porto del Lido ed è presente un area, posta nella parte interna del bacino centrale, che si differenzia dal comportamento dei bacini centro-sud in quanto presenta un abbondanza più elevata. L andamento del numero di specie (Fig. 10) è più difficilmente definibile, a causa della scala di variazione piuttosto compressa. In primavera si riscontra un numero di specie più elevato nella parte superiore del bacino nord e dietro le casse di colmata nel bacino centrale, mentre la parte del bacino centrale retrostante al litorale del Lido si discosta per il minor numero di specie di tutto il bacino. In estate il pattern non cambia molto, anche se scompare la zona meno ricca in specie in prossimità del Lido, e, in assoluto, i valori sono più elevati. In autunno la differenza nella distribuzione del numero di specie è ulteriormente assottigliata e risulta difficile individuare degli areali caratterizzati da comportamenti particolari. L indice di Shannon (Fig. 11), in primavera, mostra i valori più bassi tra quelli delle tre stagioni, con una distribuzione piuttosto variabile, tanto da non consentire l identificazione di pattern ben distinti. In estate, quando la distribuzione dell indice è più omogenea, si raggiungono i valori più elevati, che sembrano concentrati nel bacino nord, anche se nella fascia delle barene degli altri bacini sembra esserci una zona ad elevata diversità. In autunno si ha nuovamente una diminuzione dell indice di diversità, che si assesta su valori mediamente più elevati rispetto alla primavera, riprendendone, però, la caratteristica di variabilità a piccola scala. 41

42 42 Codice specie famiglia specie attrezzo Guild Ecologica Aan Anguillidae Anguilla anguilla C CA Abo Atherinidae Atherina boyeri T+C ER Bbe Belonidae Belone belone T+C MS Pga Blennidae Parablennius gattorugine C MA Psa Blennidae Parablennius sanguinolentus T MA Pte Blennidae Parablennius tentacularis T MA Spa Blennidae Salaria pavo T+C ER Ala Bothidae Arnoglossus laterna T MA Cri Callionimidae Callionymus risso T+C MA Ttr Carangidae Trachurus trachurus C MA Alfa Clupeidae Alosa fallax C CA Spi Clupeidae Sardina pilchardus T+C MS Ssp Clupeidae Sprattus sprattus T+C MS Cco Congridae Conger conger C MA Cca Cyprinidae Carassius carassius T FW Apfa Cyprinodontidae Aphanius fasciatus T+C ER Een Engraulidae Engraulis encrasicolus T+C MS Mme Gadidae Merlangius merlangus T+C MJ Gco Gobiidae Gobius cobitis T+C MA Gpa Gobiidae Gobius paganellus C ER Gni Gobiidae Gobius niger T+C ER Kpa Gobiidae Knipowitschia panizzae T+C ER Pca Gobiidae Pomatoschistus canestrinii T+C ER Pma Gobiidae Pomatoschistus marmoratus T+C ER Pmi Gobiidae Pomatoschistus minutus T+C MJ Zop Gobiidae Zosterisessor ophiocephalus T+C ER Sro Labridae Symphodus roissali T+C MA Symp1 Labridae Symphodus sp.1 T Symp2 Labridae Symphodus sp.2 T Dla Moronidae Dicentrarchus labrax T+C ER Cla Mugilidae Chelon labrosus T+C MS Lau Mugilidae Liza aurata T+C MS Lra Mugilidae Liza ramada T+C MJ Lsa Mugilidae Liza saliens T+C ER Mce Mugilidae Mugil cephalus T MJ Mba Mullidae Mullus barbatus T+C MJ Pfl Pleuronectidae Platichthys flesus T+C ER Gho Poeciliidae Gambusia holbrooki T+C ER Str Salmonidae Salmo trutta C FW Sum Sciaenidae Sciaena umbra T MA Uci Sciaenidae Umbrina cirrosa C MJ Ssc Scombridae Scomber scombrus C MA

43 43 Codice specie famiglia specie attrezzo Guild Ecologica Srh Scophthalmidae Scophthalmus rhombus T MJ Sim Soleidae Solea impar T MJ Svu Soleidae Solea vulgaris T+C MJ Bbo Sparidae Boops boops T+C MA Dan Sparidae Diplodus annularis T+C MS Dpu Sparidae Diplodus puntazzo T MA Dsa Sparidae Diplodus sargus T+C MA Dvu Sparidae Diplodus vulgaris C MA Lmo Sparidae Lithognathus mormyrus T+C MS Sau Sparidae Sparus aurata T+C MJ Hgu Syngnathidae Hippocampus guttulatus T+C MA Hhi Syngnathidae Hippocampus hippocampus T+C MA Nop Syngnathidae Nerophis ophidion T ER Sab Syngnathidae Syngnathus abaster T+C ER Sac Syngnathidae Syngnathus acus T+C MA Sta Syngnathidae Syngnathus taenionotus T ER Ste Syngnathidae Syngnathus tenuirostris T+C MA Sty Syngnathidae Syngnathus typhle T+C ER Evi Trachinidae Echiichthys vipera T MA Tlu Triglidae Trigla lucerna T+C MJ Tab. 1 Lista delle specie campionate con i due attrezzi da pesca (C=cogollo; T=tratta) in laguna di Venezia. Per ogni specie è indicato il codice identificativo, la famiglia e il gruppo ecologico di appartenenza.

44 44 100% 80% 60% 40% 20% 0% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 100% a) d) b) c) Altro Een Svu Gni Ssp Pfl Zop Abo LT LD CZ CH Altro Engraulidae Soleidae Mugilidae Clupeidae Pleuronectidae Gobiidae Atherinidae LT LD CZ CH 100% 80% 60% 40% 20% 0% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 100% e) f) BA BC F P S Altro Nop Lra Pca Apfa Een Zop Pmi Lsa Sty Sab Kpa Abo Pma Altro Cyprinodontidae Engraulidae Mugilidae Atherinidae Syngnathidae Gobiidae BA BC F P S 80% 60% 40% 20% FW MJ MA MS ER CA 80% 60% 40% 20% MJ FW MA MS ER 0% LT LD CZ CH 0% BA BC F P S Fig. 4 Composizione (abbondanza percentuale) in specie (a, d; per i codici identificativi delle specie vedi tab. 1), famiglie (b, e) e gruppi ecologici (c, f) nella comunità ittica dei bassi fondali della laguna di Venezia, campionata con due attrezzi da pesca complementari, cogolli (a-c) e tratta (d-f).

45 Axis 2 Axis 2 45 CCA variable scores CZ Pfl Dla Een T P-E(1) Sab Dan Spa Svu Hgu Pma Pmi Mba Ttr Apfa Sau DIPL Sta TluSsc Uci Cco Ssp Dvu Mme Pca Aan Lsa Gho SPAR Mce Str Cla Cri POM Abo Bbo Pga Spi Dsa PGO S Lmo Alfa Kpa Bbe Gni Gco Zop HIPPOC Sac Hhi LABR Sty LD CH Ste Lra Lau LT A-I(2) MUG Vector scaling: 1.52 Axis 1 Fig. 5 Diagramma CCA della distribuzione delle specie ittiche (punti; per la definizione dei codici specie vedi Tab. 1) campionate con cogolli nella laguna di Venezia in relazione alle variabili ambientali (vettori: T=temperatura; S=salinità; CH=stazione Chioggia; LD=stazione Lido; LT=stazione Lago dei Teneri; CZ=stazione Ca Zane; P-E(1)=stagione calda, Primavera-Estate; A-I(2)=stagione fredda, Autunno-Inverno). Svu CCA variable scores Spring Pfl Tlu Spa Gni BA Pma Een Canal_dist Seainlet_dist Lsa BC Pca Kpa S Bbo Lmo Sau Ssp Psa Sro Cau Dla Srh Hgu Mme F Bbe Gaf Lra Mce SparJ Sum Msu Spi Symp1 Cla Lau SimAla Evi DanSac Gco Dsa Cri Hhi Dpu Symp2 Pte Abo Ste Sta Apfa Pmi T Summer Autumn Zop Nop Sab Sal Sty P Axis 1 Vector scaling: 1.36 Fig. 6 Diagramma CCA della distribuzione delle specie ittiche (punti; per la definizione dei codici specie vedi Tab. 1) campionate con tratta nella laguna di Venezia in relazione alle variabili ambientali (vettori: T=temperatura; Sal=salinità; P=prateria di fanerogame; BA=habitat non vegetato, fangoso, in zona aperta; BC=habitat non vegetato, fangoso, in ghebo; S=habitat non vegetato, sabbioso; F=habitat con presenza di fanerogame a chiazze; Spring=Primavera; Summer=Estate; Autumn=Autunno; Canal_dist=distanza dal canale principale più vicino; Seainlet_dist=distanza dalla bocca di porto più vicina).

46 (a) Mean Mean±0.95 Conf. Interval Mean Mean±0.95 Conf. Interval (b) 400 BC P BA F S 400 P BC BA F S Abbondanza totale (n. individui) BA BC F P S HABITAT F P BC S BA Biomassa totale (grammi) Mean BA BC F P S HABITAT Mean±0.95 Conf. Interval (c) indice di Shannon-Wiener H' BA BC F P S HABITAT Fig. 7 Variazione di (a) abbondanza totale, (b) biomassa totale e (c) indice di diversità di Shannon-Wiener tra le tipologie di habitat individuate nei bassi fondali lagunari (le differenze tra habitats sono evidenziate mediante la notazione delle common underbars ).

47 (a) Mean BC P BA F S Mean±0.95 Conf. Interval Mean (b) Mean±0.95 Conf. Interval BA BC S P F Abbondanza di ER Abbondanza di MS BA BC F P S HABITAT 8 Mean Mean±0.95 Conf. Interval 6 (c) P S F BA BC BA BC F P S HABITAT BC BA F S P F BA BC S P BA BC F P S BA BC F P S Abbondanza di MA BA BC F P S HABITAT Fig. 8 Variazione dell abbondanza dei gruppi ecologici principali tra le tipologie di habitat individuate nei bassi fondali lagunari: (a) ER=residenti; (b) MS=migratori stagionali; (c) MA=marini occasionali; (d) MJ=migratori giovanili (per ragioni di chiarezza del grafico il dato di abbondanza dei MJ è stato riportato nella forma log-trasformata). Le differenze tra habitats sono evidenziate mediante la notazione delle common underbars. Abbondanza di MJ (log-transformed) Primavera BA F S P BC BA BC F P S Autunno (d) Mean Estate Mean±0.95 Conf. Interval

48 48 Prima vera Estate no Autun Fig. 9 - Mappatura dell abbondanza ittica totale stagionale nella laguna di Venezia.

49 49 Prima vera Estate no Autun Fig Mappatura del numero di specie stagionale nella laguna di Venezia.

50 50 Prima vera Estate no Autun Fig Mappatura dell indice di Shannon stagionale nella laguna di Venezia.

51 3.2.7 Pubblicazioni prodotte Mainardi, D., Fiorin, R., Franco, A., Franzoi, P., Giovanardi, O., Granzotto, A., Libertini, A., Malavasi, S., Pranovi, F., Riccato, F. and Torricelli, P., Fish diversity in the Venice lagoon: preliminary report. In Scientific research and safeguarding of Venice, Corila Research: Program 2001 results (P. Campostrini, ed.). Istituto Veneto di Scienze, Lettere ed Arti, and Corila, Venezia: Mainardi, D., Fiorin, R., Franco, A., Franzoi, P., Granzotto, A., Malavasi, S., Pranovi, F., Riccato, F., Zucchetta, M. and Torricelli, P., Linea 3.6: lo studio della biodiversità per un equilibrio fra conservazione e sfruttamento in laguna di Venezia: analisi delle comunità ittiche. Research Programme , Second annual workshop, Venezia, Italy, 31 March -2 April Abstract p Malavasi, S., Fiorin, R., Franco, A., Franzoi, P., Granzotto, A., Riccato, F. and Mainardi, D.. Fish assemblages of Venice Lagoon shallow waters: an analysis based on species, families and functional guilds. J. Mar. Systems Submitted Mainardi, D., Fiorin, R., Franco, A., Franzoi, P., Granzotto, A., Malavasi, S., Pranovi, F, Riccato, F., Zucchetta, M. and Torricelli, P. Seasonal distribution of fish fauna in the Venice Lagoon shallow waters: preliminary results. In Scientific research and safeguarding of Venice, Corila Research: Program 2002 results (P. Campostrini, ed.). Istituto Veneto di Scienze, Lettere ed Arti, and Corila, Venezia, IN PRESS. Fortibuoni T., 2003/2004. Approccio funzionale allo studio della comunità ittica in laguna di Venezia. Tesi di Laurea in Scienze Ambientali, Università Ca Foscari di Venezia (Relatore P. Torricelli). Franco, A., Franzoi, P., Malavasi, S., Riccato, F. and Torricelli, P. Fish assemblages in different shallow water habitats of the Venice Lagoon. Hydrobiologia Submitted Bibliografia di riferimento Beck M.W., Heck K.L., Able K.V., Childers D.L., The identification, conservation, and management of estuarine and marine nurseries for fishes and invertebrates. BioScience, 51, Heck K.L., Nadeau D.A. and Thomas R., The nursery role of seagrass beds. Gulf Mex. Sci., 1, Jongman R.H.G., Ter Braak C.J.F. and Van Tongeren O.F.R., Data analysis in community and landscape ecology. Cambridge University Press, UK. Orth R.J. and van Montfrans J., Utilization of a segrass meadow and tidal marsh creek by blue crabs, Callinectes sapidus: seasonal and annual variations in abundance with emphasis on post-settlement juveniles. Mar. Ecol. Progr. Ser., 41, Rismondo A., Curiel D., Scarton F., Mion D. and Caniglia G., A new seagrass map for the Venice Lagoon, in Proceedings of the Six International Conference on the Meditearranean Coastal Environment, MEDCOAST 03, 7-11 October 2003, Ravenna, Italy, by Őzhan E. (ed.), MEDCOAST, Middle East Technical University, Ankara, Turkey, vol. 2,

52 3.3 Argomento 2 (Le guilds a Singnatidi e Gobidi) Composizione unità operativa Elenco di ricercatori e tecnici Cognome nome Istituto di appartenenza Mainardi Danilo DSA, Università di Venezia Torricelli Patrizia DSA, Università di Venezia Franzoi Piero DSA, Università di Venezia Elenco di studenti (tesi, PhD, ecc.) Cognome nome Istituto di appartenenza Malavasi Stefano DSA, Università di Venezia Franco Anita DSA, Università di Venezia Fiorin Riccardo DSA, Università di Venezia Riccato Federico DSA, Università di Venezia Obiettivi L obiettivo di questo argomento è comprendere i meccanismi, interni alla comunità, di ripartizione delle risorse tra specie simili che vivono in condizioni di simpatria. Tali meccanismi sono quelli che consentono la coesistenza delle specie nell ambiente lagunare e che quindi sono alla base del mantenimento della biodiversità in laguna. Per realizzare questo obiettivo si sono studiate in particolare due famiglie di Teleostei, i Singnatidi e i Gobidi. Entrambe queste famiglie sono costituite da specie molto simili dal punto di vista morfologico e di certi adattamenti ecologici all ambiente lagunare (comparto bentonico per i Gobidi; prateria di fanerogame per i Singnatidi). La diversità specifica all interno di queste famiglie è piuttosto alta (9 sono le specie lagunari di Gobidi e 7 quelle di Singnatidi), e ciò è probabilmente indice dell evolversi di meccanismi e fini adattamenti che permettono la differenziazione delle nicchie di queste specie e la loro coesistenza negli habitat lagunari. La famiglia dei Gobidi, inoltre, è fortemente rappresentata in laguna: circa il 50% degli individui campionati con le reti da circuizione era costituito da specie appartenenti a questa famiglia (vedi Argomento 1). La famiglia dei Singnatidi è anch essa rappresentata nella comunità ittica lagunare, soprattutto in ambienti vegetati (praterie di fanerogame), loro habitat elettivo, a cui queste specie sono fortemente adattate sia sotto l aspetto morfologico che comportamentale. All interno di ognuna di queste due famiglie è stata studiata la ripartizione delle risorse trofiche tra le specie. Per quanto riguarda i Gobidi, poi, è stata approfondita anche la segregazione spaziale tra gli habitat della laguna delle diverse specie. In entrambe le famigliè è stata considerata anche la riproduzione come uno degli assi principali che definiscono la nicchia di una specie e sono stati quindi confrontati alcuni aspetti della biologia riproduttiva tra le specie considerate Attività preliminari Una prima fase del lavoro è consistita nel reperimento di tutte le informazioni bibliografiche relative alle life-histories di 7 specie di Gobidi (Gobius cobitis, G. niger, Zosterisessor ophiocephalus, Pomatoschistus marmoratus, P. minutus, P. canestrinii, Knipowitschia panizzae) e di 3 specie di Singnatidi (Syngnathus abaster, S. typhle, Nerophis ophidion), che rappresentano le specie di queste due famiglie più frequenti e abbondanti in laguna Attività in campo ed in laboratorio I campioni di Gobidi sono stati acquisiti nelle stazioni e con i metodi di campionamento descritti nella sezione dell Argomento 1. Lo studio della guild a Singnatidi si è concentrato sulle tre specie più abbondanti in Laguna di Venezia: S. abaster. S. typhle e N. ophidion. Gli esemplari studiati provengono dai campionamenti effettuati con la tratta da pesce novello (vedi Argomento 1) in una stazione di prateria a fanerogame, situata nel bacino Nord della laguna di

53 Venezia. La stazione era localizzata in prossimità del canale di porto di Lido (45 26'050 N, 12 23'560 E) ed era caratterizzata da una prateria costituita soprattutto da Cymodocea nodosa. Lo strumento e le modalità di campionamento e di trattamento dei campioni sono quelle descritte nella sezione In questa stazione lo sforzo di campionamento è stato intensificato, fino a raggiungere una cadenza mensile. I campioni di Singnatidi e Gobidi sono stati conservati in formalina (soluzione al 10%) e quindi processati nei laboratori del Dipartimento di Scienze Ambientali presso la sede della Celestia. Una prima fase del lavoro svolto in laboratorio è stata l identificazione accurata delle specie. Ciò ha richiesto spesso molto tempo e la consultazioni di numerose chiavi di identificazione, soprattutto per le specie di gobidi di piccole dimensioni. Studio della segregazione spaziale La segregazione spaziale è stata indagata per le 7 specie di Gobidi (G. cobitis, G. niger, Z. ophiocephalus, P. marmoratus, P. minututs, P. canestrinii e K. panizzae) e le 8 specie di Singnatidi (S. abaster, S. typhle, S. acus, S. taenionotus, S. tenuirostris, N. ophidion, H. hippocampus e H. guttulatus) campionate in laguna con la tratta. I dati utilizzati per effettuare questa analisi sono stati quelli di abbondanza specifica nelle stazioni campionate con la rete da circuizione (vedi Argomento 1). Utilizzo e ripartizione della risorsa cibo L utilizzo e la ripartizione delle risorse trofiche sono stati indagati mediante l analisi dei contenuti gastrici in campioni di individui delle specie studiate di entrambe le famiglie (Singnatidi e Gobidi). Per quanto riguarda le specie della famiglia dei Gobidi, l analisi della dieta è stata condotta per le 4 specie di piccole dimensioni (P. marmoratus, P. minututs, P. canestrinii e K. panizzae), la cui taglia massima non eccede gli 8 centimetri, unita all analisi delle abitudini alimentari di G. niger e Z. ophiocephalus, specie di taglia superiore che possono raggiungere e oltrepassare i 20 centimetri di lunghezza. L analisi è stata condotta su un totale di circa 280 individui provenienti dal campionamento con la tratta. In particolare, sono stati analizzati i campioni provenienti dalle stazioni nei bacini centrale e settentrionale della laguna di Venezia. Poiché il campione ottenuto per la specie G. niger non è stato sufficiente per avere un dato statisticamente valido (pochi individui catturati e spesso con stomaci vuoti), questa specie non è stata inclusa nell analisi della dieta. Per ovviare a tale problema si è scelto di richiedere una proroga della ricerca fino a settembre 2004, in modo tale da poter effettuare campionamenti integrativi di questa specie. L osservazione dei contenuti gastrici nelle specie di entrambe le famiglie, per l identificazione ed il conteggio delle prede individuali, è stata effettuata allo stereomicroscopio (da 8 a 40 ingrandimenti). Gli items alimentari presenti nello stomaco degli individui sezionati (quelli con una percentuale di riempimento dello stomaco superiore all 80%) sono stati identificati al minor livello tassonomico consentito dallo stato di digestione della preda. Di ogni campione di contenuti stomacali è stata effettuata sia una determinazione qualitativa (metodo della frequenza di comparsa, F) che una duplice valutazione quantitativa (metodo numerico, N, e metodo volumetrico, V) del contributo fornito dai diversi taxa di prede alla composizione della dieta. Limitatamente alle sole specie di Singnatidi, l analisi dei contenuti gastrici è stata associata all analisi di alcuni parametri morfometrici del capo. In tale modo si è cercato di mettere in relazione le differenze nella composizione della dieta, e quindi di strategia alimentare, con le strutture morfologiche coinvolte nell alimentazione. Per ogni specie sono state quindi considerate alcune misure morfometriche del capo (lunghezza del capo, altezza della bocca e del capo, altezza e lunghezza del tratto preorbitale, diametro oculare). Le operazioni di misura sono state effettuate mediante calibro (precisione 0,5mm). Studio della riproduzione Per quanto riguarda i Gobidi, è stata indagata la biologia riproduttiva delle due specie di grandi dimensioni più rappresentate in laguna, Z. ophiocephalus e G. niger. I campioni analizzati sono quelli raccolti mediante i cogolli nelle quattro aree della laguna (vedi Argomento 1) nel periodo primaverile-estivo (periodo riproduttivo delle due specie), integrati 53

54 con i campioni ottenuti con la tratta nelle stazioni situate nei pressi di queste macroaree. Dai campioni di Z. ophiocephalus e G. niger così ottenuti sono state acquisite le principali misure morfometriche (lunghezza totale, peso totale, peso eviscerato, peso delle gonadi) e sono stati estratti gli otoliti per la determinazione dell'età. Per quanto riguarda i Singnatidi, di tutti gli individui campionati mensilmente è stato determinato il sesso e sono state misurate lunghezza standard e lunghezza totale (LT, LS; 1mm). Sono stati considerati maschi tutti gli individui dotati di una tasca (anche come abbozzo), mentre sono stati considerati maschi maturi quegli individui la cui tasca accogliesse, o fosse in grado di accogliere, delle uova. Gli individui privi di tasca e minori in taglia del maschio più piccolo, sono stati considerati sessualmente indifferenziati (giovanili). Gli individui di sesso femminile sono stati classificati in base ad alcuni caratteri di dimorfismo sessuale, tra i quali la lunghezza del tronco, il colore e la prominenza dell addome, e, ovviamente, l assenza della tasca incubatrice. Nei casi dubbi si è comunque proceduto alla dissezione dell animale e ad un analisi delle gonadi al microscopio. Per lo studio dell ecologia riproduttiva, sono stati processati un massimo di 20 individui per sesso per data di campionamento. Per ogni maschio sono stati misurate LT e LS ( 1mm), ed è stato determinato il peso totale (TW; 1mg). E stata quindi calcolata la fecondità marsupiale assoluta, intesa come numero di uova-embrioni presenti all interno della tasca incubatrice. Per quanto riguarda gli individui di sesso femminile, oltre a rilevare le variabili morfometriche (LT, LS, TW), sono stati pesati gli ovari (GW 1mg), per il calcolo dell indice gonadosomatico Elaborazione Studio della segregazione spaziale L utilizzo e la ripartizione della risorsa spaziale sono stati indagati in termini di distribuzione delle specie in relazione una all altra (associazioni interspecifiche), in relazione al tipo di habitat e ad alcuni parametri abiotici caratterizzanti le stazioni campionate. L associazione interspecifica nella distribuzione delle 7 specie di Gobidi e delle 7 specie di Singnatidi in laguna è stata testata per ogni coppia di specie mediante un test del chi-quadro, a partire dall informazione relativa alla presenza-assenza nelle stazioni campionate (riportata in una tabella di contingenza 2x2 sottoforma di numero di stazioni in cui entrambe le specie, nessuna o una delle due occorreva) [Ludwig & Reynolds, 1988]. La tabella di contingenza e la formula per il calcolo del valore del Chi-quadro sono riportate in Fig. 1. Tale test consente di verificare l ipotesi nulla secondo cui le due specie considerate si distribuiscono tra le stazioni indipendentemente l una dall altra. Nel caso il Chi-quadro osservato risulti superiore a quello teorico (3.84, nel caso di df=1 e p<0.05), l ipotesi nulla va rigettata, segno che le due specie considerate occorrono insieme più frequentemente (associazione positiva) o meno frequentemente (associazione negativa) di quanto accadrebbe se fossero indipendenti. Il segno dell associazione è determinato mediante il confronto tra il valore di a osservato e quello atteso nel caso di indipendenza (E(a); Fig. 1). Un informazione sull associazione interspecifica è stata ricavata anche dai dati di abbondanza specifica nelle stazioni, mediante correlazioni non parametriche (Spearman) tra le specie. La distribuzione delle abbondanze delle 14 specie in laguna è stata messa in relazione alla tipologia dell habitat, mediante un analisi della varianza (ANOVA) fattoriale, in cui, assieme al fattore principale Habitat (5 livelli: P, prateria a fanerogame; F, habitat vegetato, con presenza di fanerogame sparse; BA, habitat non vegetato, aperto, con substrato fangoso; BC, habitat non vegetato, in ghebo, con substrato fangoso; S, habitat non vegetato, aperto, con substrato prevalentemente sabbioso), sono stati considerati anche i fattori Sottobacino lagunare (3 livelli: Nord, Centro, Sud) e Stagione (3 livelli: Primavera, Estate, Inverno). In tal modo sono stati individuati gli habitat preferenziali per ogni specie. Nel caso dei Gobidi, la similarità/differenza tra le specie in termini di utilizzo dell habitat è stata poi quantificata mediante l indice di Morisita, che misura il grado di sovrapposizione nell utilizzo della risorsa, in questo caso l habitat [Krebs, 1999]. La distribuzione delle abbondanze delle 7 specie di gobidi in relazione ai parametri abiotici è stata studiata mediante delle correlazioni non parametriche (Spearman). I fattori abiotici considerati 54

55 per ogni stazione sono quelli riportati nell Argomento 1 (temperatura dell acqua (T, C) e salinità (Sal, PSU), misurate durante il campionamento della comunità ittica; distanza della stazione dal canale principale più vicino (cd, m) e dalla bocca di porto più vicina (sd, m), misurate attraverso la mappatura GIS delle stazioni di campionamento). Le specie di gobidi, sulla base della loro abbondanza e dei parametri abiotici nelle stazioni di campionamento, sono state ordinate mediante analisi canonica delle corrispondenze (CCA). Questa tecnica di ordinamento consente di evidenziare l importanza dei singoli fattori ambientali nell influenzare la distribuzione delle specie tra le stazioni. Inoltre, questa tecnica consente di considerare contemporaneamente fattori ambientali che siano quantitativi, semi-quantitativi e qualitativi. Per questo motivo, nell analisi sono stati inclusi, oltre ai fattori abiotici sopra riportati, fattori qualitativi quali gli habitat e le stagioni di campionamento (come presenza-assenza delle specie). specie B presente assente presente a b m=a+b specie A assente c d n=c+d r=a+c s=b+d N=a+b+c+d χ 2 = E( a) Fig. 1 Tabella di contingenza e formule del Chi-quadro e della frequenza attesa di co-occorrenza, per il test sulla associazione interspecifica nella distribuzione di due specie. Utilizzo e ripartizione della risorsa cibo La frequenza di comparsa di ogni item alimentare negli stomaci dei campioni di individui per ogni specie è stata misurata (%F). L importanza di ogni item alimentare nella composizione della dieta di ogni specie è stata quantificata mediante il calcolo dell indice di importanza relativa (IRI=(%V+%N)x%F), percentualizzato poi rispetto alla totalità delle prede (IRI%) [Barry et al., 1996]. Istogrammi riportanti gli IRI% di ogni item alimentare nelle diete specifiche hanno quindi consentito di visualizzare la composizione quantitativa della dieta delle diverse specie. Per quanto riguarda la famiglia dei Gobidi, sulla base del dato di IRI% sono stati costruiti dei diagrammi MDS (Multi Dimensional Scaling) che consentissero di ordinare le diverse specie in base alla loro dieta (pacchetto PRIMER 5.0). La composizione della dieta è stata analizzata con due finalità: capire come la dieta si differenzi tra le specie diverse presenti nello stesso habitat e come essa si diversifichi nella medesima specie tra habitats diversi. Per raggiungere il primo scopo sono stati considerati individui appartenenti a tutte le specie indagate, di taglia confrontabile (tutti gli individui delle specie appartenenti ai generi Pomatoschistus e Knipowitschia e gli individui giovanili della specie Z. ophiocephalus), e campionati nello stesso habitat (aree di gronda lagunare, ambienti privi di vegetazione). Per studiare la variazione della dieta tra habitats diversi, ci si è invece concentrati su una singola specie, Z. ophiocephalus, presente e relativamente abbondante in tutti gli habitats lagunari (vedi Argomento 1). Per Z. ophiocephalus la dieta è stata confrontata anche tra individui di età diverse. L età degli individui è stata determinata mediante la lettura degli otoliti. Le differenze nella dieta tra habitats e tra età diverse sono state testate quantitativamente attraverso l analisi della similarità (ANOSIM) e qualitativamente mediante la procedura SIMPER (pacchetto PRIMER 5.0). Per quanto riguarda le specie di Singnatidi, S. abaster, S. typhle e N. ophidion, l analisi della dieta delle tre specie di pesci ago è stata condotta su campioni mensili di 5-15 esemplari per specie. Per mettere in evidenza eventuali differenze nella composizione della dieta delle tre specie è stata calcolata la matrice di similarità di Bray-Curtis sulla matrice dei dati trasformati ( x). Su questa base, è stata poi effettuata l Analisi dei Cluster (pacchetto PRIMER 5.0). E stata inoltre condotta un analisi morfometrica su esemplari delle tre specie di pesci ago; le misure utilizzate riguardavano la morfologia del capo, del muso e della bocca. Infatti, nei pesci ago le abitudini alimentari delle diverse specie sono state messe in relazione sia con la forma e lunghezza del muso, sia con N ad bc N 2 rm N mnrs 2 55

56 l ampiezza dell apertura boccale [Muller & Osse, 1984; Ryer, 1988; Franzoi et al., 1993; Kendrick, 2002]. Le misure morfometriche sono state effettuate, per ognuna delle tre specie, su un campione di 30 esemplari le cui lunghezze erano confrontabili a quelle degli individui utilizzati per l analisi della dieta. Con un calibro ( 0,1 mm), su ogni individuo sono state prese le seguenti sei misure: lunghezza del capo; lunghezza del muso; altezza del capo; altezza del muso; altezza della bocca; diametro oculare. L analisi multivariata è stata effettuata sui dati trasformati (log x) e standardizzati (PRIMER 5,0 Package). Il confronto morfologico tra le tre specie è stato effettuato mediante l Analisi delle Componenti Principali (PCA). Per valutare la significatività delle differenze morfologiche tra le specie, è stata applicata la procedura ANOSIM alla matrice delle distanze Euclidee calcolata sulla base delle variabili morfologiche normalizzate (PRIMER 5,0 Package). Studio della riproduzione Per tutte le specie indagate, l'indice gonadosomatico è stato calcolato con la formula GSI=peso delle gonadi/peso totale x100, come indice percentuale di investimento in materiale gonadico per la riproduzione. Nel caso particolare dei maschi appartenenti alla famiglia dei Singnatidi è stato considerato un ulteriore indice di investimento riproduttivo, dato dalla fecondità marsupiale (numero di uova o embrioni per tasca incubatrice). L'andamento temporale di questi indici di investimento gonadico è stato osservato nei due sessi delle specie esaminate, e in entrambi i sessi è stato studiata la relazione tra GSI, taglia ed età degli individui Risultati ottenuti Gobidi Studio della segregazione spaziale I risultati del test del Chi-quadro per l associazione interspecifica hanno mostrato la presenza di associazioni positive tra due specie di grandi gobidi (G. niger e Z. ophiocephalus) e anche tra le specie dei piccoli gobidi (Tab. 1a). Al contrario, associazioni negative sono state riscontrate tra G. niger e K. panizzae, P. canestrinii e P. marmoratus e tra quest ultima specie e Z. ophiocephalus. Risultati analoghi si sono ottenuti dalle correlazioni tra le abbondanze delle specie (Tab. 1b). Questa tendenza alla segregazione spaziale nella distribuzione in laguna tra le specie di grandi dimensioni (principalmente G. niger e Z. ophiocephalus) e quelle di piccole dimensioni si traduce in un diverso utilizzo della risorsa habitat. Infatti, come evidenziato dall analisi della varianza sulle abbondanze delle specie di gobidi tra gli habitats, G. niger e Z. ophiocephalus, pur essendo presenti in tutti gli habitats, si trovano con abbondanze significativamente più elevate in quelli vegetati, come le praterie di fanerogame (P) e, per G. niger, anche le zone con fanerogame sparse (F) (Fig. 2). Al contrario, K. panizzae e P. marmoratus hanno mostrato una preferenza per gli habitats non vegetati (BA, BC per K. panizzae; BA, BC e S per P. marmoratus) (Fig. 2), mentre le altre specie non hanno mostrato differenze significative, probabilmente per la loro bassa numerosità in laguna. Nonostante ciò, si è potuto osservare un forte legame di P. canestrinii con gli habitats non vegetati a substrato fangoso, BA e BC, essendo la specie presente esclusivamente in questa tipologia di habitat. L indice di Morisita ha confermato la forte sovrapposizione nell utilizzo dell habitat tra Z. ophiocephalus e G. niger e tra le specie di piccoli gobidi (Tab. 2). La segregazione spaziale tra grandi e piccoli gobidi in laguna e la coesistenza tra le specie all interno di questi due gruppi si manifesta anche quando la risorsa spaziale venga considerata in termini di caratteristiche abiotiche dell ambiente, come evidenziato dai risultati dell analisi canonica delle corrispondenze (Tab. 3 e Fig. 3) e dalle correlazioni tra le abbondanze specifiche e i fattori abiotici nelle stazioni (Tab. 4). L analisi canonica delle corrispondenze (CCA) ha evidenziato come i parametri ambientali considerati (quantitativi e qualitativi) spieghino circa il 50% della variabilità nella distribuzione tra le specie di gobidi in laguna (Tab. 3). In Fig. 3 è riportato anche il diagramma relativo ai primi 2 assi, che spiegano il 74% della variabilità specifica determinata da tutti e 6 gli assi costruiti dalla CCA. Le specie Z. ophiocephalus (Zop) e G. niger (Gni) mostrano una tendenza a separarsi dalle altre nella distribuzione in laguna, legata principalmente all abbondanza di queste 2 specie in habitat vegetati 56

57 (a fanerogame), in cui l influenza del mare è rilevante (vicinanza con le bocche di porto e i canali principali e maggiori salinità), come confermato anche dalle correlazioni delle abbondanze coi parametri abiotici (Tab. 4). Le specie di piccoli gobidi, invece, soprattutto per quanto riguarda P. canestrinii e K. panizzae, sono fortemente legate alle zone più interne (maggior distanza dalle bocche di porto) e confinate (maggior distanza dai canali profondi e minor salinità) della laguna, dove l habitat è prevalentemente non vegetato, a substrato fangoso (BA e BC) e dove l influenza marina è ridotta, come risulta anche dalle correlazioni negative fortemente significative tra le abbondanze specifiche e la salinità. Un fattore comune a grandi e piccoli gobidi sembra essere la tendenza a correlazioni positive dell abbondanza con la temperatura (Tab. 4). Questa relazione è indice di una fluttuazione stagionale, più che di una distribuzione spaziale, legata alla riproduzione primaverile-estiva di tutte le specie di gobidi e quindi al picco di abbondanze estivo dovuto al reclutamento, in corrispondenza del massimo termico annuale. L analisi canonica delle corrispondenze ha permesso anche di evidenziare come, tra tutti i fattori ambientali considerati (parametri chimico-fisci, habitats, stagioni ; i vettori nel diagramma in Fig. 3), i più importanti (vettori più lunghi) nell influenzare la distribuzione delle specie di gobidi campionate in laguna siano quelli che definiscono la complessità dell habitat, quali la presenza delle fanerogame (vettore P) e gli habitat di barena (ghebi; vettore BC). La strutturazione fisica dell habitat, quindi, che sia verticale (come nel caso delle fanerogame) o orizzontale (come nei ghebi, data dalla molteplicità di microhabitats disponibili), garantendo la diversità ambientale e quindi delle nicchie ecologiche disponibili, sembra essere il fattore principale nel guidare la distribuzione delle specie in laguna, probabilmente perché in questo ambiente non vi sono condizioni limitanti relativamente agli altri parametri. 57 a) Gco Zop Gni Kpa Pca Pmi Zop ns Gni ns + Kpa ns ns - Pca ns ns - + Pmi ns ns ns + ns Pma ns - ns b) Gco Zop Gni Kpa Pca Pmi Zop + Gni ns +++ Kpa ns ns - Pca ns ns Pmi ns ns ns ++ ns Pma ns Tab. 1 Gobidi: risultati del test di associazione interspecifica: a) test del Chi-quadro; b) correlazioni di Spearman tra le abbondanze specifiche (+ -, p<0.05; ++ --, p<0.01; , p<0.001; ns, non significativo).

58 58 Z. ophiocephalus G. niger Bac. Nord Mean Mean±0.95 Conf. Interval ** Mean Mean±0.95 Conf. Interval * n. individui/mq BA BC F P S K. panizzae P. marmoratus n. individui/mq ** Primavera Mean Mean±0.95 Conf. Interval n. individui/mq n. individui/mq BA BC F P S Mean Mean±0.95 Conf. Interval **BA S BC F P BA BC F P S 0.0 BA BC F P S Fig. 2 Gobidi: abbondanze specifiche (n. individui m -2 ) negli habitats campionati (*, p<0.05; **, p<0.01) Gco Zop Gni Kpa Pca Pmi Zop 0.34 Gni Kpa Pca Pmi Pma Tab. 2 Gobidi: indice di Morisita per la sovrapposizione nell utilizzo della risorsa habitat Axis 1 Axis 2 Axis 3 Axis 4 Axis 5 Axis 6 Eigenvalues Percentage Cum. Percentage Cum.Constr.Percentage Tab. 3 Gobidi: risultati dell analisi canonica delle corrispondenze

59 Axis 2 CCA variable scores 59 BA S Pmi Pma F Spring Gco Sal Gni Canal_dist Kpa Autumn TSummer P Zop Seainlet_dist Pca BC Axis 1 Vector scaling: 1.83 Fig. 3 Gobidi: diagramma CCA della distribuzione delle specie di gobidi (punti; per la definizione dei codici specie vedi Tab. 1 dell Argomento 1) campionate con tratta nella laguna di Venezia in relazione alle variabili ambientali (vettori: T=temperatura; Sal=salinità; P=prateria di fanerogame; BA=habitat non vegetato, fangoso, in zona aperta; BC=habitat non vegetato, fangoso, in ghebo; S=habitat non vegetato, sabbioso; F=habitat con presenza di fanerogame a chiazze; Spring=Primavera; Summer=Estate; Autumn=Autunno; Canal_dist=distanza dal canale principale più vicino; Seainlet_dist=distanza dalla bocca di porto più vicina). T Sal cd sd Gco ns ns -- - Zop +++ ns ns --- Gni ns Kpa ns Pca Pmi ns ns Pma Tab. 4 Gobidi: correlazioni (Spearman) tra abbondanze specifiche (per la definizione dei codici specie vedi Tab. 1 dell Argomento 1) e parametri abiotici (T=temperatura; Sal=salinità; cd=distanza dal canale principale più vicino; sd=distanza dalla bocca di porto più vicina) (+ -, p<0.05; ++ --, p<0.01; , p<0.001; ns, non significativo). Utilizzo e ripartizione della risorsa cibo La composizione quantitativa della dieta delle diverse specie di Gobidi coesistenti nell habitat non vegetato è riportata in Fig. 4. Le specie appartenenti al genere Pomatoschistus mostrano un comportamento alimentare simile, predando prevalentemente piccoli crostacei bentonici come anfipodi del genere Corophium e organismi iperbentonici come i Misidacei, anche se le proporzioni relative risultano assai diverse. P. marmoratus si differenzia dai congenerici per l abitudine di predare in modo consistente anche su copepodi Arpacticoidi e per l assenza di organismi dell infauna (Anellidi) nella dieta. P. minutus, specie migratrice che utilizza i fondali lagunari per accrescersi prima del ritorno invernale al mare, si nutre anche di prede di maggiori dimensioni, quali i decapodi natanti appartenenti al genere Crangon. Ciò è probabilmente legato alle relativamente maggiori dimensioni corporee della specie P. minutus rispetto alle altre congeneriche. La dieta della specie K. panizzae è dominata anch essa dagli anfipodi del genere Corophium, come negli altri piccoli gobidi, ma, a differenza da questi ultimi, in essa un ruolo importante è rivestito dagli Arpacticoidi fitali. La presenza quantitativamente importante di queste prede nella dieta di K. panizzae è indice di un particolare

60 legame della specie con habitat in cui vi sia presente vegetazione algale e sembrerebbe confermare quanto riportato in letteratura [Maccagnani et al., 1985]. La dieta degli esemplari giovanili del gobide Z. ophiocephalus è risultata differente da quella dei piccoli gobidi; nonostante gli individui di Z. ophiocephalus analizzati provenissero dalle medesime aree di campionamento e fossero caratterizzati da analoghe dimensioni corporee. Nei giovanili di questa specie, infatti, una buona parte della dieta è costituita da organismi dell infauna (Anellidi) e da Anfipodi di specie diverse da Corophium. Inoltre, tra le 5 specie analizzate, di taglia confrontabile, Z. ophiocephalus è l unica a presentare pesci Teleostei nella dieta. Queste differenze riscontrate possono essere messe in relazione ad una diversa strategia alimentare della specie, anche nelle forme giovani, e alla grande mobilità che la caratterizza. Le differenze nella dieta tra le specie sono evidenti anche nel grafico MDS riportato in Fig. 5. Differenti considerazione sono state fatte per gli individui di maggiori dimensioni di Z. ophiocephalus. Per essi è stata indagata la differenza in dieta tra habitats diversi ed è stato possibile anche osservare la variazione ontogenetica nella composizione della dieta. Z. ophiocephalus mostra, nel complesso, una dieta da carnivoro generalista, nella quale risultano abbondanti Crostacei (Anfipodi, Misidacei, Decapodi e Isopodi), Pesci e Policheti. L analisi della composizione della dieta di Z. ophiocephalus mediante ANOSIM ha evidenziato una significativa variazione ontiogenetica (R=0.507, p<0.01). Gli individui di età superiore a 1 anno (age class >1+) presentano una dieta significativamente diversa da quelli di età inferiore (age classes 0+ and 1+) (R=0.740 and R=0.469, respectively; p<0.05) (Fig. 6a). L analisi mediante SIMPER ha evidenziato che questa differenza è legata alla presenza, nella dieta degli individui più grandi, di Callianassidi (assenti nella dieta degli individui più giovani), Gobidi e Portunidi (assenti negli individui di età inferiore all anno), e Palaemonidi (Fig. 6b). La dieta degli individui più piccoli (age class 0+), invece, è caratterizzata principalmente da Anfipodi, mentre quella di individui di 1 anno di età (age class 1+) da Arpacticoidi (assenti negli individui di età superiore), Misidacei e Nudibranchi (assenti negli individui di età inferiore) (Fig. 6b). La differenza osservata nella dieta delle diverse classi d età evidenzia il cambiamento ontogenetico delle preferenze alimentari di Z. ophiocephalus che riflette la maggiore abilità degli individui di età e taglia maggiore nel catturare prede di maggiori dimensioni. Al contrario le differenze spaziali (tra habitats) e temporali (tra stagioni) non sono risultate significative. L assenza di una variazione spaziale della dieta di Z. ophiocephalus in laguna di Venezia potrebbe essere spiegata sia dall elevata eterogeneità ambientale in questo ambiente che dalla mobilità della specie tra habitats diversi, che porterebbero quindi ad un integrazione dell alimentazione tra i diversi habitats % Altro 90% 80% Teleostei 70% Chironomidae 60% 50% 40% 30% 20% Harpacticoida Not. Id. Amphipoda Not. Id. Corophium sp. 10% Misidacei 0% K. panizzae Z. ophiocephalus P. marmoratus P. canstrinii P. minutus Crangon sp. Anellidae Fig. 4 Gobidi: contributo (IRI% medio) delle diverse categorie alimentari alle diete delle 5 specie di Gobidi.

61 61 Stress: 0,17 K. panizzae K Z. ophiocephalus Z P. canestrinii C P. marmoratus Ma P. minutus Mi Fig. 5 Gobidi: ordinamento multidimensionale (MDS) dei campioni categorizzati per specie. a) Age class: b) S1 1+ >1+ U1 S % S1 U1 U1 S2 80% A mphipo da n.i. Harpactico ida P o rtunidae Go biidae other M ysidacea P alaemo nidae Nudibranchia Callianassidae S2 U2 U2 S2 60% 40% 20% U2 Stress % >1+ Fig. 6 Gobidi: a) MDS dei campioni categorizzati per classe di età, e codificati per habitat (S=vegetato, U=non vegetato) e stagione (1=primavera, 2=estate); b) Contributo in IRI% delle diverse categorie trofiche alla dieta delle tre classi di età. Studio della riproduzione L'andamento temporale dell'indice gonadosomatico in Z. ophiocephalus evidenzia un incremento dell'investimento riproduttivo in corrispondenza dei mesi di marzo e aprile, in cui avviene la riproduzione di questa specie (Fig. 7). Tale investimento si diversifica notevolmente tra i due sessi. Nelle femmine, infatti, il GSI raggiunge il valore massimo a marzo (media 19.0%, 5.9 S.D.), ad aprile assume valori attorno al 14.2 % ( 10.4 S.D.), e nei mesi successivi subisce un forte decremento fino a stabilizzarsi attorno a valori compresi tra 0.5% e 1%, che vengono mantenuti per tutto il periodo autunnale e invernale. Nei maschi il GSI raggiunge un picco massimo di 3.7% ( 1.8 S.D.) in aprile, per poi assestarsi su valori tra lo 0 e l'1%. L'andamento temporale dell'indice gonadosomatico in G. niger evidenzia un incremento dell'investimento riproduttivo in corrispondenza dei mesi di maggio-giugno, in cui avviene la riproduzione di questa specie (Fig. 7). Anche in G. niger si osserva una forte differenza tra i sessi per quanto riguarda l'investimento riproduttivo. Infatti il picco massimo di GSI, osservato a maggio

62 in entrambe i sessi, raggiunge valori medi di 10.8% ( 6.7 S.D.) nelle femmine e solo di 1.3% ( 0.9 S.D.) nei maschi. In questa specie il GSI non decresce rapidamente dopo il picco riproduttivo, come in Z. ophiocephalus, ma nel mese successivo mantiene valori ancora relativamente elevati (circa 6% nelle femmine e circa 1% nei maschi), mentre da settembre si assesta attorno allo 0-0.5%. La relazione tra GSI e TL ha evidenziato tra i maschi riproduttori di entrambe le specie nel momento di massimo investimento riproduttivo (aprile per Z. ophiocephalus, maggio per G. niger) la presenza di maschi di piccola taglia (TL<12cm in Z. ophiocephalus e TL<8cm in G. niger) con elevati indici gonadosomatici (2-3 volte superiori rispetto a quelli dei maschi più grandi). Mentre però questi maschi piccoli sono tutti giovani (di età 0+, cioè al termine del loro primo anno di vita, e quindi alla loro prima stagione riproduttiva) per G. niger, per Z. ophiocephalus l'età di questi piccoli è variabile (tra 0+ e 2 anni di età). I maschi piccoli con elevati investimenti a livello di gonadi sono stati riconosciuti in entrambe le specie come maschi sneaker [Torricelli et al., 2000; Mazzoldi et al., 2000; Rasotto & Mazzoldi, 2002]. Essi, sfavoriti nella competizione con i maschi grandi per le risorse riproduttive (territorio, nido,...), adottano infatti tattiche alternative di riproduzione, assumendo un comportamento di tipo 'parassita'. Per quanto riguarda le femmine, nei mesi principali della riproduzione si è osservata per entrambe le specie la presenza tra gli esemplari maturi (che in Z. ophiocephalus sembrano avere GSI>10%, mentre in G. niger >6%) di femmine piccole sia per taglia che per età (0+). Ciò sembrerebbe denotare una precocità riproduttiva di queste specie in laguna di Venezia. L'età di raggiungimento della maturità sessuale riportata per queste specie è infatti 2-3 anni [Miller, 1986; Gandolfi et al., 1991] Mar Apr Mag Giu Set Ott Nov Dic Feb -1 Mar Apr Mag Giu Set Ott Nov Dic Feb Mar Apr Mag Giu Set Ott Nov Dic Feb Mar Apr Mag Giu Set Ott Nov Dic Feb Fig. 7 Gobidi: trend temporali di indice gonadosomatico (%)in maschi ( ) e femmine ( ) di Z. ophiocephalus (sinistra) e G. niger (destra). Le due specie di Gobidi esaminate condividono alcune caratteristiche generali della biologia e del comportamento riproduttivo, come la presenza di tattiche alternative maschili e la precocità nella maturazione sessuale. Queste caratteristiche vengono però modulate diversamente, a seconda delle necessità specifiche. Si osserva quindi uno sfasamento tra i due periodi riproduttivi, con Z. ophiocephalus che si riproduce principalmente in marzo-aprile e G. niger in maggio-giugno. Questo sfasamento si riflette anche nel momento della comparsa nella popolazione dei giovanili (reclutamento), che coincide con il mese di ottobre per Z. ophiocephalus e novembre per G. niger. Tale sfasamento potrebbe essere determinato principalmente dal diverso range di tolleranza alla temperatura delle due specie. Mentre, infatti, Z. ophiocephalus è una specie che tollera ampi range di temperatura, G. niger tollera poco le basse temperature (infatti la letteratura riporta migrazioni

63 dai bassi fondali verso acque profonde, di canale o marine, in corrispondenza dei freddi mesi invernali), e quindi, poiché a marzo le temperature nelle zone di basso fondale sono ancora relativamente basse, ciò potrebbe determinare un 'ritardo' della riproduzione di quest'ultima specie. Questo dato è confermato dalla letteratura che riporta stagioni riproduttive anticipate rispetto a quelle sopra descritte (marzo-maggio) in zone mediamente più calde rispetto alla laguna di Venezia, mentre in zone più fredde la riproduzione continua anche nei mesi estivi (maggio-agosto) [Miller, 1986]. Le differenze relative invece all'entità dell'investimento riproduttivo potrebbero essere attribuite alla diversa allocazione energetica nelle due specie e a differenze nel comportamento durante la riproduzione, come descritto precedentemente Singnatidi Studio della segregazione spaziale Sulla base dei dati di abbondanza relativi alle otto specie di Singnatidi catturate durante i campionamenti stagionali con la tratta (vedi Argomento 1, Tab. 1) è stata analizzata la presenza o meno di associazioni interspecifiche tra le specie di questa famiglia; con l ANOVA a tre fattori ( habitat, sottobacino e stagione ) è stata poi indagata la distribuzione spaziale di ognuna delle specie rinvenute nelle diverse tipologie di habitat considerate. II risultati del test del Chi-quadro sulle tabelle di contingenza 2x2 (Tab. 5 A) hanno evidenziato la presenza di associazioni interspecifiche positive tra le abbondanze di quattro delle specie di singnatidi campionate in Laguna di Venezia: Nerophis ophidion e tre specie del genere Syngnathus, S. abaster, S. acus e S. typhle. Inoltre, le abbondanze di Hippocampus guttulatus sono risultate positivamente associate a quelle di S. typhle e N. ophidion; un analoga associazione positiva è infine evidenziabile fra S. taenionotus e S. tenuirostris. Risultati del tutto confrontabili sono stati ottenuti sulla base dell analisi delle correlazioni non parametriche (Tab. 5 B). In questo caso risultano positivamente correlate anche le abbondanze di S. abaster con quelle di Hippocampus hippocampus e H. guttulatus, di S. typhle con H. hippocampus, di S. tenuirostris con S. abaster. Questo pattern di associazione interspecifica riflette quelle che sono le preferenze di habitat delle diverse specie. Delle otto specie di Singnatidi campionate infatti, ben sei (N. ophidion, S. abaster, S. typhle, S. acus, H. guttulatus e H. hippocampus) sono risultate strettamente associate alla vegetazione sommersa, rinvenendosi con le maggiori abbondanze soprattutto nell habitat a prateria (P) (Fig. 8). Questa preferenza per l habitat vegetato risulta confermata dall analisi della varianza (Tab. 6). Nonostante siano evidenziabili delle differenze legate alla stagione e al sottobacino lagunare nella distribuzione delle specie nelle differenti tipologie di habitat, è infatti sempre evidenziabile una preferenza per gli habitat vegetati (P e F) nel caso di N. ophidion, S. abaster, S. typhle, S. acus e H. guttulatus. Soltanto nel caso di S. taenionotus, S. tenuirostris e H. hippocampus, specie rinvenute nei campioni con abbondanze molto basse, non sono risultate differenze significative tra gli habitat. Nel caso di H. hippocampus, c è comunque da tenere presente che i pochi individui campionati sono stati catturati esclusivamente nell habitat a prateria. In definitiva, soltanto S. taenionotus e S. tenuirostris non sono risultati associati ad un habitat particolare, forse ad indicare un comportamento migratorio di queste specie all interno dell ambiente lagunare. 63 a) Sab Sty Nop Sac Sta Ste Hgu b) Sab Sty Nop Sac Sta Ste Hgu Sty + Sty +++ Nop + + Nop Sac Sac Sta ns ns ns ns Sta ns ns ns ns Ste ns ns ns ns + Ste ++ ns ns ns +++ Hgu ns + + ns ns ns Hgu ns ns ns Hhi ns ns ns ns ns ns ns Hhi + ++ ns ns ns ns ns Tab. 5 Singnatidi: risultati del test di associazione interspecifica: a) test del Chi-quadro; b) correlazioni di Spearman tra le abbondanze specifiche (+ -, p<0.05; ++ --, p<0.01; , p<0.001; ns, non significativo).

64 Fig. 8 Singnatidi: abbondanze specifiche negli habitats campionati 64

65 65 S. abaster ANOVA fattoriale df effect MS effect df error MS error F p-level S E-10 H E-29 B SxH SxB HxB SxHxB Differenze tra Habitat ANOVA a 1 df effect MS effect df error MS error F via p-level risultati LSD test S1: E-12 P > F,S > S,BA(BC) S2: E-11 P > F,BA,S > BA,S,BC S3: E-11 P > F > BC,BA,S S. typhle ANOVA fattoriale df effect MS effect df error MS error F p-level S E-07 H E-29 B SxH E-07 SxB HxB SxHxB Differenze tra Habitat ANOVA a 1 df effect MS effect df error MS error F via p-level risultati LSD test S1-N E-04 P > F (BA,BC,S) S1-C P > BC (BA,F,S) S1-S S2-N E-06 P > S,F,BA,BC S2-C E-04 P > F,S,BA(BC) S2-S P > F,BA (S,BC) S3-N E-04 P > F,S (BC,BA) S3-C P,F > F,BC (S,BA) S3-S P,S > S,F (BA,BC) Tab. 6 Singnatidi: risultati dell ANOVA.

66 66 N. ophidion ANOVA fattoriale df effect MS effect df error MS error F p-level S H E-19 B SxH SxB HxB SxHxB Differenze tra Habitat ANOVA a 1 df effect MS effect df error MS error F via p-level risultati LSD test N E-13 P > S,F,BA (BC) C E-04 P > F (S,BC,BA) S E-05 P > F (S,BC,BA) H. guttulatus ANOVA fattoriale df effect MS effect df error MS error F p-level S H B SxH SxB HxB SxHxB Differenze tra Habitat ANOVA a 1 df effect MS effect df error MS error F via p-level risultati LSD test S1-N P > altri habitat (tutti=0) S1-C nessun individuo catturato S1-S nessun individuo catturato S2-N S2-C S2-S nessun individuo catturato S3-N nessun individuo catturato S3-C nessun individuo catturato S3-S nessun individuo catturato Tab. 6 Continua

67 67 S. acus ANOVA fattoriale df effect MS effect df error MS error F p-level risultati LSD test S H P,F > F (BA,BC,S) B SxH SxB HxB SxHxB S. taenionotus ANOVA fattoriale df effect MS effect df error MS error F p-level S H B SxH SxB HxB SxHxB S. tenuirostris ANOVA fattoriale df effect MS effect df error MS error F p-level S H B SxH SxB HxB SxHxB H. hippocampus ANOVA fattoriale df effect MS effect df error MS error F p-level S H B SxH SxB HxB SxHxB Tab. 6 Continua Studio della struttura di popolazione e dell ecologia riproduttiva Al fine di studiare alcuni aspetti dell ecologia riproduttiva e trofica delle tre specie di Singnatidi rinvenute con le maggiori abbondanze in laguna di Venezia (Syngnathus abaster, S. typhle e Nerophis ophidion) sono stati

68 effettuati campionamenti con periodicità almeno mensile in una delle stazioni a prateria individuate nel bacino nord. Da aprile ad ottobre sono state effettuate 11 uscite di campionamento e sono stati complessivamente raccolti più di 2000 esemplari delle tre specie di pesci ago (Fig. 9): 1200 individui di S. typhle, 515 di S. abaster e 306 di N. ophidion. Anche esemplari di S. taenionotus Canestrini, 1871 (n = 8), S. acus Linnaeus, 1758 (n = 6), Hippocampus hippocampus Linnaeus, 1758 (n = 3), H. guttulatus Cuvier, 1829 (n = 3) e Nerophis maculatus Rafinesque, 1810 (n = 1) sono stati rinvenuti durante il ciclo di campionamento. Le maggiori abbondanze sono state riscontrate da giugno a settembre, in concomitanza con il periodo di massimo sviluppo vegetativo delle prateria (Fig. 9). Mentre N. ophidion è stato rinvenuto con abbondanze sostanzialmente confrontabili dalla fine di aprile a tutto settembre, nel caso di S. abaster e S. typhle è evidente un chiaro picco di abbondanza durante il periodo estivo Temperatura N.ophidion S.typhle S.abaster Numero di individui n = Temperatura C /04 26/04 18/05 30/05 14/06 05/07 26/07 14/08 05/09 26/09 29/10 Data di campionamento Fig. 9 Singnatidi: numero di individui catturati da aprile ad ottobre; vengono riportati anche i valori di temperatura dell acqua. Di seguito vengono riportati i risultati dello studio degli aspetti demografici e riproduttivi delle popolazioni, separatamente per le tre specie considerate. Syngnathus abaster Sulla base della distribuzione di frequenza delle lunghezze standard (Fig. 10) è possibile evidenziare la presenza nella popolazione di questa specie di due distinte classi di età: la classe degli adulti (1+) e quella dei nati nell anno (0+). Nel mese di Aprile sono stati campionati esclusivamente individui appartenenti alla classe di età 1+: si trattava di esemplari adulti di taglia compresa tra i 7,5 e i 12,5 cm di LS. Solo a partire dal mese di maggio compaiono nei campioni le nuove reclute, con una lunghezza standard inferiore ai 5,5 cm; assieme alla coorte 0+, continuano ad essere rinvenuti anche individui di età 1+, con taglie comprese tra i 10,5 e i 14 cm di LS. Il reclutamento di nuovi nati è importante durante i mesi di giugno e luglio, diventa trascurabile in agosto e settembre per poi terminare nel mese di ottobre. Da luglio e settembre la popolazione di questo singnatide risulta costituita in grande prevalenza da individui nati nell anno; la classe di età 1+ risulta rappresentata da pochi animali di grandi dimensioni (Fig. 10). Il lungo periodo riproduttivo fa si che siano presenti nella popolazioni sottocoorti di giovani nati in momenti successivi e caratterizzati quindi da lunghezze diverse. In giugno, quando è evidenziabile la comparsa nella popolazione di una nuova moda di nati nell anno, si riscontra la presenza di individui con LS compresa tra 6,5 e 8,5 cm, probabilmente nati in aprile, che risultano

69 già sessualmente differenziati (presenza nei maschi delle tasche incubatrici completamente formate) Aprile; n=29 Maggio; n=66 Giugno; n=90 Luglio; n=176 Agosto; n=44 Settembre; n=92 Ottobre; n=18 Maschi 1+ Femmine 1+ Maschi 0+ Femmine 0+ Giovanili 0 < 2,5 (3 3,5) (4 4,5) (5 5,5) (6 6,5) (7 7,5) (8 8,5) (9 9,5) (10 10,5) (11 11,5) (12 12,5) (13 13,5) (14 14,5) (15 15,5) > 16 Lunghezza standard(cm) Fig. 10 S. abaster: distribuzione di frequenza per taglia (lunghezza standard, SL) degli individui catturati da aprile ad ottobre. Maschi gravidi di S. abaster sono risultati presenti nei campioni da aprile fino a settembre (Fig. 10); il numero medio ( DS) di uova o embrioni per singola tasca incubatrice è stato calcolato separatamente per i maschi delle due classi di età (Fig. 11a). In aprile, i maschi di età 1+ presentavano tasche incubatrici o non ancora completamente sviluppate o soltanto parzialmente riempite di uova. Dal mese di maggio in poi, il numero di embrioni contenuti nelle tasche aumenta costantemente fino a raggiungere il valore massimo nel mese di luglio, per poi decrescere fino ad un minimo in settembre. Maschi precoci (età 0+) con una tasca incubatrice funzionale sono stati rinvenuti nei campioni a partire da giugno. Il numero relativamente basso di embrioni presenti nelle tasche di questi maschi è probabilmente riconducibile alle loro minori dimensioni corporee, se confrontati con i maschi di età 1+. La fecondità marsupiale dei maschi della coorte 0+ raggiunge un picco massimo in agosto per poi diminuire, raggiungendo il valore minimo in ottobre (Fig. 11a). In agosto il numero di embrioni portato nella tasca dai maschi di età 0+ risulta essere confrontabile con i valori di fecondità marsupiale riscontrati nei maschi di un anno più vecchi. Nelle femmine di età 1+, i valori medi dell indice gonado-somatico sono risultati bassi all inizio del ciclo di campionamento, in aprile, per poi aumentare fino a raggiungere un massimo in giugno, quando le gonadi costituivano in peso circa il 15 % del peso corporeo totale (Fig. 11b). A partire da giugno, sono state rinvenute nei campioni anche femmine mature attribuibili, sulla base

70 delle loro dimensioni (Fig. 10), alla classe di età 0+. Da luglio in poi, sono state catturate soltanto femmine mature di età 0+. I valori dell indice gonado-somatico risultano estremamente variabili negli esemplari catturati in giugno, con un valore medio comunque inferiore a quello calcolato per le femmine di età 1+. I valori mensili di GSI delle femmine giovani presentano un massimo in luglio, per poi calare su valori decisamente bassi già a partire dal mese successivo (Fig. 11b) a) N=5 Number of embryos Number of embryos N=32 N=7 N=44 N=1 N=12 Embrioni nei maschi 1+ Embrioni nei maschi N=19 N=6 N=3 N=25 N=8 0,18 b) N=6 N=8 N=74 ddddd GSI 0,12 N=17 GSI femmine 1+ GSI femmine 0+ 0,06 N=10 N=21 0,00 N=49 N=8 Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Fig. 11 S. abaster: trend temporali della fecondità marsupiale (per i maschi, a) e dell indice gonadosomatico (GSI) (per le femmine, b). Syngnathus typhle In Fig. 12 vengono mostrate le distribuzioni di frequenza delle LS per mese di campionamento. Non viene riportato il mese di aprile, quando furono catturati soltanto quattro esemplari, relativamente di grandi dimensioni e attribuibili alla classe di età 1+. La quasi totalità degli esemplari campionati nei mesi successivi è stata attribuita, sulla base delle dimensioni e della progressione delle classi modali nel tempo, alla classe di età 0+ (Fig. 12). Il reclutamento è evidente a partire da maggio, per poi protarsi fino a settembre. Anche in questo caso, analogamente a quanto osservato per la popolazione di S. abaster, sono evidenziabili, all interno della classe di età 0+, sottocoorti di individui nati in momenti successivi e caratterizzati quindi da lunghezze diverse (Fig. 12). A partire da agosto, l interpretazione dei grafici di distribuzione delle lunghezze non risulta facile, sia per il prolungato periodo riproduttivo sia per il contributo al reclutamento dovuto agli esemplari di età 0+(Fig. 12). Nei mesi di aprile e maggio è stato campionato un numero esiguo di maschi 1+, che presentavano valori relativamente elevati di fecondità marsupiale (Fig 13a). Nel mese di giugno alcuni maschi nati nell anno, con taglie comprese tra i 12,5 e i 15 cm, presentavano già un abbozzo di tasca incubatrice. Nel mese di luglio, i giovani maschi davano un loro contributo effettivo alla riproduzione, presentando tasche incubatrici con uova o embrioni. I valori di fecondità marsupiale dei maschi giovani sono comunque sensibilmente inferiori a quelli osservati per i maschi 1+ (Fig 13a). Il numero medio di embrioni contenuti nelle tasche incubatrici degli individui 0+ è massimo

71 in luglio, per poi decrescere fino a settembre. Il GSI medio delle femmine 0+ presenta un andamento confrontabile a quello della fecondità marsupiale dei maschi (Fig 13b) Aprile; n=2 Maggio; n=17 Giugno; n=164 Luglio; n=429 Agosto; n=129 Settembre; n=129 Ottobre; n=17 Maschi 1+ Femmine 1+ Maschi 0+ Femmine 0+ Giovanili 0 < 2,5 (3,5 4) (5 5,5) (6,5 7) (8 8,5) (9,5 10) (11 11,5) (12,5 13) (14 14,5) (15,5 16) (17 17,5) (18,5 19) (20 20,5) (21,5 22) (23 23,5) (25 25,5) (26,5 27) >28 Lunghezza standard (cm) Fig. 12 S. typhle: distribuzione di frequenza per taglia (lunghezza standard, SL) degli individui catturati da aprile ad ottobre.

72 N=2 N=2 a) Number of embryos N=73 N=21 Embrioni nei maschi 1+ Embrioni nei maschi N=23 N=15 0,12 0,10 N=60 b) 0,08 GSI 0,06 0,04 N=139 N=70 N=14 GSI femmine 1+ GSI femmine 0+ 0,02 0,00 Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Fig. 13 S. typhle: trend temporali della fecondità marsupiale (per i maschi, a) e dell indice gonadosomatico (GSI) (per le femmine, b). Nerophis ophidion Questa specie è caratterizzata da uno spiccato dimorfismo sessuale: le femmine presentano infatti maggiori dimensioni corporee, un evidente colorazione blu elettrico della porzione del capo vicino all opercolo branchiale e, in taluni casi, una sorta di plica cutanea di colore scuro che decorre lungo il tronco. Durante il periodo di campionamento sono stati catturati esemplari adulti di entrambe i sessi (Fig. 14). Il maschio più grande misurava 23,1 cm di lunghezza totale, mentre la femmina di maggiori dimensioni raggiungeva i 26,7 cm. In aprile, individui sessualmente indifferenziati sono stati rinvenuti assieme a maschi gravidi e a femmine di grande taglia sessualmente mature. Nei mesi successivi, maschi e femmine sessualmente differenziati hanno rappresentato la quasi totalità del campione. Di tutti gli esemplari campionati, solamente 4 individui avevano una lunghezza inferiore ai 10 cm (Fig. 14). Maschi gravidi e femmine mature sono stati rinvenuti durante l intero ciclo di campionamento (Fig. 15a,b). Nei maschi che portano le uova, la dimensione media della covata aumenta marcatamente da aprile a giugno, per poi rimanere su valori relativamente elevati fino alla fine del periodo di campionamento. Da aprile a luglio, i valori medi di GSI delle femmine risultano caratterizzati da una elevata variabilità. Anche nel caso delle femmine, i valori medi mensili di fecondità si mantengono relativamente elevati e confrontabili fino alla fine del periodo di campionamento (Fig. 15b).

73 Aprile; n= Maggio; n=70 Giugno; n=38 Luglio; n=81 Agosto; n=12 Settembre; n=51 Ottobre; n=15 <1 (2;3) (4;5) (6;7) (8;9) (10;11) (12;13) (14;15) (16;17) (18;19) (20;21) (22;23) (24;25) (26;27) (28;29) Lunghezza totale (cm) Maschi Femmine Giovanili Fig. 14 N. ophidion: distribuzione di frequenza per taglia (lunghezza totale, TL) degli individui catturati da aprile ad ottobre.

74 a) N=7 N=40 Number of embryos N=4 N=38 N=13 N=2 N= Embrioni nei maschi b) N=8 N=29 N=8 N=26 N=4 N=18 N=5 GSI GSI femmine Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Fig. 15 N. ophidion: trend temporali della fecondità marsupiale (per i maschi, a) e dell indice gonadosomatico (GSI) (per le femmine, b). Ciclo riproduttivo: confronto tra le specie Per le specie del genere Syngnathus la comparsa delle prime reclute, della lunghezza di soli mm, è stata osservata in maggio. In entrambe le specie considerate, la maturità sessuale sembra essere raggiunta dopo soli 3-4 mesi dalla nascita, e comunque entro il primo anno di vita. La condizione di maturità precoce è stata in passato osservata in altre specie di teleostei di ambienti estuarini, come Aphanius iberus, Gambusia affinis, e Fundulus heteroclitus [Fernandez-Delgado et al., 1988]. Tomasini et al. [1991] hanno osservato che in S. abaster il contributo al reclutamento da parte degli esemplari di età 0+ non sembra essere importante da un punto di vista quantitativo, ma può risultare vantaggioso dal punto di vista della qualità dei nuovi nati. Nerophis ophidion adotta una differente strategia riproduttiva rispetto alle specie del genere Syngnathus. La stagione riproduttiva di questa specie è infatti più estesa, e ciò è probabilmente da mettere in relazione al fatto che dalle uova di N. ophidion schiudono giovanili che intraprendono vita planctonica fino al raggiungimento della taglia adulta, momento nel quale assumono l habitus bento-fitale. Il non aver catturato che soltanto pochi individui al di sotto dei 10 cm di lunghezza fa supporre che questa sia la taglia alla quale i giovani N. ophidion si stabiliscono nell habitat a prateria. Utilizzo e ripartizione della risorsa cibo Complessivamente è stato analizzato il contenuto del canale alimentare di 180 individui. In Fig. 16 è riportato il risultato dell analisi dei Cluster: i campioni di contenuti stomacali formano tre gruppi omogenei per specie, ad indicare che le differenze interspecifiche nella dieta sono più importanti di quelle legate ad una diversa disponibilità stagionale delle prede. La composizione della dieta delle tre specie, ottenuta considerando tutti i contenuti stomacali analizzati, viene mostrata in Fig. 17. Gli Anfipodi del genere Ericthonius compaiono nella dieta di tutte e tre le specie, ma con un valore diverso dell indice relativo di importanza. Questo Anfipode rappresenta la preda di gran lunga dominante nella dieta della classe 0+ di S. Typhle; nella dieta di questo singnatide compaiono anche prede di maggiori dimensioni e dotate di una maggiore mobilità rispetto agli Anfipodi, come Decapodi Natanti e Misidacei. Sono da segnalare inoltre, in questa specie, alcuni casi di ittiofagia ed un caso di cannibalismo. Nella dieta di S. abaster, oltre ad Erichtonius, sono importanti anche anche gli

75 10 S. typhle 07 S. typhle 08 S. typhle 09 S. typhle 04 N. ophidion 10 N. ophidion 09 N. ophidion 07 N. ophidion 08 N. ophidion 04 S. abaster 07 S. abaster 10 S. abaster 08 S. abaster 09 S. abaster Similarità (Bray-Curtis) Arpacticoidi fitali del genere Tisbe. Questo singnatide preda anche altri organismi che vivono strettamente associati alla vegetazione acquatica, come gli Anfipodi Caprellidi. Infine, la dieta di N. ophidion è risultata dominata soprattutto dagli Arpacticoidi dei generi Tisbe e Porcellidium, prede di minori dimensioni e legate all habitat fitale (Fig. 17). I risultati della PCA sono mostrati in Fig. 18: i primi due assi spiegano, insieme, più del 96% della variabilità dei dati. Sulla base dei caratteri morfologici considerati, gli individui di ciascuna specie si separano in gruppi distinti; i risultati di ANOSIM (Tab. 7) mettono in evidenza differenze significative nella morfologia del muso tra tutte e tre le specie considerate. Le differenze tra le specie per quanto riguarda la lunghezza relativa del muso (lunghezza del muso/lunghezza del capo) e l altezza della bocca (Fig. 19) sono state valutate in termini statistici applicando l U test di Mann- Whitney nei confronti a coppie. S. typhle risulta caratterizzato da un muso più alto e più lungo rispetto a S. abaster (U=9, p<0.001 per l altezza della bocca; U=37, p<0.001 per la lunghezza del muso) e N. ophidion (U=8, p<0.001; per l altezza della bocca U=20, p<0.001 per la lunghezza del muso). A sua volta, N. ophidion presenta un muso significativamente più corto (U=470, p<0.001) e una bocca significativamente meno alta (U=348, p<0.001) rispetto a S. abaster. Le differenze nella morfologia del capo riscontrate tra le tre specie di pesci ago, possono essere messe in relazione con le diversità riscontrate nelle diete. Un muso lungo permette la cattura di prede più mobili, presenti nella colonna d acqua subito al di sopra della vegetazione acquatica, mentre un muso più corto sembra essere più adatto per catturare la preda in microhabitat strutturalmente complessi [Franzoi et al., 1993; Kendrick, 2002]. Nella dieta di S. typhle, caratterizzato da un muso lungo, sono state rinvenute anche prede relativamente mobili e voluminose, come Misidacei e giovanili di Palemonidi. Nelle specie a muso corto (S. abaster e N. ophidion) sono state rinvenuti esclusivamente crostacei legati ai microhabitat fitali (Anfipodi e Arpacticoidi). Infine, la specie con il muso più corto e con la bocca meno ampia, N. ophidion, predava soprattutto su prede di piccole dimensioni (Arpacticoidi). 75 Fig. 16 Singnatidi: dendrogramma ottenuto dalla cluster analysis dei dati mensili di dieta delle 3 (il numero che precede il nome della specie indica il mese di campionamento).

76 76 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% S. abaster S. typhle N. ophidion Altro Decapodi natanti Isopoda Mysidacea Amphipoda not id. Caprellidae Erichtonius Ericthonius sp. Porcellidium sp. Tisbe sp. Fig. 17 Singnatidi: contributo (IRI% medio) delle diverse categorie alimentari alle diete delle 3 specie. 2,0 1,5 1,0 0,5 0-0,5-1,0-1, S. abaster AB N. ophidion N S. typhle TY Principal component axes Eigenvalues 5,14 0,66 0,09 0,06 0,04 Variation explained (%) 85,6 11,1 1,5 1 0,7 Fig. 18 Singnatidi: risultati della PCA sulle misure morfometriche dell apparato boccale e del capo delle 3. Le immagini del capo delle 3 specie sono riportate ANOSIM R-statistic value: 0,866 P<0.01 Groups R-statistic Level P S. abaster N. ophidion P<0.01 S. abaster S. typhle P<0.01 S. typhle N. ophidion 1 P<0.01 Tab. 7 Singnatidi: risultati di ANOSIM sulle specie.

77 77 0,74 0,68 0,62 n=30 Mean+DS Mean-DS Mean+1,96*ES Mean-1,96*ES Mean 5,5 5,0 4,5 4,0 n=30 Mean+DS Mean-DS Mean+ES Mean-ES Mean Standardized snout length 0,56 0,50 0,44 n=42 n=42 Mouthheigth (mm) 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 n=42 n=42 0,38 S. abaster S. typhle N. ophidion 1,0 S. abaster S. typhle N. ophidion Fig. 19 Singnatidi: misure del rapporto lunghezza preorbitale/lunghezza capo e altezza della bocca nelle tre specie Pubblicazioni prodotte Malavasi S., Coppola J., Pranovi F., Granzotto A., Franco A. and Torricelli P., Habitat riproduttivo di Zosterisessor ophiocephalus in laguna di Venezia e osservazioni sulle caratteristiche dei riproduttori. Lavori della Società Veneta di Scienze Naturali, 27, Franco A., Malavasi S., Pranovi F., Franzoi P. and Torricelli P., Preliminary data on gonadal development and fecundity in the grass goby, Zosterisessor ophiocephalus (Pallas, 1811) from the Venice lagoon (northern Italy). Acta Adriatica, 43, Franco A., Fiorin R., Malavasi S., Franzoi P. and Torricelli P., Spatial and temporal variation in reproductive and somatic investment of Zosterisessor ophiocephalus (Pisces, Gobiidae) in the Venice lagoon. Biologia Marina Mediterranea, 10, IN PRESS. Riccato F., Fiorin R., Franco A., Franzoi P., Libertini A., Pranovi F. and Torricelli P., Population structure and reproduction of three pipefish species (Teleostei, Syngnathidae) in a sea grass meadow of the Venice lagoon. Biologia Marina Mediterranea, 10, IN PRESS. Malavasi S., Fiorin R., Franco A. and Torricelli P. Somatic energy storage and reproductive investment in the grass goby Zosterisessor ophiocephalus. J. Mar. Biol. Ass. UK, IN PRESS. Franco A., Malavasi S., Fiorin R., Zucchetta M. and Torricelli P., Habitat characteristics of two endangered gobies in the Venice Lagoon, in Proceedings of the Six International Conference on the Meditearranean Coastal Environment, MEDCOAST 03, 7-11 October 2003, Ravenna, Italy, by Őzhan E. (ed.), MEDCOAST, Middle East Technical University, Ankara, Turkey, vol. 1, pp Franco A., Fiorin R., Franzoi P. and Torricelli P. Threatened fishes of the world: Pomatoschistus canestrinii Ninni, 1883 (Gobiidae). Environ. Biol. Fish., Submitted. Riccato F., Franco A., Franzoi P., Fiorin R., Malavasi S. and Torricelli P. Influence of age and habitat type on the dietary composition of Zosterisessor ophiocephalus in the Venice Lagoon. Biologia Marina Mediterranea, IN PRESS. Franzoi P., Riccato F., Franco A. and Torricelli P. Dietary differences in three pipefish species (Osteichthyes, Syngnathidae) related to the snout morphology. Biologia Marina Mediterranea, IN PRESS Bibliografia di riferimento Barry J. P, Yoklavich, M., Cailliet, G. M., Ambrose, D. A. and Antrim, B. S., Trophic ecology of the dominant fishes in Elkhorn Slough, California, Estuaries, 19, Fernandez-Delgado C., Hernando J.A., Herrera M. and Bellido M., Age, growth and reproduction of Aphanius iberus (Cuv. & Val., 1846) in the lower reaches of the Guadalquivir River (south-west Spain). Freshwater biology, 20,

78 Franzoi P., Maccagnani R., Rossi R. and Ceccherelli V.U., Life cycles and feeding habits of Syngnathus taenionotus and S. abaster (Pisces, Syngnathidae) in a brackish bay of the Po River Delta (Adriatic Sea ). Mar. Ecol. Prog. Ser, 97, Gandolfi G., Zerunian S., Torricelli P. and Marconato A., I pesci delle acque interne italiane. Ministero dell'ambiente, Unione Zoologica Italiana, Istituto Poligrafico e Zecca dello Stato, pp Kendrick A., Phd Thesis Krebs C.J., Niche overlap and diet analysis. In: Ecological methodology. Harper Collins Publishers, USA, Ludwig J.A. and Reynolds J.F., Statistical ecology a primer on methods and computing. Wiley-Interscience Publication, John Wiley & sons, USA. 337 pp. Maccagnani R., Carrieri A., Franzoi P. and Rossi R., Osservazioni sulla struttura di popolazione ed il ruolo trofico di tre specie di gobidi (Knipowitschia panizzae, Pomatoschistus marmoratus, Pomatoschistus canestrinii) in un ambiente del delta del Po. Nova Thalassia, 7, Mazzoldi C and Rasotto M.B., Alternative male mating tactics in Gobius niger. J. Fish Biol., 61, Mazzoldi C., Scaggiante M, Ambrosin E. and Rasotto M. B., Mating system and alternative male mating tactics in the grass goby Zosterisessor ophiocephalus (Teleostei: Gobiidae). Mar. Biol., 137, Miller P. J., Gobiidae. In: Fishes of the North-eastern Atlantic and the Mediterranean. Whitehead P. J. P., Bauchot M.-L., Hureau J.-C., Nielsen J. & Tortonese E. (eds.), vol. 3, Tomasini J. A., Quignard J. P., Capape C. and Bouchereau L., Facteurs du success reproductif de Syngnathus abaster Risso 1826 (Pisces, Teleostei, Syngnathidae) en milieu lagunaire mediterraneen (lagune de Mauguio, France). Acta Ecologica, 12, Torricelli P., Malavasi S., Novarini N., Pranovi F. and Mainardi D., Elongation of fin rays in parental males of Zosterisessor ophiocephalus (Pisces, Gobiidae). Env. Biol. Fish., 58,

79 3.4 Argomento 3 (Effetti dell introduzione di una specie non indigena, Tapes philippinarum, in Laguna di Venezia e impatti generati dallo sfruttamento della risorsa vongole) Composizione unità operativa Elenco di ricercatori e tecnici Cognome nome Istituto di appartenenza Mainardi Danilo DSA, Università di Venezia Torricelli Patrizia DSA, Università di Venezia Pranovi Fabio DSA, Università di Venezia Elenco di studenti (tesi, PhD, ecc.) Cognome nome Istituto di appartenenza Da Ponte Filippo DSA, Università di Venezia Granzotto Angela DSA, Università di Venezia Libralato Simone DSA, Università di Venezia Raicevich Sasa DSA, Università di Venezia Zucchetta Matteo DSA, Università di Venezia Obiettivi Scopo del presente argomento è stato quello di capire gli effetti dell introduzione di una specie alloctona, Tapes philippinarum, in laguna di Venezia, in particolar modo focalizzandosi sugli effetti indiretti, legati agli impatti sull ambiente lagunare generati dello sfruttamento di questa risorsa Attività preliminari Al fine di realizzare questo studio è stata necessararia un approfondita ricerca bibliografica per reperire le informazioni e i dati disponibili in letteratura sulla specie in esame e sulla sua introduzione in laguna Attività in campo ed in laboratorio Lo studio non ha incluso una vera e propria attività in campo. Esso, infatti è basato sulla comparazioni di database precedenti Elaborazione Sono stati comparati i seguenti database riguardanti la comunità macrobentonica lagunare: Giordani Soika and Perin (1974), dati riguardanti poche specie macrobentoniche, con survey condotti a scala di bacino; dati di presenza assenza riguardanti la distribuzione di molluschi in laguna di Venezia, raccolti negli anni 80 (Cesari, 1994); dati 1990 (MAV-CVN, 1992), riguardanti un survey condotto in 6 transetti (un totale di 18 aree di campionamento) distribuiti nei tre bacini lagunari. dati 1999 (Casale et al., 2001) 101 stazioni distribuite nei tre bacini lagunari Risultati ottenuti L introduzione di nuove specie (spesso definite alloctone o aliene) è, allo stato attuale, considerata una delle principali cause di minaccia per la biodiversità sul nostro pianeta. L introduzione di una specie alloctona può, infatti, comportare profonde modificazioni delle comunità biologiche nelle quali si inserisce e arrivando talora ad influenzare anche il funzionamento dell intero ecosistema. Per gli ambienti marini, spesso l acquacoltura si è rivelata un efficacie, e perciò pericoloso, vettore di invasione di nuovi habitat da parte di nuove specie.

80 Non tutte le introduzioni di specie nuove si trasformano in invasioni, con conseguenze ai livelli più elevati di organizzazione dell ecosistema. I fattori che determinano il successo di un invasione possono essere molteplici. In generale, recenti studi hanno evidenziato la presenza di cosiddette finestre di invadibilità. Sembra cioè che esistano degli stati dei sistemi ecologici (presenza di un elevato grado di stress e/o parziale perdita della funzionalità) che possono favorire l arrivo di specie alloctone e il loro successo in termini di espansione demografica. Tutto ciò sarebbe riconducibile al fatto che, in un sistema destabilizzato, le specie indigene verrebbero ad essere meno competitive. Esse cioè soffrirebbero maggiormente la perdita di funzionalità del sistema divenendo quasi disadattate alle nuove condizioni (ed esempio presenza di inquinanti o riduzione della produttività) e dunque svantaggiate nella competizione con la nuova specie che spesso presenta caratteristiche ecologiche opportunistiche (adattamento, rusticità, elevati tassi di crescita e riproduttivi). Questa è un po la situazione di T. philippinarum, che è stata, per certi versi, la specie giusta al momento giusto. All inizio degli anni 80, la laguna di Venezia si trovava, infatti, in condizioni di marcato stress (principalmente dovuto all eccessivo carico di nutrienti), che perdurarono per tutto il decennio. I segni più eclatanti di tale situazione furono l enorme proliferazione di macroalghe e di chironomidi e le ricorrenti anossie dei fondali lagunari con profonde ripercussioni anche sulla produzione alieutica. Proprio in relazione a questo fenomeno si studiarono alcuni possibili interventi di miglioramento. Tra questi, il principale ha avuto come obiettivo l introduzione, a titolo sperimentale, di una specie alloctona di vongola verace, Tapes philippinarum. Questa specie, originaria dell area indopacifica, e appartenente allo stesso genere della specie nostrana T. decussatus, presentava caratteristiche quali la rusticità e gli elevati tassi di crescita e di riproduzione, che ne facevano un soggetto potenzialmente interessante per impiantare attività di acquacoltura, o meglio venericoltura, in Laguna di Venezia. Nel 1983 ci furono le prime semine sperimentali, seguite dopo poco tempo da altri tentativi. All inizio degli anni 90 si era già creata in laguna una nuova risorsa che poteva essere sfruttata commercialmente: di fatto si apriva la stagione delle vongole veraci. Si è trattato sicuramente del più importante successo nel campo della molluschicoltura a livello nazionale; grazie ad esso l Italia è divenuta il principale paese produttore di vongole a livello europeo, ed in particolare la Laguna è diventata la fonte del più del 50 % della produzione nazionale. Sotto il profilo ambientale, però la situazione a medio termine, si è rivelata sicuramente meno favorevole. Nel giro di poco più di un decennio T. philippinarum è diventata la specie predominante (la più diffusa e la più abbondante sia in termini numerici che di biomassa) delle comunità macrobentoniche lagunari. Tutto ciò ha radicalmente modificato le comunità stesse, portando alla drastica riduzione della presenza di altre specie di invertebrati lagunari. Ad esempio i bivalvi filtratori di medie dimensioni (range dimensionale paragonabile a quello di T. philippinarum) a metà degli anni 80 contavano 34 specie e all inizio degli anni 90 ne annoveravano 30. Di queste, alla fine degli anni 90 ne restavano solo 19. Valutazioni effettuate utilizzando diversi approcci (stime dirette del tasso di filtrazione e comparazione con la densità planctonica in situ, stime ottenute mediante l utilizzo di modelli trofici) indicano che in Laguna di Venezia le vongole veraci raggiungono una biomassa complessiva superiore a quella che sarebbe la capacità trofica del sistema per organismi filtratori. In sostanza, la quantità di energia richiesta dalle vongole per lo svolgimento delle funzioni metaboliche, per l accrescimento e la riproduzione è superiore a quella realmente disponibile nel comparto planctonico, considerando la produzione planctonica nel suo complesso. Questo conduce immediatamente ad un assurdo ecologico, in quanto nella realtà si verifica che le vongole ci sono e che non mostrano segni di crisi. Quale potrebbe essere dunque, la fonte aggiuntiva di energia? I risultati delle valutazioni relative allo spettro alimentare di T. philippinarum indicano che questa specie ha la possibilità di alimentarsi su un ampia gamma di fonti (a differenza della specie 80

81 congenere che mostra una nicchia alimentare molto più stretta selettiva), tra cui non solo organismi vivi, ma anche di sostanza organica, purché sospesa nella colonna d acqua. Combinando questa informazione con stime sperimentali relative alla quantità di sostanza organica risospesa durante le operazioni di pesca delle vongole veraci, e dunque messa a disposizione diretta degli organismi filtratori presenti (T. philippinarum in primis), si è ricavata l indicazione che proprio questa potrebbe essere la fonte aggiuntiva di cibo che consente alle vongole di raggiungere densità così elevate. Tutto ciò porta a quello che potrebbe essere definito come il paradosso Tapes : una specie soggetta ad intenso sfruttamento, ma che, contrariamente a quanto accade per tutte le altre risorse alieutiche, tra anche dei benefici diretti dall azione di pesca. Questo spiegherebbe anche la distribuzione di T. philippinarum in laguna, con le densità maggiori registrate proprio in corrispondenza delle zone di raccolta meccanica e il fatto che nonostante il tasso di sfruttamento sia cresciuto in modo vertiginoso, al risorsa non mostri ancora segni evidenti di stress da sovrasfuttamento. L applicazione di un approccio ecosistemico allo studio degli effetti della pesca di T. philippinarum in Laguna di Venezia ha consentito di evidenziare e quantificare, in via preliminare, sia gli effetti diretti dell attività di pesca sulla risorsa sfruttata (feedback positivo sulle vongole stesse), sulle specie non commerciali (rapporto scarto commerciale compreso tra 1.5 e 3), sull habitat bentonico (omogenizzazione, cambiamento caratteristiche tessiturali del sedimento), sia di effetti indiretti che si propagano lungo l intera rete trofica, fino a colpire anche specie che non sono direttamente coinvolte nell attività di pesca con attrezzi meccanici. Per quanto riguarda gli effetti dell introduzione di T. philippinarum e delle sue elevate densità in laguna, l approccio seguito ha consentito di effettuare delle valutazioni sul funzionamento dell ecosistema. L enorme biomassa raggiunta da Tapes sembra aver modificato radicalmente il funzionamento del sistema. Prima dell introduzione, l ecosistema era controllato dal comparto bentonico, in particolare organismi predatori-opportunisti e/o produttori primari. Ciò significa che le dinamiche globali dei flussi di energia venivano prevalentemente influenzate dalle popolazioni presenti sui fondali lagunari con un controllo degli altri livelli della catena trofica (controllo bottom-up da parte dei produttori primari, o top-down da parte dei predatori). L avvento di Tapes ha modificato la situazione, il controllo è ancora a carico del comparto bentonico, ma è dovuto ad una singola specie, T. philippinarum appunto, che, grazie alla sua enorme biomassa, diventa l anello principale attraverso cui fluisce gran parte dell energia e della materia. Questo implica che il controllo dell ecosistema sia completamente diverso dai precedenti. Si tratta di un controllo a vite di vespa (wasp-waist). Questo tipo di controllo è stato descritto principalmente, se non esclusivamente, per gli ecosistemi di zone di upwelling costieri, dominati da una o due specie di pesci (di norma acciughe o sardine). La laguna dunque si presenta come un importante peculiarità ecologica. Questa situazione, come detto in precedenza, non è però il frutto di una naturale evoluzione dell ecosistema ma è stata creata dall uomo (introduzione di Tapes), e soprattutto è mantenuta dall uomo (la biomassa di Tapes è sostenuta anche dal feedback positivo creato dall attività di pesca). I sistemi ecologici con questo tipo di controllo centrale, risultano spesso piuttosto resistenti, ovverosia sono difficili da spostare dall equilibrio in cui si trovano (l enorme biomassa di una singola specie fornisce un buffer importante contro le fluttuazioni), ma d altro canto sono poco resilienti, ossia una volta che siano usciti dal proprio equilibrio è molto difficile che possano ritornarvi (una volta che i cambiamenti abbiano fatto crollare la biomassa della specie dominante è molto difficile ripristinarla, almeno in tempi brevi). Tutto questo applicato alla Laguna di Venezia, evidenzia la fragilità del sistema. Un evento che fosse in grado di far cambiare stato al sistema avrebbe conseguenze ecologiche imprevedibili a livello ecologico.questa fragilità si ripercuote immediatamente a livello socio-economico mostrando tutti i rischi di un attività di sfruttamento quale la pesca delle vongole veraci basata su una singola specie bersaglio in una sorta di modello a monocoltura. 81

82 L utilizzo del modello della rete trofica lagunare ha consentito di effettuare delle simulazioni, analizzando gli effetti sull ecosistema del cambiamento del regime di sfruttamento delle vongole. Eliminando completamente l attività di pesca di T. philippinarum si registra come primo effetto una diminuzione (circa 20%) delle biomassa di vongole presenti in laguna. Questo effetto assolutamente insolito (comunemente una riduzione dell attività di prelievo produce un aumento della biomassa della specie pescata), è da ricondursi al paradosso sopraesposto: eliminando la pesca si elimina anche la fonte energetica supplementare alla produzione primari lagunare. Un altro effetto è quello di ottenere un aumento di circa il 30% delle catture con attrezzi da posta (cogolli) da parte della pesca artigianale (che si riflette in un aumento di guadagno di quasi il 50%) a fronte di un mantenimento costante dello sforzo. In altri termini i pescatori catturerebbero più pesce senza fare nulla di più di quanto facessero prima. Bisogna considerare che la due tipologie di pesca (artigianale e meccanica) non hanno nulla in comune e non mostrano nessuna interazione, se non la condivisione dell ambiente che sfruttano la Laguna. Esistono dunque degli effetti indiretti della pesca meccanica delle vongole che propagandosi lungo la rete trofica vanno a colpire anche i livelli trofici superiori, ad esempio i predatori che spesso rappresentano le specie bersaglio della pesca artigianale Pubblicazioni prodotte Bibliografia di riferimento Casale M., Giovanardi O., Grimm F., Orel G., Pessa G., Distribuzione ed abbondanza delle principali specie di molluschi bivalvi nelle laguna di Venezia nell estate 1999, con particolare riguardo per Tapes philipinarum (Adams & Reeve, 1850). Biol. Mar. Medit., 8, Cesari P., I Molluschi della Laguna Veneta. Arsenale editrice, Venezia, 200 pp. Giordani Soika A. and Perin G., L'inquinamento della Laguna di Venezia: studio delle modificazioni chimiche e del popolamento sottobasale dei sedimenti lagunari negli ultimi vent'anni. Bollettino del Museo Civico di Venezia, 26, MAV-CVN, Studio A3.16/II Composizione delle comunità biologiche connesse con le modifiche morfologiche - II fase, 123 pp.

83 3.5 Argomento 4 (Biodiversità genetica in gobidi di ambiente lagunare e valutazioni dell eventuale associazione fra la variabilità genetica e altri indicatori biologici) Composizione unità operativa Elenco di ricercatori e tecnici Cognome nome Istituto di appartenenza Bisol Paolo Maria DIP. BIOLOGIA - PD Zane Lorenzo DIP. BIOLOGIA - PD Tallandini Laura DIP. BIOLOGIA PD Venier Paola DIP. BIOLOGIA - PD Elenco di studenti (tesi) Cognome nome Istituto di appartenenza Belardinelli Enzo DIP. BIOLOGIA PD Campagnolo Paola DIP. BIOLOGIA - PD Gallini Alessandra DIP. BIOLOGIA - PD Prevedello Sabrina DIP. BIOLOGIA - PD Rianna Enza DIP. BIOLOGIA - PD Obiettivi La necessità di amministrare la diversità biologica richiede delle valutazioni e delle misure che permettano una comparazione dei valori, sempre tenendo conto della naturalità del continuo cambiamento dei viventi, riassumibile nell affermazione le popolazioni di una specie non sono omogenee né dal punto di vista genetico né dal punto di vista ecologico. È allora necessario scomporre e distinguere gli elementi che costituiscono la biodiversità nel suo insieme, a tre diversi livelli fondamentali e gerarchicamente ordinati : I genetico; II di specie; III di comunità e di ecosistema (Figura 3.5.1). La diversità genetica è data dalla variabilità che si eredita, trasmessa di generazione in generazione, e che costituisce il patrimonio genetico degli organismi. In sostanza, essa è rappresentata nelle variazioni delle sequenze delle quattro basi del DNA. Nuova variabilità genetica si forma per mutazione dei geni e dei cromosomi, vettori del materiale genetico; negli organismi con riproduzione sessuale un altro elemento che rinnova la variabilità degli individui è la ricombinazione. La diversità genetica degli individui si riassume al livello gerarchico superiore: la specie, suddivisa in popolazioni locali. L importanza ecologica di una specie può avere un effetto diretto sulla struttura della comunità, costituita dall insieme di specie che interagiscono in un territorio definito per dimensioni e caratteristiche. Il sistema è continuamente dinamico, secondo lo scenario previsto della teoria dell evoluzione biologica, mosso da elementi deterministici (quindi relativamente prevedibili) e stocastici (per loro natura del tutto accidentali e non valutabili se non a posteriori). É su scenari come questo che va inserito il problema dell inquinamento come alterazione della qualità dell ambiente dipendente dall azione dell uomo - e dei suoi effetti sugli organismi viventi. A livello di popolazione gli effetti negativi dell inquinamento si possono manifestare in termini demografici (abbondanza ridotta, distribuzione alterata, cambiamenti della struttura per età) e genetici (alterazioni del pool genico, variazioni di frequenze geniche, riduzione del flusso genico), 83

84 84 Livelli della biodiversità Comunità Specie/popolazioni Geni/individui 1. Reti trofiche, interazioni tra specie, competizione, predazione. Struttura comunità, ricchezza in specie 2. Fitness, variabilità genetica, fertilità, sopravvivenza, crescita 3. Fenotipi, adattamenti fisiologici, risposte individuali Figura Organizzazione gerarchica dei livelli della biodiversità e con l indicazione di alcuni aspetti descrittivi o funzionali, possibili elementi di indagine. I tempi di risposta variano ovviamente in funzione del sensore biologico: quanto maggiore è il grado di complessità tanto più lungo può essere tempo di latenza. Alterazioni delle performance (crescita, sviluppo, successo riproduttivo, reclutamento o acquisizione di nuovi individui dagli eventi riproduttivi stagionali), le interazioni fra popolazioni e quindi la struttura della comunità e il funzionamento ecosistemico di solito vanno valutate su scale temporali di mesi e di anni. Su queste basi, in una logica di complementarietà e integrazione del progetto WP1, si è indagato sul pesce della famiglia Gobiidae Zosterisessor ophiocephalus (Teleostea, Perciformes) con i seguenti obiettivi: Stima della variabilità genetica Definizione dei rischi di erosione genetica delle popolazioni lagunari a seguito di impatti antropici (inquinamento, sfruttamento, ecc). Stima del grado di suddivisione e delle relazioni fra popolazioni, verifica di pressioni selettive, isolamento ed influenza della deriva genetica; valutazione dell erosione genetica. Valutazione delle eventuali relazioni fra variabilità genetica e altri indicatori biologici Attività preliminari Si è proceduto alla documentazione bibliografica, per l opportuno aggiornamento metodologico e formativo sui più recenti risultati relativi a gobidi o più in generale a Teleostei inerenti le attività alla base della ricerca. Messa a punto di tecniche di analisi per lo studio della variabilità genetica enzimatica usando gel di acrilamide per Isolectrofocusing e acetato di cellulosa quali supporti di migrazione. Messa a punto di tecniche di estrazione, purificazione e amplificazione del DNA nucleare. Isolamento di marcatori satellitari microsatelliti, loro arricchimento e clonaggio. Disegno di primer e analisi di sequenze. La sequenza di operazioni è riportata in fig Identificazione di marcatori mitocondriali (subunità 16S del RNA ribosomale mitocondriale) in differenti specie di gobidi. Allestimento di tecniche di elettroforesi e immuno-elettroforesi di proteine e di cellule, microscopia a fluorescenza e analisi di immagine, spettrofotometria per lo studio delle alterazioni del DNA, con la produzione di uno specifico protocollo per Test Cometa e apoptosi.

85 Messa a punto delle tecniche di indagine per lo studio del sistema enzimatico P450 (espressione ed attività). 85 Figura Schema delle fasi principali del protocollo d isolamento di marcatori nucleari microatelliti per Zosterisessor ophiocephalus

86 86 Fig Esempio di Test Cometa o elettroforesi su gel di singole cellule (SCGE). Le due barre bianche verticali delimitano la testa della cometa, a destra la coda costituita da frammenti di DNA. (Per ogni campione vengono esaminate almeno 50 cellule; le cellule in cui il DNA non presenta rotture (nuclei intatti) appaiono come un core subsferico con una minima o nulla migrazione di DNA mentre la presenza di rotture ai filamenti permette ai frammenti di muoversi dal nucleoide verso l'anodo, risultando nella formazione di una coda detta "cometa". La coda di questa cometa rappresenta un parametro da cui si può estrapolare la quantità di danno presente in una singola cellula. Infatti la capacità del DNA di migrare è funzione della taglia del frammento e del numero di estremità rotte che possono essere attaccate a pezzi più grandi di DNA, ma che possono ancora migrare per una breve distanza dalla testa della cometa. A bassi livelli di danno si ha lo stiramento dei filamenti attaccati a tratti di DNA più grandi, piuttosto che la migrazione di pezzi individuali.) Fig Immagine di esemplare di Zosterisessor ophiocephalus. La colorazione fondamentale della livrea va da giallo-verdognolo a olivastro e nella regione ventrale si fa gradualmente più chiara. Nell immagine si riconoscono bene le bande e le macchie brune irregolari caratteristiche del corpo e delle pinne; risulta invece poco evidente la piccola macchia nera che si osserva tipicamente alla base della pinna caudale. La superficie corporea è ricoperta di abbondante muco. (Immagine da: Attività in campo ed in laboratorio Uscite per la raccolta di campioni di popolazione, in collaborazione con WP1 ( Zone di raccolta nella laguna di Venezia: Ca Zane, Ponte della Libertà, Lido, Lago dei Teneri, Chioggia; nella laguna di Marano-Grado: Isola di S. Andrea). Raccolta dati biometrici. Preparazione degli esemplari per le analisi elettroforetiche e molecolari. Applicazione delle metodologie messe a punto sui campioni raccolti. Le indagini sono state condotte su esemplari di Zosterisessor ophiocefalus (fig ) e, limitatamente alla variabilità di geni mitocondriali, su esemplari di Gobius cobitis, Gobius niger, Knipowitschia panizzae, Pomatoschistus marmoratus, Pomatoschistus canestrinii e Pomatoschistus minutus.

87 3.5.5 Elaborazione Dati biometrici I dati biometrici Lunghezza totale, LT; Lunghezza standard, LS; peso corporeo, TW; peso del fegato LW) sono stati elaborati con Microsoft EXCEL e le analisi statistiche (Krustal-Wallis, ANOVA) sono state svolte con il programma Pop Tools per EXCEL. Le regressioni taglia-peso corporeo separatamente per i due sessi, usando la funzione: ln(tw) = b[ln(sl)] + ln(a) Indice epatosomatico In tutti i casi in cui è stato possibile pesare il fegato, si è calcolato l indice epatosomatico (HSI), cioè il rapporto percentuale tra peso del fegato e peso del corpo: HSI = (LW / TW) x Sex-ratio Per ciascun campione è stato calcolato il rapporto sessi (Sex-Ratio, SR), cioè il rapporto tra il numero dei maschi e quello delle femmine: SR = n maschi/ n femmine Analisi della variabilità genetica a livello di popolazione L analisi di popolazione riportata in questo studio, prevede l uso di test statistici che permettono di esaminare il campione di individui prelevato e di inferire i dati ricavati all intera popolazione. Un test statistico è un insieme di procedure di calcolo che hanno lo scopo di accertare la validità o meno di un ipotesi, detta ipotesi H 0, concernente uno o più campioni di realizzazioni di variabili casuali. Il programma Genepop (Raymond & Rousset, 1995) è stato utilizzato per il calcolo delle frequenze alleliche, dell eterozigosità osservata ed attesa e per la verifica dell equilibrio di Hardy-Weinberg; il programma Arlequin (Schneider et al., 2000) è servito per analizzare il differenziamento tra campioni di popolazione. L uso di più programmi è dovuto al fatto che non sempre un programma è adatto a calcolare tutte le statistiche per la genetica di popolazione e permette inoltre una verifica incrociata dei dati per le elaborazioni comuni. Frequenze alleliche Per ogni locus, iferito sia a sistemi gene-enzima sia a loci microsatelliti sono state valutate le frequenze alleliche che, in locus di tipo dominante, corrispondono al rapporto tra il numero di volte in cui un allele è presente in una popolazione ed il numero totale degli alleli. La frequenza p i dell iesimo allele di un qualsiasi gene è data da: p i = (2n i1 + n i2 )/2N con: n ì1 = numero omozigoti per l allele i-esimo n ì2 = numero eterozigoti per l allele i-esimo N= numero degli individui del campione Polimorfismo di un locus In genetica di popolazione, sono usati in generale due criteri per definire se un locus è polimorfo. Il primo è quello del 1%, secondo il quale un locus è polimorfo se l allele più rappresentato nella popolazione ha una frequenza non superiore a 0,99. Il secondo è quello del 5%, che definisce un locus polimorfo se l allele più comune ha una frequenza non superiore a 0,95. La chiave del polimorfismo è nelle frequenze geniche e non nel numero di alleli classificati. P = n loci polimorfi / n loci studiati. Frequenze genotipiche attese ed equilibrio di Hardy-Weinberg: Secondo la legge di Hardy-Weinberg (HW) in popolazioni con accoppiamento casuale tra gli individui (panmissia), nelle quali forze evoluzionistiche come la migrazione, la deriva genetica, la mutazione e la selezione naturale siano trascurabili, le frequenze alleliche rimangono costanti nel corso delle generazioni. In questo caso le distribuzioni genotipiche rimangono invariate e corrispondono, per un sistema ad n alleli, allo sviluppo del quadrato del polinomio: (p 1 + p 2 + p n ) 2

88 dove p n è la frequenza dell allele i-esimo. In un sistema a due alleli, A e a, con frequenze p e q rispettivamente, la distribuzione attesa corrisponde a: p 2 AA + 2pqAa + q 2 aa L equilibrio è rispettato quando in ogni classe genotipica il valore osservato corrisponde a quello atteso, quest ultimo ottenuto con il prodotto della probabilità della singola classe (p 2, ecc.) per la dimensione del campione di popolazione considerato (N). Date le dimensioni dei campioni, i valori attesi sono stati calcolati con la correzione di Levene (1949), che per un sistema a due alleli può essere così formalizzata: AA Aa aa x 1 (2x 1 1)/(2n 1) 4x 1 x 2 /(2n 1) x 2 (2x 2 1)/(2n 1) dove: n è il numero di loci x i è la frequenza dell allele i-esimo Per verificare l equilibrio di Hardy-Weinberg, è stato utilizzato il test esatto (Guo & Thompson, 1992), preferibile qualora la dimensione del campione in esame non sia molto grande e/o ci siano loci con diversi alleli rari. Con un algoritmo basato su catene di Markov, è stato stimato senza distorsione il valore esatto della probabilità (P) associata all ipotesi nulla (H 0 ): unione casuale dei gameti. H 0 è stata rigettata quando P è risultato inferiore ad un livello di significatività α pari a 0,05. In caso di confronti multipli la soglia è stata aggiustata secondo la procedura di Bonferroni standard, come descritto in seguito. Poiché la fase gametica non era nota, il test è stato eseguito per ciascun locus separatamente. Inincrocio e indice di fissazione Il principale effetto di un accoppiamento non casuale ma preferenziale tra individui imparentati in una popolazione (inincrocio) è l aumento ad ogni generazione della frequenza dei genotipi omozigoti a spese della frequenza dei genotipi eterozigoti. Eventuali scostamenti significativi dall equilibrio di Hardy-Weinberg dovuti ad inincrocio sono stati valutati stimando l indice di fissazione (o coefficiente di inincrocio) f (Weir e Cockerham, 1984; Weir, 1990). L indice f è positivo se la deviazione dall equilibrio è dovuta ad un eccesso di omozigoti, negativo se c è difetto di omozigoti. Quando f vale zero, cioè c è assenza di inincrocio (e l accoppiamento è casuale), le frequenze genotipiche sono nelle consuete proporzioni di HW. Quando f vale 1, ossia l inincrocio è completo, la popolazione è costituita interamente da omozigoti. Ad esempio, per un sistema biallelico a tre genotipi le frequenze genotipiche diventano: f(aa) = p 2 + pq f f(aa) = 2pq (1 f) f(aa) = q 2 + pq f Per la verifica della significatività degli indici f è stato effettuato il test esatto di Fisher (Sokal e Rholf, 1981) con una soglia di significatività α pari a 0,05. Linkage equilibrium In condizioni di accoppiamento casuale, gli alleli a un qualsiasi locus raggiungono rapidamente l associazione casuale nei genotipi. Una situazione di associazione gametica casuale tra alleli di geni diversi è detta linkage equilibrium (equilibrio di geni associati). Tuttavia gli alleli di un gene possono non essere in associazione casuale con gli alleli dell altro gene e si afferma che i geni sono in linkage disequilibrium. Per lo studio dei loci microsatelliti sono state create delle tabelle di contingenza per tutte le coppie di loci in ogni popolazione, partendo dall ipotesi zero che i genotipi di un locus sono indipendenti dai genotipi di un altro locus. Ad ogni coppia di confronto è stato associato un valore di probabilità, con la quale si può ottenere per caso un valore di linkage come quello relativo al dataset originale. Il livello di significatività globale del test è α = 0,05, mentre, utilizzando la correzione di Bonferroni standard, la soglia per i singoli confronti è α/k, dove k è il numero di test eseguito. Confronto tra le popolazioni 88

89 Distanze genetiche Per visualizzare graficamente le relazioni tra le popolazioni, si sono costruiti dendogrammi attraverso l algoritmo UPGMA (Unweighted pair-group method with arithmetic mean) o metodo della distanza media eseguito dal programma GDA. La procedura che conduce al grafico può venire così riassunta: usando la matrice che riporta i valori di distanza per tutte le coppie di popolazione vengono ricostruite le posizioni dei campioni procedendo dalla coppia con la distanza minore. Vengono quindi costruite nuove matrici, mediando i dati. La combinazione di una popolazione di una popolazione con i gruppi già abbinati segue sempre la logica della minore distanza relativa. Per ultima viene collocata la popolazione che ha la maggiore distanza rispetto agli altri. Ogni figurazione è associata ad una coordinata che riporta la scala in termini di distanza genetica. Le distanze genetiche utilizzate per costruire tali grafici sono state elaborate con la relazione di Reynolds et al. (1983). Tale relazione si serve dei valori degli indici F ST ed è la seguente: D r = - ln (1 F ST ) Poichè F ST varia da 0 a 1, D r varia da 0 a infinito. La distanza è nulla quando le due popolazioni sono identiche, ossia quando le loro eterozigosità coincidono con quella della popolazione totale. La distanza è invece massima quando le due popolazioni non hanno nulla in comune, avendo fissato alleli diversi. Struttura di popolazione La struttura di popolazione è investigata utilizzando l analisi molecolare della varianza (AMOVA, Excoffier et al. 1992), strumento utile per verificare quanta della varianza totale sia spiegata dalle differenze tra gli individui di una popolazione e quanta, invece, derivi dalla suddivisione in popolazioni diverse. La varianza è la misura del grado di dispersione di un gruppo di valori intorno alla media. Considerando due popolazioni con frequenze alleliche q 1 e q 2, si definisce una variabile α che misuri la differenza tra q (q 1 + q 2 /2) e la frequenza allelica di ciascuna popolazione. La frequenza del genotipo aa in un campione formato da individui presi in ugual numero dalle due popolazioni è: [(q + α) 2 + (q - α) 2 ] /2 = q + α 2 Con (q + α) = q 1, (q α) = q 2; α 2 che rappresenta la somma dei quadrati delle deviazioni, in altre parole la varianza. Finora sono state considerate le frequenze gametiche, ma nelle popolazioni complessive le frequenze genotipiche possono differire da quelle attese in base all equilibrio di Hardy-Weinberg. Se un particolare genotipo eterozigote è presente in eccesso o in difetto, dipende dalla covarianza delle frequenze gametiche tra popolazioni. L analisi delle frequenze genotipiche delle popolazioni suddivise in sottopopolazioni, coinvolge le statistiche F. Nel caso di dati genotipici su individui diploidi, con il programma Arlequin è possibile suddividere la popolazione in campioni e creare dei gruppi di campioni per confrontarli tra loro. Si procede al calcolo dei seguenti indici: Fct = indica la variabilità tra gruppi Fsc = indica la variabilità tra individui in differenti campioni all interno dello stesso gruppo Fst = indica la variabilità tra individui all interno dei campioni La significatività di tali indici è testata permutando casualmente i genotipi, gli individui, o i campioni, tra gli individui, i campioni, o gruppi di campioni (Excoffier et al.,. 1992). Dopo ogni permutazione, vengono ricalcolati gli indici F e confrontati con quello osservato; in questo modo è possibile stimare la frequenza con cui i valori eguali o più alti di quello osservato occorrono nella distribuzione e quindi la probabilità che tale valore sia osservato per effetto del solo caso. Se tali valori sono significativamente maggiori di 0, cioè hanno una probabilità di essere osservati per effetto del caso minore di 0,05, essi indicano la presenza di differenziamento. Per i microsatelliti sono state introdotte le statistiche R, analoghe alle statistiche F, che tengono conto degli alti tassi di mutazione dei loci microsatellite (Slatkin, 1994). 89

90 - Test di Fisher Il test esatto di Fisher permette di ricavare la significatività globale associata ad un insieme di test multipli, ed è stato usato per verificare i confronti tra loci (Hardy-Weinberg e linkage disequilibrium) o popolazioni (Fst a coppie). Con questo test si vuole verificare con quale probabilità, si può ottenere per caso, una distribuzione di probabilità quale quella ottenuta dai confronti multipli. Ad esempio, le probabilità del test Fst sono state sottoposte alla correzione di Fisher, secondo la seguente formula: f = -2 ln [P(Fst)] L ipotesi zero da verificare è quella di omogeneità dei dati; si confronta il valore f con la soglia corrispondente (soglia = 0,05) su una tabella di distribuzione del χ 2 in base al numero 2n di gradi di libertà, con n che corrisponde al numero di test multipli effettuati. Se f risulta non significativo, ovvero superiore alla soglia del χ 2, allora l ipotesi zero non può essere respinta e vi è omogeneità tra i dati. - Test di Bonferroni standard Questo test permette di verificare la distribuzione dei valori di probabilità associati alle statistiche a coppie (statistiche F tra coppie di popolazioni, linkage disequilibrium tra coppie di loci all interno di una popolazione) partendo dall ipotesi zero di omogeneità dei dati. Lo scopo è quello di identificare tutti i valori veramente significativi; il valore della probabilità α (α = 0,05) secondo cui accettare o rifiutare l ipotesi zero, è diviso per il numero c di test multipli utilizzati. Il livello di significatività secondo cui accettare o rifiutare l ipotesi zero, è α/c Risultati ottenuti 1. Dati biometrici Per ogni raccolta gli esemplari sono stati trattati in modo da ottenere informazioni sul sesso, sulla lunghezza standard (SL), sulla lunghezza totale (TL), sul peso totale (TW) e sul peso del fegato (LW) (solo 2002). Poichè nella serie di campionamenti della primavera del 2002, si sono selezionati per taglia (massimo 12 cm) gli esemplari da sottoporre a analisi genetica, non è possibile una piena comparazione dell insieme dei dati, riferibili a 484 individui. In generale, nella laguna di Venezia si è osservata una certa eterogenità dei campioni, non sempre statisticamente significativa. In accordo con i dati di letteratura le femmine risultano mediamente più piccole dei maschi. I campioni di Marano-Grado risultano invece omogenei per dimensione. Questi dati, con quelli riferiti al sesso, sono stati utili per caratterizzare il singolo indivisuo dal punto di vista delle età. Per tutti gli esemplari catturati nella primavera 2002 nella Laguna di Venezia per i quali era stato acquisito il peso del fegato, è stato calcolato l indice epatosomatico (HSI), cioè il rapporto percentuale tra peso del fegato e peso corporeo totale. I pesci prelevati dalla stazione Ponte della Libertà, hanno mostrato l HSI in media più elevato (2,16), seguiti, in ordine, da quelli di Lago dei teneri (1,82), Lido (1,74), Chioggia (1,55) e Ca Zane (1,21). Si è riscontrato che più è alta la classe di rischio ecologico cumulativo per inquinamento da agenti chimici a cui appartiene la stazione di prelievo (ricavata da Critto & Marcomini, 2001), più è elevato l HSI medio relativo al campione di quella zona (tabella 3.4.3). 2. Variabilità enzimatica Nello studio svolto su Zosterisessor ophiocephalus, è stata necessaria una fase preliminare interpretativa dei loci genici poiché tale organismo è molto studiato dal punto di vista comportamentale ma poche informazioni si hanno a riguardo della variabilità genetica. E sorta qui inoltre la necessità di utilizzare per lo studio dei vari sistemi gene-enzima, anche una tecnica elettroforetica diversa dall IEF, poiché i pattern con questa ottenuti erano difficilmente interpretabili. Si è usato come ulteriore mezzo di indagine l elettroforesi su acetato di cellulosa che, benché sia una delle tecniche più vecchie, risulta ancora un metodo molto semplice e relativamente poco costoso per condurre analisi enzimatiche. Indipendentemente dalla tecnica utilizzata, si sono 90

91 fatte verifiche incrociate, caricando sulla stessa lastrina o sullo stesso foglio di acetato, campioni analizzati in momenti diversi per ogni sistema gene-enzima, in modo tale da ridurre la possibilità di errore nel riconoscimento dei diversi alleli e poter confermare le classificazioni iniziali. Con questo lavoro è stata possibile una nuova descrizione dei pattern elettroforetici in Z. ophiocefalus, più accurata delle precedenti per l uso di singoli tessuti o parti d organo. In questa maniera è stato possibile attribuire loci con attività tessuto specifica, e eliminare alcune classificazioni spurie come una frazione di alcooldeidrogenasi erroneamente classificata in letteratura come latticodeidrogenasi. Di seguito, una sintesi dei sistemi gene-enzima studiati e le principali caratteristiche. Adenilato chinasi (AK: Enzyme Code ) L enzima, monomero, è risultato espresso nel muscolo e codificato da un singolo locus genico. Dall analisi di tutti gli esemplari non è risultata alcuna variabilità. Fosfoglucomutasi (PGM: EC ) PGM risulta codificato da due loci, PGM 1 e PGM 2, entrambi attivi nel muscolo e nel fegato. Nell occhio è risultato attivo solo PGM 1. I risultati da noi ottenuti sembrano aver risolto in modo definitivo, per il go, quello che era ambiguo in letteratura. Circa la variabilità sull intero campione sono stati classificati come eterozigoti solo quattro individui. La presenza di sole due bande nella condizione eterozigote, rivela la struttura monomerica di tale enzima. 6 Fosfogluconato deidrogenasi (PGD: EC ) Si è trovato un singolo locus,(figura 3.4.5), espresso in tutti i tessuti analizzati (branchie, occhi, fegato e muscolo) in accordo, in parte, con quanto riferito dalle diverse descrizioni. Fumarato idratasi (FU: EC ) Dall analisi di tale enzima, è stato trovato un singolo locus, attivo sia in muscolo che in fegato, senza espressione di variabilità fra gli individui. Gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH: EC ) Nell analisi da noi svolta, tale enzima,usualmente tetramenrico, risulta codificato da un singolo locus, attivo sia in muscolo che negli altri tessuti. Glucosio fosfato isomerasi (GPI: EC ) Nello studio da noi svolto, i loci, Gpi 1 e Gpi 2 sono risultati espressi in tutti i tessuti analizzati:si è inoltre vista la zona ibrida inter-locus degli eterodimeri (fig ). Solamente in due individui si è trovata variabilità al locus Gpi 2: il pattern a tre bande di tali eterozigoti riflette la struttura dimerica dell enzima. 91 ph3 ph9 A/A A/A A/A GPI-1 Ibridi interloci GPI-2 A/B A/A A/B Fig Pattern di Gpi analizzato con IEF, e schematica rappresentazione di esemplari di Zosterisessor ophiocefalus. Le linee a punti indicano le zone ibride interloci, quelle in grassetto tratteggiate le zone ibride intralocus.

92 Isocitrato deidrogenasi (ICD: EC ) Due loci, ICD 1 e ICD 2, classificati, entrambi espressi in fegato; ICD 2 è risultato essere attivo anche nell occhio e nel muscolo. Anche in questo caso, nessuna variabilità è stata trovata. Malato deidrogenasi (MDH: EC ) In tutti gli individui analizzati sono state trovate nel muscolo quattro frazioni invarianti corrispondenti ai due isozimi citosolici e alla forma mitocondriale codificate dai tre loci genici: MDH-A (smdh 2),MDH-B (smdh 1) e MDH-M (mmdh). La frazione tra le due più anodiche rappresenta la zona ibrida dell eterodimero AB. In accordo con i dati bibliografici, si nota che l mmdh è espresso attivamente in tutti i tessuti mentre i due loci citoplasmatici hanno una diversa distribuzione tissutale: sono espressi entrambi i loci, 1 e 2 (ossia MDH-B e MDH-A) solo nel muscolo mentre in occhi, branchie e fegato è espresso solo il locus 2 (MDH-A). Enzima malico (ME: EC ) In tutti gli individui analizzati il pattern elettroforetico ottenuto è costituito in modo caratteristico da cinque bande. Confrontando la mobilità elettroforetica di tale enzima con quella ottenuta da MDH, come si può vedere nella figura 3.4.8, si è potuto stabilire che la frazione più anodica è il vero enzima malico, le due successive e quella meno anodica rappresentano MDH che lavora anche con NADP con debole intensità mentre la quarta frazione anodica corrisponde al secondo locus di ME (e a MDH) con forte attività sia con NAD che con NADP. Le diverse frazioni mostrano quindi differenze funzionali. 92 e l g m l e l e g m start _ e l g m l e l e g m Fig Pattern di LDH su acetato di cellulosa, e rappresentazione schematica relativa a vari tessuti di Z. ophiocefalus. Le lettere indicano i tessuti di provenienza: e, occhio; l, fegato; m, muscolo; g, branchia mentre le linee tratteggiate indicano le zone di ibridazione interloci. Lattato deidrogenasi (LDH: EC ) In Zosterisessor ophiocefalus il numero degli isozimi LDH (fig ) e la loro distribuzione tissutale corrisponde alla descrizione dei tre loci fatta abitualmente nei pesci (Basaglia, 1989). Come si vede dalla figura 3.9, le frazioni 2 e 3(da noi chiamate LDH 2 e LDH 3), espresse in tutti i

93 tessuti, rappresentano i prodotti dei loci LDH-A e LDH-B, rispettivamente. La frazione 1 (LDH 1), con alta velocità anodica, è espressa solo nell occhio e corrisponde al locus LDH-C. La frazione 4, in accordo con Farias et al,(1997), è un artefatto dato dall attività di un alcool deidrogenasi nel fegato.nessuna variante è stata osservata. Nella rappresentazione schematica di figura 3.4.5, le linee tratteggiate corrispondono a zone di ibridazione interloci. Superossido dismutasi (SOD: EC ) In tutti gli esemplari analizzati, provenienti dalla laguna veneta, si è trovato un singolo locus, attivo solamente in fegato. Non c è infatti la presenza di tale enzima negli altri tessuti (branchie, occhi, muscolo) e non si è osservata alcuna variante. X-Riduttasi NAD(P)H dipendenti I risultati per questo enzima si riferiscono a quelli ottenuti pewr lo studio dell enzima Glutatione riduttasi (GRED) NADH dipendente. Prove comparative hanno messo in luce attività enzimatica anche in presenza di NADPH e in assenza di substrato. Per questo e in attesa di più precisi accertamenti, si è ritenuto di denominare come riduttasi non identificate (X-riduttasi) le frazioni rivelate con le elettroforesi. Difficoltà sono state anche trovate per la classificazione dei quadri elettroforetici, mutevoli per intensità e numero di frazioni accessorie. In defintiva, ai fini dell analisi della struttura genetica di popolazione si è considerata valida solo una frazione, con punto isolelettrico pari, invariante in tutti gli individui. 3. Livelli di polimorfismo e suddivisione della popolazione I sistemi gene-enzima che hanno dato risultati concreti sono stati 12, per un totale di 19 loci. Nonostante l elevato numero di esemplari esaminati (484 fra le due lagune), si è trovato un livello di polimorfismo estremamente basso. La maggior parte (9) dei loci analizzati sono risultati monomorfi per la presenza di un unico allele (p = 1), indipendentemente dal criterio di polimorfismo adottato. Quindi per quanto riguarda i dati sulla variabilità genetica, la condizione monomorfa della maggior parte dei loci, semplifica il quadro poiché la presenza di un allele fissato per ogni locus comporta che l equilibrio di HW è rispettato, la frequenza genica degli eterozigoti è uguale a zero e si osserva la presenza di una sola classe genotipica. Questi risultati fanno ritenere che nella lagna di Venezia esista un unica popolazione di Z. ophiocefalus, che non presenta alcuna forma di suddivisione. 93 Fig Esempi di separazione di DNA amplificato per lo studio di loci microsatelliti. Polimorfismi in 8 loci microsatelliti (sequenze genomiche contenenti moduli di 2-5 nucleotidi ripetuti per decine di volte). 4. Analisi di marcatori nucleari microsatelliti Il lavoro d isolamento dei marcatori nucleari microsatelliti è iniziato con l allestimento di due librerie parziali genomiche arricchite l una per il repeat AC e l altra per i repeat GATA, CAG e GA. Le librerie hanno consentito di avere a disposizione un elevato numero di colonie, che sono state selezionate per la presenza dell inserto all interno del vettore plasmidico. Dalle librerie sono

94 state selezionate 288 colonie putativamente contenenti il repeat AC e 288 colonie con i repeat GATA, CAG e GA. Questo lavoro ha permesso di allestire una notevole riserva di cloni per uso futuro. In seguito alcuni cloni sono stati selezionati per i repeat microsatellite. In questo caso, dopo aver verificato tramite PCR con primer universali M13 e T7, che i cloni in oggetto contenevano effettivamente l inserto, sono stati sequenziati. Sono state realizzate 45 sequenze delle quali sono state selezionate quelle che avessero una sequenza fiancheggiante il microsatellite sufficiente per disegnare una coppia di primer. Inoltre i primer dovevano essere disposti in modo da permettere di ottenere frammenti di lunghezza di 120 e 200 paia di basi. Infine, sono state scelte 12 sequenze con repeat diversi al loro interno ed è stata disegnata una coppia di primer specifica per ogni sequenza. Le coppie di primer sono state utilizzate su un piccolo numero di individui per verificarne l efficacia di amplificazione. Nella figura sono riportati due esempi di separazione di DNA amplificato e nella tabella sono riportati il nome del locus isolato, il tipo di modulo ripetuto, e la dimensione del frammento amplificato. 94 Nome locus microsatellite Tipo di modulo ripetuto Dimensione frammento amplificato (pb) Go++2 (GT) 3 GC(GT) Go++6m13 (AC) Goac8 (AC) 5 AGCC(AC) Go++3 (GT) Goac3 ) 6 (TG) 6 CG(TG) 2 CG(TG 121 Go++2m13 T) 6 (TCC)TCT(TCC) 4 (TC 127 Go++22m13 (AC) Go++34m13 (AC) Go++37m13 (TGC) Go++26m13 (AC) Go++16m13 (GT) Go++32m13 (AC) Tab Nome del locus microsatellite, tipo di modulo ripetuto e dimensione frammento amplificato Per l analisi di popolazione, sono stati utilizzati i loci polimorfi in almeno un campione di popolazione, per complessivi nove loci microsatelliti. Il criterio utilizzato è quello del 1%: per questo sono stati scartati i loci Go++2 e Goac8, monomorfi nei campioni di entrambe le lagune. Nel complesso, nei campioni della laguna di Venezia è stato osservato un maggior numero di alleli rispetto a quello di Marano-Grado, in relazione anche alla diversa numerosità dei campioni. Tuttavia va segnalato che quelli che mancano sono di solito alleli rari, mentre sono sempre condivisi gli alleli frequenti. In figura, a titolo di esempio, le frequenze geniche nei campioni

95 frequenza allele frequenza allele raccolti in cinque siti della laguna di Venezia, distinte per singolo campionamento e, di seguito, un riassunto delle situazione per zona e campionamento. A Venezia: Per il locus Go++37m13 sono stati individuati 14 alleli tra tutti gli individui campionati e la frequenza dell allele più comune raggiunge al massimo il valore di 0,92 per il campione di Chioggia nel mese di Aprile dell anno Il locus Go++26m13 ha un elevato grado di polimorfismo, presentando 12 alleli; l allele più comune ha frequenza massima di 0,5 nel campione di Chioggia dell Aprile Il locus Go++32m13 presenta 10 alleli, di cui il più frequente con valore 0,90 riscontrato negli individui campionati nella stazione di Lago dei Teneri nel Novembre Il locus Go++16m13 presenta 13 alleli, di cui il più frequente con frequenza di 0,78 riscontrato nel campione di Lago dei Teneri dell Ottobre Frequenze alleliche del locus Go++26m13 allele % allele 11 allele 10 80% allele 9 60% 40% allele 8 allele 7 allele 6 20% 0% allele 5 allele 4 allele 3 allele 2 campioni allele 1 Frequenze alleliche del locus Go++37m13 allele 14 allele % 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% campioni allele 12 allele 11 allele 10 allele 9 allele 8 allele 7 allele 6 allele 5 allele 4 allele3 allele 2 allele 1 Fig Distribuzione delle frequenze geniche di due loci microsatelliti polimorfi in Z. ophiocephalus della Laguna di Venezia. Per facilitare la lettura dei grafici, ad ogni campione, distinto per località e data di raccolta, è stato assegnato un numero: Chioggia (05/11/01) = 1; Chioggia (26/11/01) = 2; Lago dei Teneri (25/10/01) = 3; Lago dei Teneri (27/11/01) = 4; Lido (29/10/01) = 5; Lido (30/11/01) = 6; Ca Zane (22/11/01) = 7; Chioggia (13/03/02) = 8; Chioggia (03/04/02) = 9; Lago dei Teneri (26/03/02) = 10; Lido (16/04/02) = 11; Ca Zane (18/04/02) = 12; Ca Zane (22/05/02) = 13; Marghera (20/03/02) = 14. A Marano-Grado:

96 I loci Go++2, Go++6m13, Goac3 e Goac8 hanno presentato un solo allele. Il locus Go++2m13, che ha mostrato due alleli, è polimorfo secondo il criterio permissivo dell 1%. Il locus Go++3 possiede quattro alleli, quello più comune con una frequenza pari a 0,89. Il locus Go++16m13 è quello che ha mostrato più alleli: nove, Il locus Go++26m13 mostra otto alleli; i più rappresentati sono due e la frequenza del più comune è circa 0,40. Il locus Go++22m13 ha cinque allele, il più diffuso con frequenza 0,39. Il locus Go++37m13 risulta possedere cinque alleli e il più diffuso ha frequenza 0,76. Per il locus Go++32m13 sono stati rilevati otto alleli, il più comune dei quali ha frequenza 0,67. In tutti i casi è rispettato l equilibrio di Hardy-Weinberg, valutato con l applicazione del test esatto. Allo stesso tempo, le valutazioni statistiche effettuate con le correzioni di Fisher portano a ritenere che tutti i loci microsatellite di tutti i campioni rispettino la condizione di linkage equilibrium. Utilizzando le frequenze geniche, si sono calcolati i parametri più indicativi del livello di polimorfismo. La Tabella riporta i valori della popolazione di Venezia ottenuti considerando i dati ottenuti come rappresentativi di un unico campione. 96 P (5%) P (1%) A H oss H att SAm 0,55 0,64 4,09 0,29 0,28 VEt 0,55 0,73 6,73 0,30 0,30 Tab Livelli di polimorfismo dei microsatelliti in Marano-Grado (SAm) e Venezia (VEt). Per ogni campione di popolazione nella tabella sono indicati i seguenti parametri che stimano i livelli di polimorfismo: la proporzione di loci polimorfi (P) secondo il criterio del 5% e dell 1%, il numero medio di alleli per locus (A) e la frequenza media degli eterozigoti osservata (H oss ) e attesa (H att ). Nel caso dei campioni di in Z. ophiocephalus della Laguna di Venezia si è provveduto all analisi statistica AMOVA, per valutare eventuali relazioni fra struttura genetica della popolazione e fattori spaziali, temporali, e biologici (sesso, età). Per questo i dati ottenuti sono stati organizzati in gruppi in modo da avere, di volta in volta, una relazione gerarchica (a n livelli). Nella Figura è illustrata l organizzazione a due livelli, non considerando l elemento superiore (OP), in funzione dei cinque siti di raccolta (in sigla CH, LT, LD, CZ, PL per Chioggia, Lago dei Teneri, Lido, Ca Zane e Ponte della Libertà, rispettivamente). L ultima riga riferisce dei singoli campionamenti. In questo modo sono stati stimati gli indici di fissazione e valutato il grado di suddivisione della popolazione lagunare. POP CH LT LD CZ PL

97 Fig Esempio di struttura gerarchica dei dati a più livelli per il calcolo degli indici di fissazione secondo AMOVA. Criterio di gerarchizzazione spaziale: 5 siti di raccolta. In tabella sono riportati i valori degli indici F, assieme alle probabilità associate, ottenuti per questa elaborazione. In tutti i casi, si sono ottenuti indici di fissazione estremamente bassi e probabilità associate molto elevate. Pertanto, risultati indicativi di scostamenti del tutto casuali. 97 Fs t - 0,0027 *,69 P Fs c 0-0,0011 *,69 P Fc t 0-0,0016,81 P 0 Tab Indici di fissazione relativi alla divisione della popolazione per stazioni di campionamento (indici F) (* probabilità di trovare un indice di fissazione maggiore o eguale al valore osservato per effetto del caso) Fa eccezione il confronto effettuato dividendo gli individui maschi delle diverse zone di raccolta per classi di età; la separazione degli individui in classi di età considera la lunghezza totale (in cm) del pesce e raggruppa tutti gli individui che hanno un certo intervallo di lunghezza nella classe di età appropriata. In tabella sono riportati gli intervalli di lunghezza per ogni classe di età Classe di età Intervallo di lunghezza (TL) 1 anno 6,0 13,4 cm 2 anni 9,9 19,6 cm 3 anni 17,0 22,5 cm Tab Intervalli di lunghezza per classi di età Nella suddivisione degli individui maschi, non sono stati considerati quegli individui che potrebbero essere inclusi in due classi di età a causa della loro lunghezza totale (dai 9,9 cm ai 13,4 cm; dai 17 cm ai 19,6 cm). Il valore dell indice di fissazione Fct ottenuto con questo tipo di confronto è di con probabilità associata del 39%, questo valore non indica una differenza significativa. Per approfondire questo dato, sono stati quindi generati tre gruppi di maggiore numerosità, riunendo campioni di individui maschi della stessa classe d età (Fig ). Per questo confronto si è ottenuto un indice Fst di 0,0074 con probabilità associata del 10%. Il fatto che questo valore positivo abbia una probabilità di essere osservato per caso marginale anche se non significativa, è stato ulteriormente indagato mediante confronti a coppie. POP CLASSE 1 CLASSE 2 CLASSE 3 Fig Struttura gerarchica dei dati a un livello per il calcolo degli indici di fissazione secondo AMOVA. Criterio di gerarchizzazione: classi di età Si è proceduto allora al confronto tra coppie di gruppi di individui maschi della stessa classe d età. In tabella sono riportati i valori degli indici Fst per coppie di popolazioni (in grassetto

98 sono evidenziati i valori con probabilità minore del 1,67%, corrispondente al valore del 5% corretto mediante Bonferroni per i 3 test svolti). N Classe 1 Classe2 Classe3 18 Classe 1 0, Classe 2-0, Classe 3 0,0086 0,0287 0,0000 Tabella Valori indici Fst per coppie di popolazioni Da questa analisi si può dedurre che vi possono essere differenze significative tra maschi di classe di età differente. Infine, se si calcola il test di Fisher per le probabilità associate agli Fst a coppie, si ottiene un valore di probabilità significativo (2.7%, 6 g.d.l.). Questo valore indica che le differenze tra classe 2 e classe 3 sono così forti da permettere di rigettare globalmente l ipotesi zero di omogeneità; si tratta quindi di un test con un significato simile a quello Fst, che aveva fornito una probabilità del 10% (associata al valore di 0,0074). I due diversi approcci forniscono quindi risultati comparabili nel rigettare l omogeneità tra campioni, anche se le probabilità associate sono in un caso significative, nel secondo marginali. 5. Caratterizzazione biochimica e analisi dell'integrità strutturale del DNA mediante test Cometa (elettroforesi di cellule singole). Il test cometa è stato dapprima applicato a Zosterisessor ophiocephalus in uno studio eseguito in condizioni controllate (esposizione in acquario), utilizzando un tessuto, il sangue, in cui le cellule si trovano già in sospensione e quindi non c erano elevati rischi di creare situazioni artefatte. Quindi si è applicato il test in un indagine in campo, estendendo le analisi alla misura dei livelli delle Monossigenasi Miste Microsomiali epatiche (MFO) e in particolare del Cyt P450 (indotto per es.da PAH e PCB) nel tessuto epatico. L elaborazione dei dati di danno al DNA e di induzione di MFO (CytP450) in Z. ophiocephalus è stata integrata con i dati relativi a lunghezza, lunghezza standard, peso e peso del fegato. Dall insieme dei dati emerge una situazione di danno diffuso, con valori maggiori nelle zone caratterizzate da più alti valori di inquinamento. Inoltre è stato registrato un significativo incremento delle attività degli enzimi preposti ai processi di detossificazione da agenti xenobiotici. 6. Confronto tra specie diverse di gobidi mediante marcatori mitocondriali Un ultima serie di risultati ottenuti è la messa a punto di un metodo per confrontare diverse specie di gobidi presenti nella laguna di Venezia con la specie Zosterisessor ophiocephalus in modo da riuscire a distinguerla dalle altre: Gobius cobitis, Gobius niger, Knipowitschia panizzae, Pomatoschistus marmoratus, Pomatoschistus canestrinii e Pomatoschistus minutus. Il frammento di mtdna codificante per la subunità ribosomale 16S di alcuni individui, appartenenti a specie differenti di gobidi, è stato amplificato con l utilizzo di primer specifici per il gene 16S rrna mt dei gobidi. I primer sono stati disegnati dopo l allineamento di tutte le sequenze 16S rrna mt delle sette specie di gobidi in studio: Gobi16SF 5 -TTTAACGGCCGCGGTATT-3 Gobi16SR 5 -TAATAGCGGCTGCACCATTAG-3 Dato che lo scopo dello studio era di differenziare la specie Zosterisessor ophiocephalus rispetto alle altre, si è proceduto alla digestione dei frammenti amplificati con l enzima di restrizione AluI, che ha prodotto in ogni specie frammenti di dimensioni differenti facilmente separabili in gel di poliacrilamide. La reazione di restrizione è avvenuta a 37 C per un ora. 98

99 Per ogni specie è riportata la lunghezza dei frammenti di restrizione, espressa in paia di basi (bp): Zosterisessor ophiocephalus: 38, 69, 102, 108, 175 (bp) Gobius cobitis: 175, 314 (bp) Gobius niger: 83, 91, 148, 176 (bp) Knipowitschia panizzae: 150, 163, 175 (bp) Pomatoschistus marmoratus: 44, 83, 92, 107, 163 (bp) Pomatoschistus canestrinii: 83, 92, 151, 163 (bp) Pomatoschistus minutus: 83, 92, 151, 163 (bp) Le specie Pomatoschistus canestrinii e Pomatoschistus minutus presentano lo stesso profilo di restrizione, ma l intento era di differenziarle dalla specie Zosterisessor ophiocephalus che ha un profilo di restrizione diverso da tutte le sette specie di gobidi a cui è comparato. 7. Considerazioni riassuntive finali Lo studio della variabilità genetica di sistemi gene-enzima e di loci microsatellitari in Zosterisessor ophiocephalus ha portato a osservare un basso livello di polimorfismo. Ciò è da mettere in relazione con l origine delle popolazioni delle lagune nord-adriatiche di questo gobide. Il calcolo dell età della popolazione, sulla base dei tassi di mutazione propri dei loci microsatellitari, coincide con un insediamento associabile al periodo post-glaciazione di anni fa. Il minore tasso di mutazione dei loci enzimatici giustifica i due livelli di polimorfismo osservati. Su queste basi non si hanno significativi fenomeni di erosione genetica. La statistica degli indici di fissazione, elaborata applicando numerosi criteri di organizzazione dei dati, porta a considerare la popolazione di Z. ophiocephalus della laguna di Venezia come unica, senza alcuna suddivisione o frammentazione, nonostante il comportamento territoriale della specie. Oltre che con la distribuzione passiva della larve, un simile risultato è da attribuire alle complesse strategie riproduttive, che prevedono a maschi territoriali (parentali), maschi mobili (sneaker, in grado di fecondare uova deposte in diversi nidi), e la mobilità delle femmine. Tuttavia, le differenze genetiche fra maschi di classi di età diverse indicano che sussistono anche fenomeni di micro-differenziazione temporale, associati probabilmente al reclutamento, meritevoli di ulteriori approfondimenti L omogeneità genetica complessivamente osservata porta a ritenere Z. ophiocephalus sia un buon indicatore, in grado di riflettere gli effetti negativi a livello individuale dell inquinamento. In questa maniera vengono rafforzati i risultati ottenuti con le analisi biochimiche e i test Cometa, che mettono in luce un diffuso effetto degli inquinanti, con massimi nelle zone più alterate Pubblicazioni prodotte Bisol P.M., 2002 Ecogenetic biodiversity in Zosterisessor ophiocephalus from the lagoon of Venice: I Gene-enzyme polymorphisms Scientific research and safeguarding of Venice. P.P. Campostrini (ed.),.istituto Veneto SSLLAA, Venezia, La Garangola (PD), pag Bisol P.M., Lo studio della biodiversità per un equilibrio fra conservazione e sfruttamento in laguna di Venezia. Secondo convegno annuale CoRiLa Bisol P.M., Prevedello S., Rianna E., A. Gallini, L. Zane, Ecogenetic biodiversity in Zosterisessor ophiocephalus from the lagoon of Venice: III. Allozymes population analysys. (manuscript in preparation, 2004) Bisol P.M., Franco A., Gallini A., Rianna E., Prevedello S., Zane L., 2004 Biodiversity at the population level in the Venice lagoon: a polymorphism analysis of Zosterisessor ophiocephalus. Inviato per partecipazione a Lagoons and coastal wetlands in the global change context: impacts and managemant issues.venezia aprile Gallini A., Zane L., Bisol P.M, Isolation and characterization of microsatellites in Zosterisessor ophiocephalus (Perciformes, Gobiidae)Atti Secondo convegno annuale CoRiLa, in stampa. 99

100 Gallini A., Zane L., Campagnolo P., Rianna E., Bisol P.M, Ecogenetic biodiversity in Zosterisessor ophiocephalus from the lagoon of Venice: II Microsatellites population analisys. (submitted to J. Exp. Mar. Biol. Ecol.) Tallandini L., Poletti S., Varotto A., Pivotti L., P.M. Bisol, Field investigation in the lagoon of Venice by early biomarkers and allozyme survey. ESCPB 22 nd European Society of Comparative Physiology and Biochemistry. Alessandria-Italy, Dec 15-19, Tallandini L., Varotto A., Pivotti L., Biodiversità nella laguna di Venezia: risposte differenziali di biomarkers molecolari in Zosterisessor ophiocephalus. Secondo convegno annuale CoRiLa Venier P., Bisol P.M., 2002 Biodiversità nella Laguna di Venezia: relazioni fra variabilità genetica, danno genetico e inquinamento. - Comunicazione a III Convegno Nazionale delle Scienze del Mare Bari nov.2002 Venier, P, Tallandini, L and Bisol, P.M, 2003 Characterization of coastal sites by applying genetic and genotoxicity markers in Mytilus galloprovincialis and Tapes philippinarum Chemistry and Ecology 19: Zane L., A. Gallini, S. Prevedello, P.M. Bisol. Biodiversità nella laguna di Venezia a livello di popolazione: polimorfismi genetici in Zosterissessor ophiocephalus. Presentazione al secondo convegno annuale CoRiLa Zane L., Gallini A., Campagnolo P., Rianna E. Bisol P.M.: Analisi della variazione spaziole e temporale nella biodiversità a livello genetico di Zosterisessor ophiocephalus (Perciformes, Gobidae), nella laguna di Venezia: uno studio mediante microsatelliti. XIII Convegno Societa Italiana di Ecologia, Como, Sett. 8-10, 2003 Tesi di laurea Campagnolo P. (Relatore L. Zane),2002/2003 Tesi di Laurea in Biotecnologia, Università di Padova Analisi mediante marcatori microsatelliti di Zosterisessor ophiocephalus della Laguna di Venezia. Gallini A.(Relatori Bisol P.M. e Venier P.), 2002/2003Tesi di Laurea in Scienze Biologiche,Università di Padova:Biodiversità a livello molecolare in Zosterisessor ophiocephalus nella laguna di venezia Poletti S. (Relatore L. Tallandini), 2002/2003. Tesi di laurea in Scienze Biologiche, Università di Padova: Effetti da esposizione subacuta a Cd++ in globuli rossi di pesce. Valutazione del danno citotossico e genotossico Prevedello S. (Relatori Bisol P.M. e Venier P.), 2001/2002. Tesi di laurea in Scienze Biologiche, Università di Padova: Analisi di Polimorfismi nel bivalve Mytilus galloprovincialis e nel teleosteo Zosterisessor ophiocephalus della laguna di Venezia Rianna E. (Relatori Bisol P.M., Venier P. e L. Zane), 2002/2003. Tesi di Laurea in Scienze Biologiche, Università di Padova: Biodiversità in Zosterisessor ophiocephalus di due lagune dell Alto Adriatico Bibliografia di riferimento Avise, J.C. (1994) Molecular markers, natural history and evolution. Chapman & Hall, New York. Battaglia, B., Bisol, P.M., Fossato, V.U., Rodinò, E. (1980) Studies on the genetic effects of pollution in the sea. Rapports et procès verbaux des rèunions. Commission international pour l exploration scientifique de la Mer Mèditèranèe 179: Belfiore, N.M. & Anderson, S.L. (2001) Effects of contaminants on genetic patterns in aquatic organisms: a review. Mutation Research 489: Benham, J.J. (2001) Genographer Version Montana State University, Bozeman, Montana. Brambati, A. (1996) Metalli pesanti nelle Lagune di Marano e Grado. Regione Autonoma Friuli- Venezia Giulia. Direzione dell Ambiente Servizio dell Idraulica. Trieste. Critto, A. & Marcomini, A. (2001) Rischio ecologico e inquinamento chimico lagunare. Libreria Editrice Cafoscarina Pscrl. Milano. 100

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102 3.6 Argomento 5 (Caratterizzazione genomica/genica) Composizione unità operativa Elenco di ricercatori e tecnici Cognome nome Istituto di appartenenza Venier Paola Dip Biol UniPD Elenco di studenti (tesi, PhD, ecc.) Cognome nome Istituto di appartenenza Toniolo Nicola Dip Biol UniPD Moro Elena Dip Biol UniPD Varotto Laura Dip Biol UniPD Obiettivi Fattori di varia natura, e principalmente dovuti all intervento umano, possono determinare cambiamenti ambientali tali da influire negativamente sulla vita degli organismi lagunari, sulla struttura delle popolazioni locali e sulla stabilità dell ecosistema. Riduzioni del numero, della varietà e della potenziale variabilità degli organismi lagunari possono definire una diminuzione, anche irreversibile, della biodiversità complessiva della Laguna di Venezia. In generale, lo sviluppo di conoscenze sul genoma di organismi lagunari, e in particolare sui geni espressi in condizioni normali e in risposta a fattori nocivi, può fornire strumenti molecolari per l identificazione rapida di specie affini, contribuire alla comprensione delle risposte biologiche indotte da stress, e fornire in tempo utile informazioni essenziali per azioni di recupero ambientale e per il controllo d origine dei prodotti della pesca destinati all alimentazione umana. Pochi sono gli organismi per i quali le conoscenze genetiche sono complessivamente ad uno stadio avanzato (D. melanogaster, D. rerio, T. rubripes, giusto per citare alcune specie modello). La consultazione delle banche dati relative alle sequenze di DNA e proteine nel caso di Zosterisessor ophiocephalus e Mytilus galloprovincialis, due specie di riferimento per l ambiente lagunare veneziano, nel 2001 indicava la quasi assenza di informazioni per il primo (rispettivamente 3 e 2 sequenze) e la presenza di un numero esiguo di sequenze per il secondo (apparentemente circa 200 e 100 sequenze ma molto ridondanti tra loro). Perciò, obbiettivo della linea di ricerca è stato quello di mettere a punto metodi di indagine genomica per avviare l identificazione di geni attivamente trascritti in mitilo e go, così da migliorare la base di conoscenza per l interpretazione delle risposte biologiche indotte da cambiamenti ambientali in queste specie e, attraverso queste, migliorare il quadro conoscitivo dell ambiente lagunare Attività preliminari Aggiornamento bibliografico e metodologico. Avvio o consolidamento di collaborazioni, prima delle quali è quella con il CRIBI (rif. G. Lanfranchi). La consultazione del sito di rete (http://grup.cribi.unipd.it) rende evidenti know-how e strumentazione che sono risultati disponibili ai fini degli obiettivi descritti Attività in campo ed in laboratorio L attività sperimentale si è svolta prevalentemente in laboratorio, presso il Dipartimento di Biologia e il CRIBI (Uni-PD). Da mitili e pesci è stato isolato l RNA totale usando una soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato; di seguito, l RNA messaggero poliadenilato è stato purificato per cromatografia di affinità su colonna di oligo-dt cellulosa. L mrna è stato trasformato in vitro in cdna (molecole di DNA ciascuna copia complementare di singole molecole di RNA messaggero) usando enzimi quali la Trascrittasi inversa, Ribonucleasi H, la DNA polimerasi I e la DNA ligasi. Il cdna a doppia elica è stato legato al vettore plasmidico pcdna II e in questa forma introdotto per

103 trasformazione in batteri competenti E. coli. In questo modo sono state definite sia per mitilo che per go librerie primarie di cdna. I dettagli usati nel protocollo hanno reso disponibili frammenti di geni trascritti in mrna (Expressed Sequence Tags) specifici per la regione terminale all estremità 3 dei geni trascritti. Di seguito, la libreria di cdna è stata piastrata in solido, gli inserti di cdna amplificati mediante PCR, controllati su gel elettroforesi e sottoposti a sequenziamento sistematico. Le sequenze di adeguata qualità sono infine state sottoposte a confronto di similarità con le sequenze esistenti nelle banche dati pubbliche per identificare geni mai prima caratterizzati nelle specie lagunari citate. Sulla base di questo lavoro è stato quindi definito per M. galloprovincialis un microarray di cdna, collezione di cdna stampata su vetrino in modo opportuno e utile per analizzare i trascritti (mrna) provenienti da mitili in diverse condizioni funzionali e di sviluppo. Lo sviluppo logico del lavoro così avviato è riportato di seguito. Dissezione e congelamento di tessuti rappresentativi con modalità opportune Estrazione dell RNA totale e purificazione della popolazione eterogenea di molecole di mrna poliadenilate per affinità su oligo dt-cellulosa Sintesi del cdna e inserimento in vettore opportuno (copia in DNA con trascrittasi inversa, digestione dell RNA e sintesi della seconda elica di DNA, clonaggio unidirezionale in plasmide pcdnaii) Inserimento dei vettori così modificati in batteri competenti (trasformazione per elettroporazione) Piastramento dei batteri a diluizione opportuna, trasferimento di singole colonie in pozzetti da micropiastra e crescita dei cloni batterici Amplificazione diretta, da ogni lisato batterico, degli inserti di cdna con primer universali Analisi e selezione degli amplificati per gel elettroforesi Sequenziamento sistematico degli amplificati che rappresentano bande singole di dimensione opportuna Analisi bioinformatica (analisi di qualità delle sequenze singole, raggruppamento e assemblaggio delle sequenze ridondanti, ricerche di similarità in banche dati pubbliche, annotazione e tabulazione dei risultati raggiunti) Messa a punto di saggi basati su PCR e/o DNA microarray per individuare e caratterizzare geni la cui espressione è modulata tipicamente da variazioni ambientali critiche Nella prima fase del lavoro, sono stati confrontati diversi metodi e kit commerciali per la purificazione di DNA genomico ed RNA totale da organismi lagunari (molluschi e pesci). Per quanto riguarda l isolamento dell DNA genomico, diversi tra i protocolli disponibili (basati su lisi cellulare, denaturazione delle proteine con un anfolita e solventi organici, come il fenolo e il cloroformio, e separazione finale delle fibre di DNA in fase acquosa) offrono potenzialmente una buona resa di DNA macromolecolare. Tuttavia in mitilo non deve essere sottovalutata la complessità di composizione di tessuti come la ghiandola digestiva ne l esiguità di altri tessuti come l emolinfa. D altro canto, l instabilità intrinseca dell RNA rende cruciale adottare protocolli ed accorgimenti di dettaglio che garantiscano sia un alto grado di purificazione che la massima rappresentatività nel campione purificato della popolazione eterogenea di molecole di RNA. Tra i vari protocolli presi in considerazione, quello basato sulla omogeneizzazione rapida e lisi del tessuto in una soluzione monofasica di isotiocianato di guanidina e fenolo è stato ritenuto preferibile rispetto all isolamento su colonnine di silice in assenza di fenolo sia per purezza del purificato che per praticità e rapidità di esecuzione. Il tipo di protocollo infine adottato è risultato competitivo anche rispetto ad un kit commerciale che prevedeva l isolamento finale dell RNA per centrifugazione in cesio trifluoroacetato. 103

104 La Fig indica come gli RNA messaggeri cellulari, molecole eterogenee e instabili prodotte in un certo momento funzionale, possano essere copiati in DNA e fornire una collezione stabile di informazioni (nel caso specifico, le sequenze 3 EST sono tratti di DNA che identificano univocamente all estremità 3 singoli trascritti genici, sono clonate in vettore plasmidico e mantenute fisicamente in ospite batterico; il sequenziamento di una EST fornisce la successione di nucleotidi di quel tratto di DNA). DNA mrna cdna libreria di cdna 104 Proteine (equilibrio funzionale in condizioni normali ed in risposta agli stimoli ambientali) Fig Produzione di molecole di DNA complementari a singole molecole di RNA messaggero. La popolazione di mrna, eterogenea in varietà e abbondanza, viene stabilizzata in frammenti di DNA complementare che costituiranno una collezione o libreria di sequenze geniche) Elaborazione Lo schema seguente (Tab ) sintetizza i risultati complessivamente ottenuti (anche mediante collaborazioni esterne al CoRiLa) per mitilo e go. Da esso emerge la mole del lavoro finora sviluppato e la rigorosità del trattamento elettronico dei dati. Quest ultima, basata sull uso di software opportuni, ha infine prodotto una collezione affidabile di EST e, conseguentemente, una collezione affidabile di sequenze consenso di singoli trascritti (cluster di EST individuanti uno stesso trascritto definiscono una sequenza consenso, ovvero la sequenza che viene infine sottoposta ad analisi BLAST di similarità). Tab Elaborazione elettronica delle EST mediante ESTRAI 1, ESTRAI 2, BLAST-CAP3 M. galloprovincialis Z. ophiocephalus EST sequenziate EST clusterizzabili Cluster risultanti Risultati ottenuti La Tab elenca una selezione di EST di mitilo che identificano putativamente geni specifici. Fra essi è interessante la presenza di geni per l adesione e la motilità, per funzioni difensive (peptidi antimicrobici, proteine heat-shock e metallotioneine) e per funzioni fondamentali della cellula. La serie completa di EST disponibili per mitilo è già stata registrata presso l NCBI (conditional submission) e diventerà disponibile alla pubblicazione del manoscritto relativo sia alla produzione di EST che alla definizione del cdna microarray. Per il go la registrazione e la stesura del manoscritto relativo sono in corso al tempo di questo rapporto scientifico. Rispetto ai dati di sequenza inizialmente disponibili per mitilo e go, si tratta di un consistente aumento di conoscenza, utilizzabile nel prossimo futuro per indagare geni specifici e mettere a punto nuovi indicatori e indici basati sui profili trascrizionali. Proprio la definizione del cdna microarray di mitilo rappresenta il primo risultato di grande importanza applicativa del lavoro effettuato (i principi della sua applicazione sono illustrati nella Fig ).

105 Ogni vetrino prodotto porta stampati due array, cioè due serie ordinate di campioni di cdna, rappresentativi di trascritti individuali di mitilo. Ogni array è strutturato in 16 sub-array ed è costituito da 3516 spot aventi µm di diametro (campioni di cdna depositati su vetrino) i quali rappresentano EST in duplicato. Fra loro, gli spot distano 265 µm ed i subarray distano 450 µm. Su vetrini come quello descritto l ibridazione preliminare di campioni di RNA, retrotrascritti e marcati con fluorocromi come indicato in Fig sta fornendo risultati interessanti. Nel caso di mitili trattati in laboratorio con inquinanti di tipo diverso, metalli pesanti e composti organici tossici, si osserva una diversa modulazione dell espressione genica in tessuti importanti quali ghiandola digestiva e tessuto branchiale. Nei primi esperimenti effettuati, particolarmente informativa pare essere la ghiandola digestiva con molti geni differenzialmente espressi sia nel trattamento con metalli che nel trattamento con organici, tessuto che oltretutto mette in luce circa un centinaio di geni discriminanti tra i due trattamenti (la modulazione dell espressione genica può far individuare e classificare diversamente tipi di esposizione diversi). I risultati di dettaglio di questa ultima parte del lavoro sono in elaborazione. 105

106 106 Collezione di geni mrna di riferimento (mitili normali) mrna da analizzare eccitazione dei (mitili dopo stress) fluorocromi mediante luce laser Laser 1 Laser 2 Amplificazione PCR e purificazione Deposizione robotizzata dei cdna Marcatura dei cdna con fluorocromi diversi Emissione di luce Ibridazione tra cdna marcato e cdna depositato sull array Identificazione dei geni espressi in modo differente tra il DNA di riferimento e quello da analizzare Analisi comparativa tra le due emissioni di luce Fig.3.6.2: Il cdna dei geni d interesse viene amplificato mediante PCR e purificato, successivamente una piccola aliquota ( 5 nl) viene depositata su un classico vetrino portaoggetti da microscopia ricoperto da sostanze che si legano al DNA. Questa deposizione è effettuata da un robot ad alta velocità e le macchie (spot) distano tra di loro circa 200 m. Questa collezione di geni così stampata (microarray) può essere utilizzata per rilevare le variazioni dell espressione genica tra mitili di riferimento e mitili sottoposti a stress (contaminati o esposti ad altri fattori nocivi). Infatti dai due campioni da confrontare, il rispettivo mrna viene retrotrascritto, marcato con due diversi coloranti fluorescenti ed ibridato con i cdna depositati sull microarray. Dopo la reazione di ibridazione il DNA che non ha trovato l omologo fissato sul vetrino viene lavato via, in seguito si procede alla rilevazione del DNA ibridato tramite scansione della luce emessa da ogni singolo spot dopo eccitazione dei coloranti fluorescenti con due diverse luci laser. Dal confronto dell intensità tra le due luci emesse si possono evidenziare le differenze di espressione per ogni gene analizzato.

107 107 Funzione genica Actin vitelline coat lysin M7 Twitchin precollagen-d antimicrobial peptide precursor myticin A acrosomal major protein M3 sex male mitochondrial D-loop ATP synthase A chain (Protein 6) metallothionein 10IV adhesive plaque matrix protein 2 precursor beta tubulin alpha tub 2 arginine kinase histone H3 neurofilament protein NF70 myosin: regulatory light chain myosin: essential light chain heat shock protein 70 proliferating cell nuclear antigen elongation factor 2 (EF-2) proteosome PSMB5/8 protein ADP-ribosylation factor 2 elongation factor 1-BETA zinc finger protein 228 heat shock protein HSP 90-beta translation initiator factore EIF-2B beta subunit initiation factor 5A H2A histone family, member Z; H2AZ histone RNA binding motif protein 8 nucleoside-diphosphate kinase acyl-coenzyme A dehydrogenase ficolin A Profilin mitochondrial F1 complex, O subunit prefoldin 4 serine/threonine kinase 22B nucleolar protein family A, member 2 NHP2 non-histone chromosome protein 2-like 1 ATP-dependent RNA helicase A techylectin-5a ependymin related protein-1 precursor transcription factor BTF3a calmodulin (CaM) vitelline membrane outer layer protein I precursor ID della sequenza presente in banca dati AF D14731 AB AF AF JX0348 AF Q00224 AJ Q25464 X79469 X79468 BAA95610 M17876 S C AAB02928 AAD31042 NP_ Q90705 AAL74417 NP_ P34826 NP_ P34058 Q90511 P10160 NP_ AAF37551 CAD37041 NP_ NP_ P18320 NP_ NP_ XP_ NP_ NP_ O70133 BAA84188 Q9UM22 JC1235 P11120 P41366 Tab : Similarità significativa di una selezione di EST di mitilo con sequenze registrate presso NCBI. In grassetto le poche sequenze di Mytilus (Da Venier et al., Gene, 314C: 29-40).

108 108 Qui di seguito la descrizione strutturale del MYTarray 1.0 (prima versione). In sintesi, a partire da RNA isolato da tessuti rappresentativi di Z. ophiocephalus e M. galloprovincialis sono state preparate librerie primarie di cdna specie-specifiche il cui sequenziamento sistematico ha consentito di avviare ricerche di similarità con le sequenze pubblicamente disponibili per altre specie (acidi nucleici e proteine). In questo modo sono stati identificati alcuni geni di mitilo e definite molte identità putative per geni mai sequenziati finora in mitilo e go. Un certo numero di sequenze EST sia di mitilo che di go non ha mostrato similarità significative con le sequenze disponibili nei database pubblici; questo ultimo gruppo di dati rimane di per sé il più affascinante poiché potenzialmente include geni la cui espressione può spiegare le specificità funzionali più interessanti delle specie citate (es. l incredibile contrazione dei muscoli adduttori o la forza collante dei filamenti di bisso in mitilo). Questo approccio sperimentale ha aperto una direzione finora non praticata: lo sviluppo di conoscenze fondamentali per la comprensione della biologia di specie lagunari importanti e per la formulazione di spunti applicativi. La definizione e validazione preliminare del primo cdna microarray di mitilo a scala genomica costituisce solo un primo esempio delle applicazioni possibili e consolida i risultati finora raggiunti Pubblicazioni prodotte ARTICOLI PER ESTESO: Venier P., A. Pallavicini, B. De Nardi, G. Lanfranchi (2003) Towards a catalogue of genes transcribed in multiple tissues of Mytilus galloprovincialis. Gene, 314C, Venier P. et al., Gene identification and expression profiling in mussels (manuscript in preparation, 2004) Venier et al., Expressed Sequence tags in Zosterisessor ophiocephalus (manuscript in preparation, 2004) ATTI A CONVEGNO: Venier P., C. De Pittà, F. Marsano, A. Pallavicini, A. Viarengo, N. Vitulo and G. Lanfranchi (2003) Genome-wide identification of expressed sequence tags in Mytilus galloprovincialis. 33 EEMS, Aberdeen (UK), August 24.28, p. 121 (invited communication) GIA INVIATO COME ALLEGATO ELETTRONICO Venier P., C. De Pittà, F. Marsano, A. Pallavicini, A. Viarengo, N. Vitulo and G. Lanfranchi (2003) A genome-wide project in Mytilus galloprovincialis for controlling marketable stocks and coastal pollution watching. 5 FISV meeting, Rimini, October p. 86 (invited communication). GIA INVIATO COME ALLEGATO ELETTRONICO Venier P., De Pittà C., Marsano F., Pallavicini A., Viarengo A., Romualdi C., Lanfranchi G. (2003) Gene cataloguing and preliminary gene expression profiling from multiple tissues of normal and stressed mussels (Mytilus galloprovincialis) ESCPB 22 nd Annual Conference, Biological effects of pollutants: the role of environmental genomics and proteomics, Alessandria, December p. 65. GIA INVIATO COME ALLEGATO ELETTRONICO Venier P., De Pittà C., Marsano F., Pallavicini A., Viarengo A., Romualdi C., Lanfranchi G. (2004) Gene identification and expression profiling in Mytilus galloprovincialis: a new tool for basic and applied research. VI Incontro Scientifico Società Italiana di Immunobiologia Comparata e dello Sviluppo, Padova, Febbraio, p 25. GIA INVIATO COME ALLEGATO ELETTRONICO Venier P., De Pittà C., Marsano F., Pallavicini A., Viarengo A., Romualdi C., Lanfranchi G. (2004) Massive gene identification and expression profiling in mussels: a pioneering index for coastal biomonitoring. Int. conference Lagoons and coastal wetlands in the global change context. Impacts and management issues. Venice, April 26-28, p.da AVVENIRE PROCEEDINGS: Venier P., A. Pallavicini, G. Lanfranchi (2002) Identification of transcribed genes in Mytilus galloprovincialis and Zosterizessor ophiocephalus. In: IVSLA/CORILA. Scientific research

109 and safeguarding of Venice. Corila Research Program, 2001 Results, (Venice, 4-5/4/2002). pp GIA A DISPOSIZIONE Venier P., Pallavicini A., De Pittà C., Lanfranchi G. (2003) Identification of actively transcribed genes in reference organisms of the Venice lagoon: Zosterisessor ophiocephalus. Secondo convegno annuale CoRiLa, Venezia, 31/3/2003. GIA A DISPOSIZIONE TESI: Prevedello S. (Relatori Bisol P.M. e Venier P.), 2001/2002. Tesi di laurea in Scienze Biologiche, Università di Padova: Analisi di Polimorfismi nel bivalve Mytilus galloprovincialis e nel teleosteo Zosterisessor ophiocephalus della laguna di Venezia. Toniolo N. (Relatore: Venier P.; Correlatori: De Pittà C., Marsano F.), 2002/2003 Tesi di laurea in Scienze Naturali, Università di Padova: Produzione e identificazione di EST in Zosterisessor ophiocephalus. Moro E. (Relatore: Venier P.; Correlatori: De Pittà C., Marsano F.) 2002/2003 Tesi di laurea in Scienze Naturali, Università di Padova: Produzione di EST e allestimento di un cdna microarray di Mytilus galloprovincialis Bibliografia di riferimento Aardema M.J. and MacGregor J.T. (2002) Toxicology and genetic toxicology in the new era of toxicogenomics : impact of -omics technologies. Mutat. Res. 499, Cajaraville M.P., Bebianno M.J., Blasco J., Porte C., Sarasquete C., Viarengo A. (2000) The use of biomarkers to assess the impact of pollution in coastal environments of the Iberian Peninsula: a practical approach. Sci. Total. Environ. 247(2-3), Cao D., Kocabas A., Ju Z., Karsi A., Li P., Patterson A., Liu Z. (2001) Transcriptome of channel catfish (Ictarulus punctatus): initial analysis of genes and expression profiles of the head kidney. Animal Genetics 32, Funabara D., Kinoshita S., Watabe S., Siegman M.J., Butler T.M., Hartshorne D.J. (2001) Phosphorylation of molluscan twitchin by the camp-dependent protein kinase. Biochemistry, 40(7), Goldberg E.D., Bertine K.K. (2000) Beyond the Mussel Watch - new directions for monitoring marine pollution. Sci. Total Environ. 247(2-3), Hoffmann R.J., Boore J.L., Brown W.M. (1992) A novel mitochondrial organization for the blue mussel, Mytilus edulis. Genetics 131, Inoue K., Takeuchi Y., Miki D., Odo S. (1995) Mussel adhesive plaque protein gene is a novel member of epidermal growth factor-like gene family. J. Biol. Chem. 270(12), Jackson R.B., Linder C.R., Lynch M., Purugganan M., Somerville S., Thayer S.S. (2002) Linking molecular insight and ecological research. Trends Ecol. Evol. 17(9), Jenny M.J., Ringwood A.H., Lacy E.R., Lewitus A.J., Kempton J.W., Gross P.S., Warr G.W., Chapman R.W. (2002) Potential indicators of stress response identified by expressed sequence tag analysis of hemocytes and embryos from the American oyster, Crassostrea virginica. Mar. Biotechnol. 4(1), Kawamoto S., Yoshii J., Mizuno K., Ito K., Miyamoto Y., Ohnishi T., Matoba R., Hori N., Matsumoto Y., Okumura T., Nakao Y., Yoshii H., Arimoto J., Ohashi H., Nakanishi H., Ohno I., Hashimoto J., Shimizu K., Maeda K., Kuriyama H., Nishida K., Shimizu-Matsumoto A., Adachi W., Ito R., Kawasaki S., Chae K.S., Murakawa K., Yokoyama M., Fukushima A., Hishiki T., Nakaya A., Sese J., Monma N., Nikaido H., Morishita S., Matsubara K., Okubo K. (2000) BodyMap: A collection of 3 ' ESTs for analysis of human gene expression information. Genome Res. 10(11), Lanfranchi, G., Muraro T., Caldara F., Pacchioni B., Pallavicini A., Pandolfo D., Toppo S., Trevisan S., Scarso S. and Valle G. (1996). Identification of 4,370 expressed sequence tags from a 3'-end-specific cdna library of human skeletal muscle by DNA sequencing and filter hybridization. Genome Res. 6,

110 Lemoine S., Bigot Y., Sellos D., Cosson R.P., Laulier M. (2000) Metallothionein isoforms in Mytilus edulis (Mollusca, Bivalvia): Complementary DNA characterization and quantification of expression in different organs after exposure to cadmium, zinc, and copper. Mar. Biotechnol., 2(2): Mitta G., Roch P., Cadoret J.P. (2000) Isolation and characterisation of a cdna encoding an actin protein from the mussel, Mytilus galloprovincialis. J. Shellfish Res. 19(1), Moore M.N. (2002) Biocomplexity: the post-genome challenge in ecotoxicology. Aquat.Toxicol. 59, Okubo K., Hori N., Matoba R., Niiyama T., Fukushima A., Kojima Y., Matsubara K., (1992) Large scale cdna sequencing for analysis of quantitative and qualitative aspects of gene expression. Nature Genetics 2(3), Pacchioni B., Trevisan S., Gomirato S., Toppo S., Valle G., Lanfranchi G. (1996) Semi-multiplex PCR technique for screening of abundant transcripts during systematic sequencing of cdna libraries. Biotechniques, 21(4): 644&. Sambrook J., Russel D.W., Irwin N., Janssen K.A. (2001) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Vol. 1, pp Viarengo A., Burlando B., Giordana A., Bolognesi C., Gabrielides G.P. (2000) Networking and expert-system analysis: next frontier in biomonitoring. Mar. Environ. Res. 49(5), Welle S., Bhatt K., Thornton-C.A. (1999) Inventory of high-abundance mrnas in skeletal muscle of normal men. Genome Res., 9(5):

111 3.7 Argomento 6 (Analisi funzionale della biodiversità in ascidie) Composizione unità operativa Elenco di ricercatori e tecnici Cognome nome Istituto di appartenenza Burighel Paolo Dipartimento di Biologia, Università di Padova Ballarin Loriano Dipartimento di Biologia, Università di Padova Cima Francesca Dipartimento di Biologia, Università di Padova Elenco di studenti (tesi, PhD, ecc.), Cognome nome Istituto di appartenenza Macor Anna Dipartimento di Biologia, Università di Padova Miotto Nadia Dipartimento di Biologia, Università di Padova Menin Adams Dipartimento di Biologia, Università di Padova Ballarin Nicoletta Dipartimento di Biologia, Università di Padova Obiettivi Valutazione della tossicità in vitro e della capacità immunodepressiva di composti biocidi ad attività antivegetativa su emociti di ascidiacei coloniali comuni nella laguna di Venezia. Valutazione di eventuali alterazioni nella struttura della comunità a macrofouling di substrato duro in presenza di vernici antivegetative di nuova generazione. Valutazione di alterazioni nello sviluppo e nella capacità di insediamento di larve di ascidiacei coloniali, in condizioni di laboratorio, in seguito ad esposizione a varie concentrazioni di principi attivi presenti nelle vernici antivegetative Attività preliminari Ricerca bibliografica, allestimento di un sussidio cartaceo per il rapido riconoscimento degli organismi del macrofouling lagunare, Definizione di un calendario dei campionamenti, scelta delle stazioni, Preparazione dei pannelli da immergere, scelta delle vernici e dei principi attivi da saggiare Attività in campo ed in laboratorio Effetti biochimico-citologici. Allevamento e riproduzione controllata di ascidiacei coloniali in camere termostatate; prelievo di emociti ed allestimento di colture a breve termine per gli studi di tossicità acuta di sostanze antivegetative; tecniche citologiche e citochimiche; osservazioni al microscopio ottico. Uscite mensili in barca. Analisi, con sonda multiparametrica, dei parametri chimico-fisici di campioni di acqua prelevata da ciascuna delle tre stazioni; acquisizione di fotografie digitali dei pannelli immersi; raccolta di campioni di organismi, fissazione in formalina e successiva analisi e determinazione allo stereomicroscopio. Effetti su riproduzione e sviluppo. Prelievo di colonie di ascidiacei coloniali in riproduzione dalla laguna di Venezia; raccolta delle larve natanti ed esposizione agli agenti tossici in cristallizzatori contenenti varie concentrazioni di xenobiotici o lastrine verniciate con vernici antivegetative. Osservazione allo stereomicroscopio.

112 Elaborazione Indice di copertura-abbondanza secondo Benninghoff Indici r Descrizione Individui rari e ricoprenti soltanto una porzione molto piccola dell'area campionata 1 Individui numerosi, ma coprenti meno di 1/20 dell'area campionata o abbondantemente sparsi ma con un elevato valore di copertura 2 Con qualche numero di individui ricoprenti tra 1/20 e 1/4 dell'area campionata, o con numerosi individui ma ricoprenti meno di 1/20 dell'area 3 Copertura compresa tra 1/4 e 1/2 dell'area campionata 4 Copertura compresa tra 1/2 e 3/4 dell'area campionata 5 Copertura più dei 3/4 dell'area campionata Indice di similarità di Sørensen: P s = 2c/(a+b), dove a è il numero di specie presenti sul pannello di controllo, b è il numero di specie presenti sul pannello trattato, c è il numero di specie in comune tra il controllo e il trattato Risultati ottenuti Mediante i test di immunotossicità in vitro abbiamo saggiato gli effetti dei composti zinco piritione, clorotalonile, Cu(I),Cl, TCMS piridina, Sea Nine e Diuron, usati nella formulazione di vernici antivegetative, su colture a breve termine di emociti dell ascidia coloniale Botryllus schlosseri, comparandoli con gli effetti, assai più noti del tributilstagno (TBT). Nel loro complesso, i dati mostrano una elevata tossicità anche a basse concentrazioni di zinco piritione e la sua interferenza su fondamentali attività cellulari, quali la corretta organizzazione citoscheletrica, e conseguentemente il potenziale rischio per gli invertebrati bentonici e, più in generale, per gli equilibri ambientali. Sea Nine, Diuron e clorotalonile provocano effetti significativi sulla morfologia e sulla funzionalità degli immunociti, comportandosi quindi in maniera simile a TBT e zinco piritione. Il Sea Nine risulta generalmente più attivo rispetto ad Diuron ed equiparabile, negli effetti a clorotalonile. Sea Nine e Diuron sono capaci di indurre apoptosi anche a basse concentrazioni. Tuttavia essi non alterano né le attività idrolasiche e la fenolossidasi. Solamente Sea Nine inibisce l attività dell enzima citocromo-c-ossidasi e altera l omeostasi del calcio citosolico. Sea Nine e clorotalonile non hanno effetto sull adesione al substrato e sulle attività enzimatiche (idrolitiche, ossidative), saggiate. Hanno invece effetti significativi sulla morfologia e sulla fagocitosi andando ad alterare il citoscheletro. Hanno inoltre effetti sulla respirazione cellulare ed inducono apoptosi. Ambedue le sostanze vanno inoltre a ridurre la concentrazione citosolica di glutatione ridotto. Basandoci sui dati ottenuti dallo studio delle colture di emociti, possiamo proporre il seguente ordine di immunotossicità per i composti ad attività biocida investigati: TBT ~ Cu(I), ~ ZnP > Sea-Nine 211 ~ clorotalonile > TCMS piridina > Diuron > Irgarol Dal momento che le sostanze saggiate sono presenti nelle formulazioni delle vernici antivegetative ampiamente usate nel bacino lagunare, se ne può dedurre che il loro effetto immunosoppressore le rende particolarmente pericolose per le popolazioni lagunari in quanto esse sono in grado di diminuirne le difese immunitarie e aumentarne di conseguenza la mortalità. I pannelli immersi in laguna (tre stazioni con diverse caratteristiche idrodinamiche e a diverso impatto antropico), da febbraio 2002 a febbraio 2003 sono stati rivestiti di vernici a rame che differiscono per la presenza di vari booster (CuSCN, Irgarol 1051, diclofluanide, clorotalonile),. In generale, sui pannelli trattati con vernici antivegetative la copertura a macrofouling compariva in tempi successivi rispetto al controllo.

113 Inoltre l estensione di tale copertura sui pannelli trattati risultava comunque inferiore a quella dei pannelli di controllo e con una distribuzione spesso a chiazze. La presenza di vernici antivegetative sui pannelli provoca una destrutturazione della comunità ed un disturbo della successione ecologica rispetto ai controlli (pannelli rivestiti di vernici alchiliche),, mediante la selezione di specie tolleranti. L indice di similarità raggiunge, in certi casi, un plateau nei mesi estivi, sempre inferiore ad 1, suggerendo una progressiva perdita di efficacia biocida delle vernici usate, mentre l indice rimane sempre prossimo a 0 nelle vernici contenenti clorotalonile; in questo caso l insediamento sembra del tutto casuale e mai destabilizzato. L ordine di efficacia biocida delle vernici considerate risulta il seguente: Cu 2 O < CuSCN + diclofluanide < Cu 2 O + Irgarol clorotalonile Di interesse appare l analisi dell effetto delle vernici antivegetative sulla metamorfosi e la capacità di insediamento degli ascidiacei. Tutte le vernici ad attività antivegetativa sinora saggiate hanno dimostrato di inibire la metamorfosi delle larve, inducendone, spesso, la morte. Tra i singoli composti saggiati, TBT, zinco piritione, Cu(I),, Sea Nine e clorotalonile e sono risultati in grado di impedire la metamorfosi a concentrazioni inferiori a 0.5 µm, mentre Irgarol, Diuron e TCMS piridina non hanno alcun effetto fino alla concentrazione di µm. I dati nel loro insieme dimostrano il ruolo non trascurabile dei composti ad attività biocida presenti nelle vernici antivegetative sulla biodiversità lagunare (Tab ). 113 BIOMARKER TBT Cu(I), ZnP Sea- Nine Chloro thalonil TCMS pyridine Diuron Irgarol 1051 SUBSTANCE 211 (µm), Adhesion index d 0.5 d Amoebocytic index 1 d d 1 d 1 d 50 d 250 d - Phagocytic index 1 d 0.1 d 0.5 d 0.1 d 1 d 10 d 250 d - Enzymatic index (esterase), Enzymatic index (phenoloxidase), Enzymatic index (cytochrome-c-oxidase ), Enzymatic index (Ca 2+ -ATPase), 0.1 d 0.1 d 0.5 d i 10 i? 0.1 d 0.1 d d d 0.1 d 0.01 d 0.5 d 1 d 1 d d d Glutathione index 0.1 d? - 1 d 1 d 10 d -? Cytosolic Ca 2+ index 10 i 0.01 i 1 d 1 i Apoptotic index 1 i 0.1 i 0.1 i 1 i 1 i 10 i 100 i 200 i Tabella Valutazione degli effetti tossici di biocidi ad attività antivegetativa, di uso comune nel bacino lagunare veneziano, sugli emociti di Botryllus schlosseri (d: decrease; i: increase).

114 I composti tossici rilasciati dalle vernici nella colonna d acqua e nel sedimento, possono significativamente influenzare l insediamento di diverse specie bentoniche, causando il decremento della popolazione e la selezione di specie dominanti più resistenti. Ne può quindi derivare un alterazione della composizione e della struttura funzionale delle comunità, con conseguente tendenza alla riduzione della ricchezza in specie della Laguna (Tab ). ANTIFOULING PAINT (Biocidal content), 1. Control paint (alkyd resin), on painted glass plate EXPERIMENT #1 (%), on surrounding glass free larvae on painted glass plate EXPERIMENT #2 (%), on surrounding glass 114 free larvae 12 M 20 M 68 F 12 M 32 M 56 F 2. Sea-Nine A 2 M 82 F 10 A 2 M 88 F 3. Cu 2 O, Irgarol 1051, 2 A 0 98 F 2 A 0 98 F Chlorothalonil 4. CuSCN, Dichlofluanid 2 A 0 98 F 0 2 M 98 F 5. ZnP, Sea-Nine F 0 2 A 98 F 6. Cu 2 O 10 M 8 M 82 F 28 M 4 M 68 F 7. TBT methacrylate, CuO 8 M 8 M 84 F 2 A 4 M 92 F 8. TCMS pyridine, Diuron 8 A 6 A 86 F 0 12 A 88 F 9. ZnP, Zineb, Endosulfan 6 A 4 A 90 F 0 4 M 96 F Tab Capacità di insediamento delle larve di Botryllus schlosseri, dopo 16 h a 20 C, in condizioni di laboratorio, su substrati artificiali (piastre di vetro verniciate con vernici antivegetative),. I dati sono riportati come percentuale del numero totale di larve. (A: adhering larvae; F: free larvae; M: metamorphosis; : dead individuals) Pubblicazioni prodotte Ballarin L., Cima F., Immunotoxicity in ascidians: the case of organotin compounds. In: The Biology of Ascidians, H. Sawada, H. Yokosawa, & C. C. Lambert (eds),, Springer, Tokyo, pp Cima F., Dominici D., Ballarin L., Burighel P., Influence of TBT on the activity of the detoxicant enzymes, GST and GPX, from haemocytes of the colonial ascidian Botryllus schlosseri. 11 th International Symposium on Environment Pollution and its Impact on Life in the Mediterranean Region, Limassol (Cyprus), October, 6-10, C8. Cima F., Dominici D., Mammi S., Ballarin L., Butyltins and calmodulin: which interaction? Appl. Organometal. Chem., 16: Cima F., Dominici D., Ballarin L., Burighel P., Influence of TBT on activity of detoxifying enzymes from haemocytes of a colonial ascidian. Fres. Environ. Bull., 11: Cima F., Ballarin L., Burighel P., Biodiversity in the lagoon of Venice: effects of biocidal compounds on the survival of benthic filter-feeding organisms, with particular reference to compound ascidians. In: Scientific Research and Safeguarding of Venice, P. Campostrini ed., Istituto Veneto di Scienze Lettere ed Arti, Venezia, pp Cima F., Ballarin L., Burighel P., Calcium and thiol roles in cells exposed to organotins. ELSO 2002, Nice (France),, June, 29 July, 3, 81. Cima F., Burighel P., Ballarin L., Immunotoxicity of Cu(I), and Irgarol 1051 in ascidians. 9 th International Congress of the International Society of Developmental and Comparative Immunology ((ISDCI),, St Andrews, Scotland, June 29 - July, 4, 180. Cima F., Ballarin L., TBT-sulfhydryl interaction as a cause of immunotoxicity in Tunicates. Ecotoxicol. Environ. Saf., in press

115 3.7.8 Bibliografia di riferimento LAUGHLIN R.B. jr, THAIN J., DAVIDSON B., VALKIRS A.O., NEWTON F.C. (1996), Experimental studies of chronic toxicity of tributyltin compounds. In: M. A. Champ & P.F. Seligman (Eds), Organotin, Chapman & Hall, London: RELINI G. (1977), - Le metodologie per lo studio del fouling nell'indagine di alcuni ecosistemi marini. Boll. Zool., 44: RELINI G. (1980), - Insediamento di organismi marini di substrato duro in ambienti portuali mediterranei. Mem. Biol. Mar. Oceanogr., 10: THOMAS K.V., FILEMAN T.W., READMAN J.W., WALDOCK M.J. (2001a), Antifouling paint booster biocides in the UK coastal environment and potential risk of biological effects. Mar. Pollut. Bull., 42: VOULVOULIS N., SCRIMSHAW D., LESTER J.N. (1999), Alternative antifouling biocides. Appl. Organometal. Chem., 13:

116 3.8 Argomento 7 (Biomarcatori molecolari) Composizione unità operativa Elenco di ricercatori e tecnici Cognome nome Istituto di appartenenza Tallandini Laura Dipartimento di Biologia UniPd Elenco di studenti (tesi, PhD, ecc.), Cognome nome Istituto di appartenenza Mercogliano Rita Dipartimento di Biologia UniPd Poletti Simonetta Dipartimento di Biologia UniPd Marampon Roberta Dipartimento di Biologia UniPd Pipichelapinato Dipartimento di Biologia UniPd Obiettivi Le alterazioni degli equilibri a differenti livelli di complessità possono portare a effetti diretti sul declino della biodiversità Numerosi fattori possono agire sulla perdita della biodiversità; tra questi i contaminanti rilasciati dalle attività antropiche in ambiente, soli o in miscele più o meno complesse che, anche a livelli estremamente ridotti, possono causare alterazioni importanti sugli organismi esposti in seguito al bioaccumulo e alla biomagnificazione lungo le catene trofiche. Esposizioni a basso livello e lungo termine in molti casi hanno portato alla riduzione e alla scomparsa di numerose popolazioni. Le cellule sono il sito di interazione primaria tra i contaminanti ed i sistemi biologici. La risposta cellulare ad un contaminante è quindi il punto di partenza di una catena di reazioni, non lineare né facilmente prevedibile nell esito, dal momento che non tutti gli eventi scatenati dall ingresso nella cellula di uno xenobiotico hanno significato di danno. Infatti generalmente la cellula riponde esprimendo una serie di attività, metaboliche, di detossificazione e riparazione, di natura protettiva rispetto agli effetti dell inquinante. Queste attività si mantengono fino al raggiungimento di situazioni critiche al punto da impedirne la continuazione e/o il successo. L incidenza degli effetti può essere molto diversa in relazione alle capacità di risposta ad un inquinante o a una miscela di inquinanti da parte delle diverse specie, o, all interno di una specie, a seconda dell abilità di risposta dei singoli organismi, abilità che sarà legata - a parità di storia - alla loro fitness e in ultima analisi al pattern genetico. La risposta cellulare a situazioni distrofiche è quindi il punto di partenza di una catena di effetti che possono interessare la biodiversità andando ad incidere diversamente, sulla base delle differenze genetiche, sui diversi individui, alterando inizialmente gli equilibri genetici, portando poi a ricadute sulle popolazioni ed infine sugli ecosistemi. Il fatto che le prime reazioni a fattori inquinanti e/o di stress di varia natura si manifestino a livello della cellula, rende alcune risposte cellulari degli strumenti attendibili per il rilevamento precoce di agenti distrofici, proponendole come biomarker. La presente linea di ricerca ha avuto l obiettivo di mettere a punto in laboratorio e di validare poi in ambiente, su due tipici abitatori della Laguna di Venezia, Zosterisessor ophiucephalus (go ) e Mytilus galoprovincialis (mitilo), una nuova metodologia di valutazione di alterazione del DNA al fine di evidenziare sin dagli stadi iniziali gli effetti genotossici potenzialmente derivanti da esposizione a xenobiotici anche a livelli estremamente bassi, e da poter offrire strumenti più sensibili per la valutazione dello stato di salute delle popolazioni lagunari e delle loro prospettive Attività preliminari Si è proceduto all aggiornamento bibliografico e ad uno studio sugli sviluppi metodologici delle tecniche per l analisi di apoptosi mediante marcatori specifici e di rotture al DNA in singole

117 cellule mediante il test cometa Si sono censite le sostanze testate con queste metodiche ( includono metalli, idrocarburi policiclici aromatici, policlorobifenili etc, e inoltre agenti ossidanti, alchilanti e intercalanti). Sono stati esaminati i protocolli e le applicazioni eseguite Attività in campo ed in laboratorio L attività sperimentale si è svolta in laboratorio e in campo. a)in laboratorio sono state eseguite esposizioni controllate a Xenobiotici: - In pesci si è operata una valutazione dell effetto da distinte esposizioni, a PCB e a Cd,. in globuli rossi. I livelli di PCB e Cd impiegati sono stati estremamente bassi, allo scopo di verificare la sensibilità a questi due xenobiotici dei parametri testati. b)in campo si è eseguita una campagna di prelievo di mitili, della durata di sei mesi, in 5 stazioni opportunamente individuate nella Laguna di Venezia. In ambedue le attività, a valle della registrazione dei dati di natura biometrica, si sono andati a valutare il tasso di apoptosi (morte cellulare programmata) e il danno al DNA. La valutazione del tasso di apoptosi, è stata messa a punto con due distinte metodiche, che vedono l utilizzo di due marcatori, Annessina V e Yo-Pro, scelti per la loro specificità e sensibilità. In particolare Annessina V, che va a legare la Fosfatidil Serina della membrana cellulare che viene esternalizzata al primo attivarsi della catena degli eventi che esitano nell apoptosi, Yo-Pro è un marcatore fluorescente che entra differenzialmente nelle cellule apoptotiche, mentre resta escluso dalle altre, a causa della brusca variazione di permeabilità della membrana all inizio del processo di apoptosi. Il danno al DNA è stato valutato mediante Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) detto anche test Cometa. Il test Cometa è stato scelto per la sensibilità dimostrata nel mettere in evidenza, in colture cellulari, il danno al DNA anche per esposizioni a bassi livelli di inquinanti con attività genotossica. L'induzione di rotture nella catena del DNA da parte di una sostanza genotossica può avvenire o direttamente, mediante l'attacco di un radicale di specie reattive sulla catena zucchero -fosfato del DNA, oppure per interazione con endonucleasi durante la riparazione del DNA danneggiato. Vi sono inoltre danni al DNA che in condizioni fisiologiche non appaiono come rotture della catena, ma in condizioni alcaline di analisi vengono trasformate in singole rotture del filamento di DNA. "siti labili in presenza di alcali" Sviluppo del lavoro: 1 Esposizione di Z.ophiocephalus a Xenobiotico (Cd o PCB ) con modalità controllate 1.2 Preparazione della sospensione cellulare di globuli rossi dal sangue di Zosterisessor (trattati con PCB, oppure trattati con Cd) - misure di vitalità cellulare - valutazione del tasso di apoptosi - all allestimento del test Cometa (Fig 3.8.1) - analisi dei dati da test cometa (Fig 3.8.1) 2 Raccolta di M. galloprovincialis in campagna 2.2 I mitili, raccolti ripuliti dal fango e conservati in luogo fresco fino all arrivo in laboratorio e messi a filtrare per una notte separatamente l uno dall altro in vaschette contenenti acqua di mare sedimentata, della zona di provenienza, in modo tale da permettere lo svuotamento dei dotti intestinali. Entro le 24 ore dalla raccolta venivano effettuate - Preparazione della sospensione cellulare di cellule della ghiandola digestiva di mitilo 117

118 - misure di vitalità cellulare - valutazione del tasso di apoptosi - allestimento del test Cometa (Fig 3.8.1) - analisi dei dati da test cometa (Fig 3.8.1) 118 Caricamento del vetrino Neutralizzazione Strato di adesione Mettere un vetrino coprioggetto e solidificare a 4 C Rimuovere il coprioggetto STRATO 1: 0.8% NMA STRATO 2: 0.7% LMA µ l sosp.cell STRATO 3:0.7% LMA 75µ l Lisi cellulare Soluzione lisante: 2.5M NaCl, 0.1M EDTA, 0.01M Tris, 10% DMSO 1% TritonX-100 Mettere al buio a 4 C per 1h 400mM Tris ph 7.5, 5 min x 2 Colorazione Analisi Mettere 50 µl Bromuro Etidio (2µg/ml) Coprire con coprioggetto Microscopio a fluorescenza Eccitazione nm barriera 590nm Elettroforesi Tampone: 300mM NaOH +1mM EDTA (ph >13) Despiralizzazione 20 min elettroforesi per 20 a 25V e 300mA Sistema di analisi: MicroComete 2.3 (Casti Imaging srl, Italia) Fig Allestimento del test cometa e analisi dei dati Elaborazione Valutazioni eseguite Analisi biometriche: basate sui dati biometrici: Lunghezza totale, LT; peso totale delle parti molli,twb, peso della ghiandola digestiva (HW) nel mitilo. Peso totale (TW) Peso del fegato (LW) e sesso (S) in go. Le elaborazioni sono state effettuare con Microsoft EXCEL. Le variabili ricavate nel corso di questo studio sono state valutate per media ± deviazione standard e per distribuzione in classi di danno. Sono stati inoltre applicati analisi della varianza, test di Tuckey e test t.

119 Analisi del danno apoptotico: La valutazione è stata condotta mediante tre diverse misure: test cometa, Annessina V, Yo Pro-1. Si riteneva che Annessina V dovesse essere testata in quanto indicata come il legante della fosfatidil serina esternalizzata dalla membrana cellulare al primo insorgere del processo apoptotico. In realtà, delle tre misure effettuate Yo-Pro 1 è risultato il marcatore più efficiente del processo apoptotico Analisi del danno genotossico al DNA:Da ogni vetrino sono state acquisite e digitalizzate 50 immagini mediante una telecamera Leika DC 100 (fattore di ingrandimento 2X collegata al microscopio mediante raccordo di riduzione passo C, 0.5X). a 400 ingrandimenti. Si è poi utilizzato un sistema di analisi di immagine (Casti Imaging) sviluppato seguendo il lavoro di Helma e Uhl (2000). Le cellule che non presentano danno al DNA sono visualizzate come core subsferico con una minima o nulla migrazione di DNA, mentre eventuali rotture dell elica sono evidenziabili con il movimento dei frammenti dal nucleoide verso l anodo dando origine ad una coda detta cometa. Si utilizza pertanto la coda di tale cometa come parametro indicatore della quantità di danno presente in ciascuna cellula. In particolare il software per l analisi d immagine utilizzato permette di rilevare i seguenti parametri : Percentuale di DNA nella coda(dna%): intensità di fluorescenza nella coda, essendo questa proporzionale alla quantità di frammenti che sono migrati dalla testa nella coda. Tail Length(TL): lunghezza della coda presa dal margine della testa a contatto con l origine della coda (tale misura viene fatta sottraendo alla lunghezza totale del nucleo la lunghezza della testa che viene ricavata come la distanza tra il punto a minore intensità luminosa a sinistra della testa e il punto a maggiore intensità entro la testa. Questo valore, in µm, viene quindi raddoppiato ottenendo il diametro della testa) Tail moment (TM): prodotto della lunghezza della coda per la percentuale di DNA nella coda. Le comete si formano poichè estremità rotte della molecola di DNA, cariche negativamente, diventano libere di migrare nel campo elettrico verso l anodo. Il modello della formazione delle comete viene attribuito a due principi. Il DNA è in grado di migrare sia in funzione della taglia del frammento sia del numero di estremità rotte che possono essere attaccate a pezzi più grandi di DNA, ma che possono ancora migrare per una breve distanza dalla testa della cometa. Se il danno è lieve si ha lo stiramento dei filamenti attaccati di DNA piuttosto che la migrazione di singoli pezzi; quando il numero di rotture aumenta, i pezzi di DNA migrano liberamente nella coda della cometa e in condizioni di danno estremo (cellule in apoptosi), la testa e la coda sono ben separate. L intensità della fluorescenza nella coda relativamente alla testa dà informazioni circa il numero di rotture dell elica. Stiramento e migrazione delle eliche separate sono concetti accettati per spiegare i modelli di migrazione del DNA osservati nel Test Cometa Risultati ottenuti Nel corso della ricerca sono stati esaminati 80 esemplari di Z.ophiocephalus per la risposta a PCB in un esperimento, e 250 esemplari per la risposta a Cd in tre esperimenti; 150 mitili, raccolti in cinque zone della laguna, sono stati esaminati per la valutazione del danno al DNA Esposizione di: Zosterisessor ophiocephalus (Pall.) a PCB (Aroclor 1254) 10 ppb per 28 giorni.. Gli effetti dell esposizione sono stati valutati a 0,7, 14, 21, 28 gg sui globuli rossi di 5 controlli 5 trattati per ciascun tempo come percento di processi apoptotici e percento di comete.nei pesci esposti dopo 7 giorni di trattamento l incidenza dei nuclei apoptotici nei trattati risultava del 20% contro l 1% dei controlli (P 0.001) I nuclei apoptotici decrescevano a 14 e 21 giorni, ed erano completamente assenti a 28 giorni. La significatività della differenza tra controlli e trattati restava comunque elevata sino a 21 giorni (P 0.001). 119

120 La percentuale media di comete durante l esperimento risultava % nei controlli e % nei trattati. La differenza delle medie tra controlli e trattati risultava altamente significativa (P 0.001). (Fig 3.8.2) Fig Z. ophiocephalus: Esposizione a PCB (Aroclor 1254) 10 ug l-1. Percentuale di nuclei alterati in Controlli (C ) e trattati (T). ***=P<0.01,**=P<0.05 Ugualmente i valori medi per i parametri quantitativi del danno al DNA (%DNA, TL e TM) risultavano sempre significativamente più elevati nei trattati che nei controlli (P<0.001). Questo dato conferma l ipotesi a) che Aroclor 1254 anche a 10 ppb concentrazione nominale, sia in grado di indurre un rilevante danno al DNA, b) che il test cometa si dimostra uno strumento molto sensibile e quindi un possibile biomarker molecolare Esposizione di: Zosterisessor ophiocephalus (Pall.) a CdCl ppm (w/w): valutazione delle conseguenze a livello nucleare sui globuli rossi Tra i metalli pesanti il Cadmio (Cd ++ ) è riconosciuto come un pericoloso inquinante ambientale e industriale. A carico del cadmio sono stati evidenziati effetti mutageni, teratogeni, cancerogenetici e in particolare di danno al DNA. Sono ben noti molti aspetti della tossicità acuta e degli effetti da bioaccumulo, anche in organismi acquatici, ma sono meno documentati effetti in termini di genotossicità per esposizioni puntiformi, e/o subacute. Si è esposto Zosterisessor ophiocephalus Pall al metallo per via intraperitoneale, ad una singola dose di 0.07 ppm (w/w). Tale dose è un livello di circa 1/10 rispetto alle concentrazioni ritenute subacute ; concentrazioni, cioè, alle quali l organismo era sopravvissuto per almeno un mese in acquario senza dimostrare incremento di mortalità. Essendo noto da precedenti studi che: in questo organismo in queste condizioni circa il 74% del Cadmio somministrato veniva accumulato nel fegato nel giro di 10 ore, e lì interamente legato da metallotioneina, che altri organi bersaglio risultavano branchie e rene, si è programmato di esaminare la risposta di un tessuto non ritenuto un bersaglio per questo elemento, cioè il sangue al fine di verificare se fosse possibile monitorare effetti che, a causa dei bassi livelli di metallo disponibile, dovevano essere inferiori a quelli riscontrati nei tessuti citati (fegato, branchie e rene). I livelli di Cd ++ valutati nel fegato dei trattati in un intervallo di tempo di 120 ore ( 0, 5, 12, 24, 68, 72, 96,120 ore) dall iniezione confermavano che il Cd era prevalentemente (74%) accumulato nel fegato. Agli stessi tempi si sono esaminati i globuli rossi del sangue per cinque individui trattati e cinque controlli, andando a verificare il tasso apoptotico, mediante marcatori specifici ( Annessina V, legante della fosatidil serina di membrana esternalizzata al primo insorgere del processo

121 apoptotico, e Yo-Pro 1), e il livello di danno al DNA, mediante test cometa. Si osservava pertanto un incremento di incidenza delle apoptosi fino ad un massimo del 10% a 72 ore e poi una continua diminuzione fino all 1% a 120 ore. Il test cometa metteva in evidenza a 96 ore l 80% dei nuclei danneggiati, sotto forma di cometa, e con oltre il 20% del DNA nella coda (Fig ). 121 Fig Z. ophiocephalus esposto a Cd++ o.07 ppm (w/w) per via i.p.: test Cometa su globuli rossi. C= Controlli; T= Trattati Ai tempi più lunghi il danno si riduceva grazie alla attività di repair, come dimostrato dal permanere del danno in presenza di agenti antirepair. Con questo studio si è ulteriormente dimostrata la sensibilità del test cometa a mettere in evidenza con finezza alterazioni del DNA e individuare danni anche transitori Valutazione del danno al DNA in mitili raccolti nella Laguna di Venezia. Lo studio ha riguardato la valutazione del danno al DNA in epatociti di mitilo raccolti tra Agosto 2000 e gennaio 2001 in cinque differenti stazioni della Laguna di Venezia (Fig 3.8.4): (1.Canale San Domenico, 2.Porto Chioggia, 3.Canale Lombardo, 4.Porto di Malamocco, 5.Area Industriale Marghera.) L intervallo di tempo è stato scelto al fine di verificare gli eventuali danni in modo indipendente da variazioni fisiologiche stagionali. Sono stati monitorati, per i parametri chimicofisici ambientali, temperatura, salinità, ossigeno disciolto. Il danno apoptotico è risultato compreso, nei cinque siti per i sei mesi, tra 1.2 a 23.2 % ; Malamocco risultava il sito con la media percentuale di apoptosi più bassa per i sei mesi (4.4%), e con il valore più basso in un singolo campionamento (1.2% in Gennaio). Marghera risultava il sito con la media percentuale più elevata per i sei mesi (14.6%), e con il valore più elevato in un singolo campionamento (23.2% in Agosto).Va sottolineato che nel sito Marghera i valori mensili di eventi apoptotici risultavano sempre almeno doppi rispetto a quelli osservati in tutti gli altri siti.presentando differenze statisticamente significative con i valori delle altre stazioni comprese tra P<0.05 e P<0.01 Le differenze mensili tra gli altri quattro siti non risultavano significative (Fig.3.8.5)

122 122 I T A L I A 0 5 Km Area industriale di Marghera 5 Venezia 4 Port o di Malamocco M a r e A d r i a t i c o Chioggia Port o di Chioggia 1 Canale di San Domenico 2 Porto di Chioggia 3 Canale Lombardo esterno 4 Porto di Malamocco 5 Area industriale di Marghera Fig Laguna divenezia: localizzazione delle 5 stazioni di prelievo di M.galloprovincialis

123 123 Fig M.galloprovincialis, cellule da ghiandola digestiva. Percentuale di cellule apoptotiche osservate nei campioni raccolti nei cinque siti (descritti in figura) durante il periodo Agosto 2000 Gennaio La correlazione tra valore percentuale di apoptosi e temperatura mostrava inoltre la significatività più elevata a Marghera (P 0.01) e quella più bassa a Malamocco(P 0.03). Anche il livello percentuale di comete presentava livelli significativamente più elevati a Marghera rispetto agli altri siti (P 0.01 rispetto a Malamocco e Porto Chioggia, P 0.03 rispetto a San Domenico e Canale Lombardo) Mentre gli altri quattro siti non presentavano differenze significative tra loro Infine, l analisi dei parametri quantitativi del danno al DNA (%DNA, TL e TM) e della stribuzione dei nuclei in classi di danno per ciascuno dei tre parametric hanno portato all evidenza del seguente gradiente di sofferenza nelle stazioni esaminate Marghera>Canale Lombardo>San Domenico>Porto Chioggia>Malamocco. E interessante notare che con indagine sul genotipo si era evidenziato un gradiente di riduzione del polimorfismo andando da mare aperto alle parti più interne della laguna, in parallelo con la evidenza di danno crescente dall esterno all interno della laguna osservata nel presente lavoro. Il test si dimostra in grado di distinguere in modo significativo popolazioni diverse con livelli di danno differenti durante l'intero arco temporale delle misure. Il vistoso incremento delle alterazioni all'aumentare della temperatura non annulla le differenze significative tra gli organismi provenienti da siti diversi, relativamente al sito più danneggiato. Pertanto il test si candida ad essere un biomarcatore attendibile se adeguatamente utilizzato. Gli sviluppi in corso sulla tecnica del test mirati a rendere possibile il riconoscimento di siti di danno sul DNA tipici di alcune classi di composti (alcuni congeneri dei PCB, PAH a struttura planare etc.) potranno aumentarne anche l'analiticità e la valenza predittiva Pubblicazioni prodotte Tallandini L., M.Modenato and L. Pivotti, Effects of subacute Cd ++ exposure on nuclear integrity in red blood cells of fish (Zosterisessor ophiocephalus Pall),: Apoptotic and genotoxic events Atti VII Naz AISETOV Elementi Traccia nella salute dell uomo, degli animali e delle piante Chieti settembre 2002 Tallandini L., Studies of the biodiversity in the Venice lagoon: Molecular probes of ecotoxicological susceptibility. I Validation of DNS damage detection in fish (Zosterisessor ophiocephalus, Pall), and mussel (Mytilus galloprovincialis, Lam), by means of comet

124 assay Scientific research and safeguarding of Venice. P.P. Campostrini (ed.),.istituto Veneto SSLLAA, Venezia, La Garangola (PD), pag Tallandini L., S. Poletti, L. Pivotti : DNA damage in fish ((Zosterisessor ophiocephalus Pall.), blood after Cd ++ exposure. 33 EEMS satellite Meeting V th International Comet Assay Worksop Aberdeen U.K. August 29-30, Tallandini L., S. Poletti, L. Pivotti, 2003 Effects of subacute Cd ++ exposure on nuclear integrity in red blood cells of fish (Zosterisessor ophiocephalus Pall ESCPB 22 nd European Society of Comparative Physiology and Biochemistry. Alessandria-Italy, Dec 15-19, Tallandini L et al DNA damage detection in mussel (Mytilus galloprovincialis) by means of Comet assay. Manuscript in preparation Bibliografia di riferimento Anderson D. and Plewa M.J. (1998). The International Comet Assay Workshop. Ashby J., Tinwell H., Lefevre P.A., Browne M.A. (1995). The single cell gel electrophoresis assay for induced DNA damage (Comet assay): measurement of tail length and moment. Mutagenesis.vol 10 n 2: Battaglia, B., Bisol, P. M. and E. Rodinò (1980). Experimental studies on some genetic effects of marine pollution. Helgoländer Meeresuntersuchungen. 14 th European Marine Biology Symposium. 33 (1 4): Belfiore N. M and. Anderson S.L. (2001) Effects of contaminants on genetic patterns in aquatic organisms: a review Mutation Research. 489: Belpaeme, K., Delbeke, K., Zhu, L., M. Kirsch-Volders (1996). Cytogenetic studies of PCB77 on brown trout (Salmo trutta fario) using the micronucleus test and the alkaline comet assay. Mutagenesis 11 (5): Benton M.J., Diamond S.A.; Guttman-SI (1994) A genetic and morphometric comparison of Helisoma trivolvis and Gambusia holbrooki from clean and contaminated habitats Ecotoxicology-and-Environmental-Safety. 1994; 29(1): Bisol P.M.,. Alay F,. Gavilan J.F,. Gonzalez F,. Cabello Y.J, (1994) Influencia del ambiente sobre la estructura genetica de dos poblaciones de Chilina dombeyana (Bruguiere, 1789) (Mollusca, Gastropoda) del rio Biobio, Boletin Soc. Biol. Concepcion, Chile 65: Butterworth F.M., Pandey P., Mc Gowen R.M., Ali Sadat S., Walia S. (1995): Genotoxicity of PCBs: recombionogenesis by biotransformation products. Mutation Research. 342, Cescon, P., Barbante, C., Capodaglio, G., Cecchini, M., Turetta, C., Caroli, S., Caimi, S., Senofonte, O., Delle Femmine, P., Petrucci, F. and R. Fuoco (2000). Microinquinanti inorganici nella laguna di Venezia. In: La ricerca scientifica per Venezia; Il progetto sistema Lagunare Veneziano. Ed. Istituto veneto di scienze, lettere ed arti II (I): P. Choucroun a,, D. Gillet a, G. Dorange b, B. Sawicki a, J.D. Dewitte (2001) Comet assay and early apoptosis Mutation Research 478, Fairbairn, W.D., Olive, P.L. and K. O'Neill (1995). The comet assay :a comprehensive review. Mutation research. 339: Fossato, V.U., Campesan, G., Craboledda, L., Dolci, F. and G. Stocco (2000). Organic micropollutants and trace metals in water and suspended particulate matter. In: La ricerca scientifica per Venezia; Il progetto sistema Lagunare Veneziano. Ed. Istituto veneto di scienze, lettere ed arti, III: Fossato, V.U., Campesan, G., Craboledda, L., Dolci, F. and G. Stocco (2000). Persistent chemical pollutants in mussels and gobies from Venice Lagoon. La ricerca scientifica per Venezia; Il progetto sistema Lagunare Veneziano. Ed. Istituto veneto di scienze, lettere ed arti, III: Frenzilli G.; Bosco E.; Barale R. (2000). Validation of single cell gel assay in human leukocytes with 18 reference compounds. Mutation Research. 468 (2): Ghiotto, R. (2000). Analisi di polimorfismi in molluschi bivalvi della laguna di Venezia. Tesi di laurea (a.a.1999/2000). 124

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127 3.9 Argomento 8 (Le specie alloctone del macrozoobenthos della laguna di Venezia: presenza e diffusione) Composizione unità operativa Elenco di ricercatori e tecnici Cognome nome Istituto di appartenenza Bon Mauro Museo di Storia Naturale di Venezia Mizzan Luca Museo di Storia Naturale di Venezia Reggiani Paolo Museo di Storia Naturale di Venezia Trabucco Raffaella Museo di Storia Naturale di Venezia Elenco di studenti (tesi, PhD, ecc.) Cognome nome Istituto di appartenenza Tagliapietra Giorgia Università degli Studi di Padova Obiettivi La presente indagine ha avuto come scopo l elaborazione di un quadro completo relativo alla presenza e diffusione di alcune specie esotiche del macrozoobenthos nella laguna di Venezia, al fine di aggiornare i dati già esistenti sull argomento e approfondire le informazioni esistenti al riguardo. Allo scopo di verificare sul campo le conoscenze pregresse sono stati quindi effettuati campionamenti che hanno fornito dati sulla presenza delle specie alloctone argomento dello studio e di alcune specie locali individuate per analisi di confronto, nonché dati faunistici quali ad esempio abbondanza relativa e tipologia di distribuzione. Sono stati inoltre rilevati alcuni parametri ambientali quali temperatura, salinità, fase di marea. Un ulteriore aspetto dello studio condotto è stata l analisi, sulla base dei risultati ottenuti nei campionamenti, dei rapporti tra le specie alloctone e le relative specie autoctone di confronto prese in esame, al fine di evidenziare eventuali fenomeni di interazione che possono assumere particolare rilevanza nel caso delle specie di interesse commerciale. Lo studio della distribuzione e della consistenza delle popolazioni permette infatti di evidenziare interazioni fra lo sfruttamento delle risorse naturali e la diversità biologica dell ambiente lagunare Attività preliminari Individuazione delle specie target Al fine di valutare presenza e grado di diffusione di alcune specie esotiche nei popolamenti bentonici della laguna di Venezia, una delle attività preliminari alle fasi di ricerca sul campo è stata la predisposizione di un apposita banca dati relativa alle entità alloctone finora segnalate nel Mediterraneo. L analisi è stata rivolta al solo gruppo dei Molluschi in quanto ritenuto sufficientemente rappresentativo per gli scopi della ricerca, ed invece estesa a tutti gli altri gruppi zoologici per quanto riguarda la laguna di Venezia. La realizzazione di tale strumento è stata possibile grazie anche alla consultazione di una cospicua bibliografia internazionale; per questo è stato creato in parallelo anche un database bibliografico, dotato di un campo relativo alle specie trattate in ognuno dei testi esaminati [Mizzan e Trabucco, 2002]. L elaborazione dei dati del sistema informativo ha permesso di individuare le specie potenzialmente candidate alla colonizzazione della laguna di Venezia, in quanto maggiormente compatibili con le caratteristiche locali. Le specie alloctone del macrozoobenthos lagunare appartengono a diversi gruppi zoologici [Mizzan, 1999] ma in questa sede si è deciso di limitare l indagine ad un set ritenuto rappresentativo e compatibile con l economia della ricerca. Le specie in oggetto, elencate di seguito, comprendono alcune entità autoctone di confronto, vicine per categoria tassonomica o caratteristiche ecologiche (Tab. 1 e 2). 127

128 Specie alloctona Specie autoctona di confronto Musculista senhousia (Benson in Cantor, 1842) Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819 Xenostrobus sp. Crassostrea gigas (Thunberg,1793) Ostrea edulis Linnaeus, 1758 Saccostrea commercialis (Iredale & Roughley, 1933) Dyspanopeus sayi (Smith, 1869) Carcinus aestuarii Nardo, 1847 Tab. 1 - Elenco delle specie target per i substrati solidi Specie alloctona Specie autoctona di confronto Scapharca inaequivalvis (Bruguière, 1789) Cerastoderma glaucum (Poiret, 1789) Tapes philippinarum (Adams & Reeve, 1850) Tapes decussatus (Linnaeus, 1758) Dyspanopeus sayi (Smith,1869) Carcinus aestuarii Nardo, 1847 Tab. 2 - Elenco delle specie target per i substrati mobili Definizione dell area di studio L area oggetto di studio è la laguna di Venezia, all interno della quale sono state individuate 17 stazioni di campionamento. Considerando come confini delle rispettive aree le linee di partiacque, 9 stazioni risultano site in laguna Nord, 5 in laguna centrale e 3 in laguna Sud. Ognuna è stata contrassegnata con un numero progressivo e identificata con il toponimo di riferimento, se esistente. Una serie di sopralluoghi condotti nell autunno 2001 ha permesso la verifica dell accessibilità dei siti e la loro precisa georeferenziazione con l ausilio di un sistema di Posizionamento Satellitare Cartografico, GPS (DATUM utilizzato: European Datum 1950 o ED50) (Fig. 1, Tab.3). Fig. 1 - Distribuzione delle stazioni all interno della laguna di Venezia (in blu sono riportati i valori di salinità misurati)

129 129 N della stazione Nome della stazione Coordinate geografiche 1 Isola di Campalto N E 2 Seno di Tessera N E 3 Isola di San Giacomo in Palude N E 4 Isola di San Francesco del Deserto N E 5 ter Ex Salina di Bossolaro N E 6 Ruderi di Cason di Val Grassabò N E 7 Isola di Torcello N E 8 Torre Massimiliana N E 9 Fusina N E 10 Isola di San Giorgio in Alga N E 11 Lago dei Teneri N E 12 Isola di Poveglia N E 13 Porto San Leonardo N E 14 Ottagono San Pietro N E 15 Ruderi di Cason Millecampi N E 16 Ruderi di Cason Bombae N E 17 Valle di Brenta N E Tab. 3 - Elenco delle stazioni e relative coordinate geografiche La localizzazione delle stazioni si è avvalsa di un lavoro d analisi e tipizzazione della laguna di Venezia sulla base di caratteristiche e peculiarità ambientali. Utilizzando adeguati riferimenti bibliografici 1 è stato scelto un numero di stazioni sufficiente a fornire un quadro completo sulle specie target nelle diverse tipologie ambientali in tutto il territorio lagunare, e nello stesso tempo a rispettare i tempi ed il budget stabiliti dal programma di ricerca Attività in campo ed in laboratorio Attività in campo Durante tutte le operazioni di campionamento è stata compilata per ogni stazione un apposita scheda formata da due sezioni riservate, rispettivamente, ai substrati solidi e a quelli mobili (Fig. 2). Alcuni campi sono stati compilati sul posto e riguardano la data, l ora di inizio e di fine del campionamento, le coordinate geografiche del sito, ecc. oltre a dati accessori di tipo ecologico ed ambientale, in parte rilevati con apposita strumentazione, quali: fase di marea (crescente, morto, calante), temperatura dell acqua (strato superficiale all ombra), salinità ( ), tipologia del substrato, presenza e classe di frequenza delle specie target, note generali sull ambiente e sui popolamenti. Per ogni stazione è stata inoltre realizzata una documentazione fotografica composta da foto di ambiente e foto di dettaglio dell area di campionamento; allo scopo è stata utilizzata una fotocamera digitale (Nikon Coolpix 990). 1 A tal fine sono stati considerati gli studi basati su ripetute campagne di ricerca sul benthos sessile animale, condotte dalla sezione di Ecologia dell Università di Pavia [Occhipinti Ambrogi, 1985; Occhipinti Ambrogi et al., 1988; Sconfietti e Marino, 1989] e i risultati di una serie di campagne specifiche condotte nel in oltre 70 stazioni.

130 130 Fig. 2 - Scheda di campionamento utilizzata per i substrati solidi (a sinistra) e per i substrati mobili (a destra) Le operazioni di prelievo dovevano essere condotte per ogni stazione su substrato solido e su fondale mobile, secondo precise indicazioni relative alle modalità operative da seguire nei due casi. Il corretto svolgimento delle attività di campionamento su substrato solido richiedeva una fase di bassa marea di entità tale da consentire una visione il più possibile completa nel piano mesolitorale; perciò la pianificazione delle uscite ha tenuto conto delle indicazioni fornite dal bollettino delle previsioni di marea. I substrati da campionare dovevano essere coerenti (non in stato esfoliativo, come per esempio materiali ferrosi in ossidazione) e immersi da tempo sufficiente a permettere una completa maturazione dei popolamenti. Per la raccolta manuale sono stati utilizzati contemporaneamente un raschietto e un retino a maglia da mm 3.0 in modo da raccogliere tutto il materiale di dimensioni superiori alla luce della rete. La componente biologica, il più possibile completa, ovvero sia sessile che vagile, è stata prelevata su un area di estensione sufficiente a fornire un campione presumibilmente significativo dei popolamenti esistenti. I campionamenti su fondale mobile sono stati condotti nei pressi del sito analizzato per i substrati solidi, e comunque entro un raggio di 50 metri da questo. Il fondale su cui effettuare i prelievi doveva trovarsi nell orizzonte infralitorale sub-superficiale, ovvero a una profondità compresa fra -0,40 e 2,0 metri dal livello minimo di marea. Per il campionamento è stato utilizzato un rampone costituito da una bocca rigida (60 x 30 cm) munita di 10 denti metallici e di una rete a maglia da 10.0 mm; lo strumento, dotato di un manico lungo circa 4 m, veniva calato in acqua dall imbarcazione e successivamente trainato. La raccolta è stata fatta su un area di estensione tale da produrre un campione sufficientemente rappresentativo dei popolamenti presenti e, qualora possibile, un numero statisticamente rilevante di esemplari delle specie target. Il materiale raccolto è stato trattato seguendo la stessa procedura in entrambi i casi, mantenendolo refrigerato durante le operazioni di raccolta all interno di contenitori termici portatili (da campeggio), alla temperatura di circa 10 C, fino al trasferimento in laboratorio. I campioni sono stati congelati entro 6 ore dal prelievo e conservati in congelatore (-18 C) fino al momento delle analisi o della successiva fissazione sotto liquido Considerazioni sulle modalità di campionamento Dati gli scopi dalla ricerca, ovvero la raccolta di dati sulla presenza e sulla distribuzione delle specie esotiche e dei rapporti che esse hanno con le specie autoctone considerate, si sono usate delle specifiche modalità di campionamento.

131 Per il prelievo su substrati mobili si è preferito, alle classiche metodologie quantitative operanti su superfici note ma di norma piuttosto limitate (benne, carotatori, box corer ecc.), l utilizzo più appropriato in questi casi di una metodologia qualitativa quale il rampone, che pur non lavorando su superfici precise offre, applicando un adeguato sforzo di pesca, la massima garanzia di raccolta delle specie target qualora presenti. Data la maglia della rete utilizzata (mm 10.0) l attrezzo usato può essere considerato, almeno per le specie in oggetto, sostanzialmente non selettivo e pertanto in grado di fornire dati sulle frequenze relative delle diverse specie all interno delle singole comunità. Per campionare il substrato solido è stato utilizzato un apposito raschietto, operando su una superficie identificata e fotografata, in regime di bassa marea in modo da lavorare in condizioni di emersione. In ambedue le tipologie di campionamento, lo sforzo di pesca e le aree campionate sono state modulate in base alle condizioni locali per poter offrire la massima probabilità di individuare le specie target qualora presenti, secondo gli obiettivi della ricerca. L intera serie di campionamenti è stata effettuata tra i mesi di maggio e settembre 2002, in modo da poter fornire dati omogenei relativi alla stessa fase estiva. I dati ottenuti, pur nei limiti imposti dall assenza di ripetizioni di tipo stagionale o annuale, forniscono un immagine rappresentativa della distribuzione delle specie target nell intera area lagunare; hanno inoltre permesso una prima analisi dei rapporti, ed in particolare delle frequenze relative, tra le specie target all interno delle singole stazioni Attività di laboratorio Il lavoro di analisi dei campioni si è articolato in tre fasi fondamentali. Durante una prima fase di smistamento sono state separate la frazione inorganica e la tanatocenosi dalla componente vivente al momento del prelievo. Nei campioni esaminati la frazione inorganica, sempre piuttosto ridotta, consisteva in genere di frammenti litici e pezzi di vetro e di laterizi. La tanatocenosi è risultata costituita principalmente da conchiglie di molluschi, sia intere che frammentate, e, in misura minore, da tubi di policheti serpuloidei e materiale organico vario (resti di radici, rizomi o fronde di fanerogame marine, ecc.). Sulla componente organica prelevata viva è stata poi effettuata una suddivisione tassonomica primaria (Poriferi, Cnidari, Molluschi, Policheti, Crostacei, Briozoi, Echinodermi, Tunicati, Pesci); in seguito si è provveduto all individuazione degli esemplari appartenenti alle specie target. L identificazione tassonomica si è avvalsa di uno stereoscopio da dissezione; le determinazioni sono avvenute tramite la consultazione delle collezioni di confronto conservate presso il Museo di Storia Naturale di Venezia e della principale bibliografia internazionale di riferimento. Infine sono stati effettuati i rilevamenti quantitativi. Gli esemplari appartenenti alle specie target sono stati conteggiati e pesati con una bilancia elettronica di precisione. E stato rilevato il peso umido sgocciolato che nei molluschi si riferisce all animale intero, compresa la conchiglia; nel caso questa non fosse completa, si è provveduto a integrarne la parte mancante con frammenti compatibili presenti nel detrito. E stato riportato, quando rilevabile, il sesso dell esemplare. Sono state rilevate le misure biometriche mediante calibro a divisione di mm E stata inoltre realizzata una documentazione fotografica del campione nella sua totalità e delle singole specie presenti; in alcuni casi singoli individui e particolari anatomici sono stati fotografati nel dettaglio, anche al microscopio (Fig. 3). 131

132 132 Fig. 3 - Esempio di foto d insieme (a sinistra) e di dettaglio (a destra) di specie target rinvenuta in un campione (Crassostrea gigas) I campioni sono stati successivamente fissati e conservati nelle collezioni del Museo di Storia Naturale di Venezia; ogni utile dato di campagna (provenienza, data, caratteristiche e tipologie dell ambiente) è stato riportato mediante etichettatura e schedatura. Per ogni stazione si è quindi arrivati a determinare la composizione faunistica nei due substrati analizzati (solido e mobile), con stime relative alla frequenza in numero e in peso di ciascuna specie all interno del campione. Sono state quindi elaborate le carte distributive delle specie alloctone target in laguna di Venezia e valutate le potenziali relazioni con le specie autoctone Elaborazione L analisi dei dati raccolti (Fig. 4-6) ha permesso di elaborare una serie di carte distributive relative alle specie target nelle diverse aree lagunari, fornendo per ogni stazione le frequenze relative per ciascuna specie esotica in numero ed in biomassa. Si è quindi proceduto ad un analisi complessiva dei dati sull intero bacino lagunare per fornire alcune considerazioni in merito alle dinamiche di diffusione e acclimatazione delle specie in esame, e alle interazioni evidenziabili sulle specie locali. Si è potuto riscontrare come l acclimatazione di nuove specie esotiche in un ambiente particolare per caratteristiche ambientali ed ecologiche quale appunto la laguna di Venezia sia un processo complesso che può condurre a risultati molto diversi, in funzione di numerose variabili. Lo scenario risultante appare quindi eterogeneo e costituito da situazioni molto diverse. Diffusione percentuale sul totale delle stazioni 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0% 88% O. edulis C. gigas 82% 12% 12% 76% C. glaucum T. decussatus S. inaequivalvis T. philippinarum 71% 53% C. aestuarii D. sayi autoctone alloctone Fig. 4 - Diffusione percentuale delle specie sul totale delle stazioni

133 pesi totali (gr) totali individui 133 Abbondanze totali (numeri individui) autoctone alloctone 1 0 O. edulis C. gigas C. glaucum T. decussatus S. inaequivalvis T. philippinarum C. aestuarii D. sayi Fig. 5 - Abbondanze totali delle specie sul totale delle stazioni (numero di individui) Abbondanze totali (biomassa) ,6 101, ,2 autoctone alloctone 10 4,4 1 0 O. edulis C. gigas C. glaucum T. decussatus S. inaequivalvis T. philippinarum C. aestuarii D. sayi Fig. 6 - Abbondanze delle specie sul totale delle stazioni (biomassa) Crassostrea gigas e Saccostrea commercialis L ostrica orientale Crassostrea gigas (Fig. 7), introdotta deliberatamente nella laguna di Venezia nel 1966, ha sviluppato un rapido processo di espansione che l ha portata in pochi anni a colonizzare tutto il bacino lagunare [Cesari e Pellizzato, 1985]. I dati della ricerca confermano questa diffusione in tutta l area di studio dal momento che la specie risulta presente nell 88 % delle stazioni, nelle diverse tipologie ambientali. In molti casi i substrati coerenti sono apparsi completamente ricoperti da strati successivi dell ostrica, capace di colonizzare ogni superficie disponibile; talvolta porzioni di questi aggregati si distaccano e, assieme ai corpi solidi affioranti dai fondali, fungono da innesco per un ulteriore insediamento anche sul substrato mobile, dove effettivamente numerosi esemplari della specie sono stati rinvenuti. La diffusione di Crassostrea gigas ha probabilmente causato il declino dell autoctona Ostrea edulis (Fig. 8), storicamente presente ed abbondante in tutta la laguna veneta, dalle aree di bocca di porto alle valli da pesca [Cesari e Pellizzato, 1985]. La specie non è stata infatti rinvenuta con esemplari viventi in nessuna delle stazioni campionate; in una sola occasione è stato rinvenuto un nicchio vuoto, peraltro apparentemente non recente. La stessa sorte di Ostrea edulis avrebbe seguito la seconda specie esotica di ostrica introdotta in laguna nel 1984, Saccostrea commercialis (Fig. 9); segnalata infatti a partire dal 1984 sia nel bacino Sud (Chioggia) che Nord (isola di Sant Erasmo), dopo un primo breve periodo di relativa diffusione se ne sono perse le tracce [Cesari e Pellizzato, 1985]. In questo caso non sono state rinvenute nemmeno valve detrite, a testimonianza del modesto grado di diffusione e del breve

134 periodo di permanenza in laguna. La specie ha probabilmente dovuto cedere alla pressione della più competitiva Crassostrea gigas, mostrando un grado di adattamento a condizioni di tipo lagunare meno marcato. (Fig. 4-6, 10 e11) 134 Fig. 7 - Crassostrea gigas Fig.8 - Ostrea edulis Fig. 9 - Saccostrea commercialis Frequenza relativa (numero individui) 0% Frequenza relativa (biomassa) 0% 100% 100% Ostrea edulis Crassostrea gigas Ostrea edulis Crassostrea gigas Fig Frequenza relativa in numero di individui (a sinistra) e biomassa (a destra) di Crassostrea gigas e Ostrea edulis Fig Distribuzione di Crassostrea gigas, Ostrea edulis e Saccostrea commercialis in laguna di Venezia

135 Tapes philippinarum Effetti simili a quelli determinati dall ostrica giapponese nei substrati solidi sono stati provocati nei fondali mobili dal Mollusco Bivalve Tapes philippinarum (Fig. 12), che appare ampiamente distribuito in laguna essendo stato rinvenuto con esemplari vivi nel 76 % delle stazioni. La sua grande diffusione, come noto, ha determinato l enorme sviluppo di una specifica attività di pesca, esercitata spesso con attrezzi molto impattanti per le comunità bentoniche, quali casse di metallo trainate da potenti motori fuoribordo che smuovono il sedimento. Tale attività può arrivare a sforzi per unità di superficie davvero notevoli, con periodici ritorni su aree già sfruttate, data l elevata capacità di ricolonizzazione propria di Tapes philippinarum [AA.VV, 2000]. Ciò determina tuttavia pesantissime ripercussioni sulle comunità bentoniche, in particolare sulla grande percentuale costituita da specie dotate di minori capacità di resilienza. Il risultato di questo fenomeno appare evidente esaminando la distribuzione dell autoctona vongola verace Tapes decussatus (Fig. 15), presente in due sole stazioni (la n 3, San Giacomo in Palude, e la n 8, Torre Massimiliana) con valori di frequenza estremamente bassi in relazione alla specie esotica Tapes philippinarum, circa 1 a 100 nella frequenza numerica e 0.13 a 100 nei valori di biomassa. Tale distribuzione risulta probabilmente non casuale dal momento che in questi due siti la presenza di praterie di fanerogame ostacola, come noto, la pesca con attrezzi meccanici. In una delle due stazioni (Torre Massimiliana) l area è sottoposta nel periodo estivo a un intenso prelievo di tipo dilettantistico mediante raccolta manuale, non paragonabile negli effetti alla pesca di tipo industriale, ma in grado di giustificare le minori dimensioni degli esemplari della specie autoctona che presenta velocità di accrescimento inferiori. In questo caso quindi, al contrario di quanto osservato per le ostriche, l influenza umana non si è limitata all introduzione, deliberata o meno, della specie esotica in laguna, ma ha probabilmente determinato uno sostituzione per spiazzamento della specie locale mediante il continuo esercizio di una pesca estremamente impattante. E pertanto ipotizzabile che la cessazione o la diminuzione di tale attività aumenterebbe le capacità di competizione di Tapes decussatus, come indicherebbe la pur esigua presenza della specie nelle stazioni 3 e 8, in situazioni meno soggette a disturbo. (Fig. 4-6, 14 e15) Fig.12 - Tapes philippinarum Fig Tapes decussatus

136 136 Frequenza relativa (numero individui) 1% Frequenza relativa (biomassa) 0,13% 99% 99,87% Tapes decussatus Tapes philippinarum Tapes decussatus Tapes philippinarum Fig Frequenza relativa in numero di individui (a sinistra) e biomassa (a destra) di Tapes philippinarum e Tapes decussatus Fig Distribuzione di Tapes philippinarum e Tapes decussatus in laguna di Venezia Scapharca inaequivalvis Una situazione ancora diversa viene delineata relativamente a Scapharca inaequivalvis (Fig. 16), specie indopacifica segnalata in laguna di Venezia a partire dal 1976 e successivamente diffusasi in tutto il bacino lagunare, dalle aree prossime alle bocche di porto alle zone marginali della gronda lagunare fino alle valli da pesca [Cesari e Pellizzato, 1985]. Per la sua ampia valenza ecologica la specie è apparsa particolarmente incline ad occupare gli stessi ambienti distributivi dell autoctono bivalve Cerastoderma glaucum (Fig. 17), anch esso ampiamente presente in laguna tra la malacofauna bentonica [Giordani Soika, 1949; Curiel et al. 1996]. Mentre tuttavia per questa specie la diffusione risultante dalla nostra ricerca si presenta molto simile a quella attesa, e in buona parte ancora sovrapponibile a quella fornita per il 1968 [Giordani Soika e Perin, 1974], la distribuzione di Scapharca inaequivalvis appare decisamente più limitata di quella indicata da Cesari e Pellizzato [1985]. La specie esotica risulta in effetti presente solamente nel 12 % delle stazioni, ed in una zona relativamente localizzata del bacino centrosettentrionale (stazioni 8 e 9), con valori di abbondanza relativa sempre molto bassi rispetto a Cerastoderma glaucum, rispettivamente il 13 % e l 8 %. I motivi di una così sensibile diminuzione non sembrano riconducibili a limiti espressi dall ecologia della specie. E ipotizzabile che la grande diffusione di Tapes philippinarum in laguna e il conseguente imponente sviluppo della relativa pesca con attrezzi meccanici, responsabili di un

137 fortissimo impatto sui popolamenti bentonici [Pranovi e Giovanardi, 1994], possano aver esercitato un azione negativa anche su questa specie esotica. Non casuale in questo senso potrebbe risultare la localizzazione delle due stazioni di rinvenimento: la n 8 (Torre Massimiliana), in presenza di praterie di fanerogame che sembrano come abbiamo visto ostacolare la pesca meccanica, e la n 9 (Fusina), posta al centro dell area di preclusione alla pesca dei molluschi eduli istituita dal Comune di Venezia per motivi di inquinamento dei sedimenti. (Fig. 4-6, 18 e19) 137 Fig.16 - Scapharca inaequivalvis Fig Cerastoderma glaucum Frequenza relativa (numero individui) 1% Frequenza relativa (biomassa) 7% 99% 93% Cerastoderma glaucum Scapharca inaequivalvis Cerastoderma glaucum Scapharca inaequivalvis Fig Frequenza relativa in numero di individui (a sinistra) e biomassa (a destra) di Scapharca inaequivalvis e Cerastoderma glaucum

138 138 Fig Distribuzione di Scapharca inaequivalvis e Cerastoderma glaucum in laguna di Venezia Dyspanopeus sayi Il quadro appare piuttosto articolato nel caso di Dyspanopeus sayi (Fig. 20), il mud crab di provenienza nord-atlantica protagonista di un impressionante esplosione demografica nella prima fase del suo processo di diffusione in laguna, cui è seguita un apparente scomparsa (Mizzan, 1995). La ricerca ha permesso di verificare l effettiva acclimatazione della specie, rinvenuta nel 53 % delle stazioni, sia nei substrati solidi che mobili, in una situazione di apparente equilibrio con l autoctono Carcinus aestuarii (Fig. 21), che non sembra a prima vista risentire della presenza della specie esotica. In realtà Dyspanopeus sayi presenta frequenze particolarmente elevate in corrispondenza delle aree di bocca di porto e presso le aree più interne prossime alla gronda lagunare o alle valli da pesca, ambienti questi a caratteristiche più estreme, probabilmente più affini alla sua alta valenza ecologica. Carcinus aestuarii invece, pur se ampiamente distribuito in laguna, appare dominante sulla specie esotica nelle aree centrali ed intermedie, mentre in quelle estreme innanzi esaminate risulta decisamente meno frequente o addirittura assente. (Fig. 4-6, 22-24) Dyspanopeus sayi inoltre, a dispetto delle preferenze ecologiche indicate dal nome comune, sembrerebbe maggiormente competitivo con la specie autoctona sul substrato solido che su quello mobile. Appare verosimile che su fondali aperti e privi di frequenti nascondigli la specie esotica possa essere disturbata, in maniera peraltro difficilmente stimabile, da quella autoctona che presenta in genere dimensioni maggiori, e cerchi pertanto rifugio tra gli anfratti e le piccole cavità create dagli organismi incrostanti o dalla superficie stessa del substrato solido (fessure di rive in muratura, di pali in legno ecc.). L ipotesi è suggerita dal fatto che la maggior parte degli esemplari di Dyspanopeus sayi sono stati raccolti nascosti dentro nicchi vuoti dell ostrica Crassostrea gigas, che come abbiamo visto colonizza spesso massicciamente i substrati coerenti.

139 139 Fig Dyspanopeus sayi Fig Carcinus aestuarii Frequenza relativa (numero individui) Frequenza relativa (biomassa) 23% 49% 51% 77% Carcinus aestuarii Dyspanopeus sayi Carcinus aestuarii Dyspanopeus sayi Fig Frequenza relativa in numero di individui (a sinistra) e biomassa (a destra) di Dyspanopeus sayi e Carcinus aestuarii Fig Distribuzione di Dyspanopeus sayi e Carcinus aestuarii in laguna di Venezia (substrato mobile)

140 140 Fig Distribuzione di Dyspanopeus sayi e Carcinus aestuarii in laguna di Venezia (substrato solido) Altre specie Nel corso della ricerca è stato possibile accertare la presenza in laguna di Venezia di tre nuove specie esotiche mai segnalate prima per quest area: i Molluschi Bivalvi Musculista senhousia e Anadara demiri (Piani, 1981) di origine orientale e il Crostaceo Decapode Rhitropanopeus harrisii (Gould, 1841) di provenienza Nord Atlantica (Fig ). Fig Musculista senhousia Fig Anadara demiri Fig Rhithropanopeus harrisii I dati relativi a Rhithropanopeus harrisii sono stati elaborati insieme a quelli degli altri Crostacei Decapodi che costituivano oggetto dello studio (Fig ). Rhithropanopeus harrisii era stato segnalato per il Mediterraneo nel 1994 in un unico sito Adriatico (delta del Po) [Mizzan e Zanella, 1996]. Per il sospetto che questa specie, dotata di un ampia valenza ecologica come altre esaminate in questa sede, fosse già giunta in laguna, sono state attentamente monitorate alcune stazioni in ambienti con tenori di salinità particolarmente bassi, quali le stazioni 7, 11 e 17. L effettivo ritrovamento della specie in due di queste tre stazioni conferma l utilità della banca dati appositamente allestita nella valutazione di eventuali specie candidate a nuove introduzioni e del relativo rischio di diffusione, così come conferma la validità delle metodologie utilizzate in funzione dei risultati raggiunti. Nel caso specifico di Rhitropanopeus harrisii, date le sue caratteristiche, in particolare la predilezione per gli ambienti a salinità molto bassa, si ritiene improbabile una sua ampia colonizzazione della laguna veneta; la specie potrebbe tuttavia raggiungere localmente valori anche

141 molto alti di abbondanza in aree con tali caratteristiche. Ci attendiamo quindi una sua ulteriore diffusione nel bacino Sud presso Valle di Brenta (staz. 17) e forse nelle aree centro meridionali (Valle Millecampi), ma risulterà molto difficile per questa specie, anche alla luce di quanto esposto sull interazione di Dyspanopeus sayi con l autoctono Carcinus aestuarii, conquistare le aree più centrali della laguna, caratterizzate da valori di salinità più elevati e maggiore abbondanza della specie locale Carcinus aestuarii, anche in questo caso di taglia decisamente maggiore. Non stupirebbe al contrario che aree a salinità molto bassa, particolarmente se chiuse o isolate quali alcune valli da pesca, presentassero nel prossimo futuro esplosioni demografiche anche particolarmente rilevanti, come già accaduto nel delta del Po [Mizzan e Zanella,1996]. 141 Diffusione percentuale Decapodi substrato mobile Diffusione percentuale Decapodi substrato solido 100% 80% 60% 40% 20% 0% 53% 6% 29% Carcinus aestuarii Rhithropanopeus harrisii Dyspanopeus sayi 100% 80% 60% 40% 20% 0% 71% 6% 41% Carcinus aestuarii Rhithropanopeus harrisii Dyspanopeus sayi Fig Diffusione percentuale dei Decapodi sul totale delle stazioni per il substrato mobile (a sinistra) e solido (a destra) Diffusione percentuale Decapodi 100% 80% 60% 40% 20% 71% 12% 53% Carcinus aestuarii Rhithropanopeus harrisii Dyspanopeus sayi 0% Fig Diffusione percentuale dei Decapodi target sul totale delle stazioni

142 142 Fig Distribuzione dei Decapodi target in laguna di Venezia Risultati ottenuti (conclusioni) La ricerca condotta ha permesso di confermare la presenza di tutte le specie alloctone individuate come target con la sola eccezione di Saccostrea commercialis, la cui effettiva attuale sopravvivenza in laguna di Venezia era già stata considerata molto dubbia [Mizzan, 1999]. Tuttavia tanto il grado di diffusione delle specie nelle diverse aree lagunari, quanto gli effetti dell interazione con le specie autoctone potenzialmente più coinvolte dall introduzione delle entità esotiche appaiono molto diversificati da caso a caso. Sono stati in effetti documentati diversi gradi di successo, inteso come frequenza relativa degli individui e come percentuale di ritrovamento nelle diverse stazioni, nell acclimatazione delle specie alloctone. Talvolta ad un primo insediamento segue un apparente estinzione, come nel caso del Mollusco Bivalve Saccostrea commercialis la cui diffusione in laguna è risultata solo temporanea. In altri casi si sono osservati veri e propri fenomeni di esplosione demografica seguiti da un successivo assestamento su valori inferiori, come è accaduto per il Crostaceo Decapode Dyspanopeus sayi e per il Mollusco Bivalve Scapharca inaequivalvis. Infine, per talune specie si è verificata una diffusione massiccia con sostanziale colonizzazione di ogni ambiente disponibile, come nei casi di Tapes philippinarum nei substrati mobili e Crassostrea gigas in quelli solidi. Molto articolato appare anche il quadro relativo ai fenomeni di interazione. In alcuni casi l introduzione di specie alloctone non sembra produrre alcun effetto sulle specie locali, come accade per il bivalve Cerastoderma glaucum la cui diffusione in laguna è rimasta pressoché immutata nonostante l arrivo di Scapharca inaequivalvis negli stessi ambienti distributivi potesse dare origini a fenomeni di competizione. Analoga pare la situazione dell autoctono granchio Carcinus aestuarii, che non sembra risentire della presenza dell esotico Dyspanopeus sayi. In altri casi si è potuta invece osservare una drastica riduzione, fino alla scomparsa quasi totale o completa, della specie locale congenere o comunque collocata nella stessa nicchia ecologica. Appare infatti significativa la situazione della vongola verace Tapes decussatus, presente ormai solo nei siti non sottoposti all intensa pressione di pesca esercitata sull affine vongola filippina Tapes philippinarum. Ancora più pesante è stato l impatto dell ostrica Crassostrea gigas sulla locale Ostrea edulis Linnaeus, 1758, che sembra essere completamente scomparsa dall ambito lagunare. Tale fenomeno di sostituzione delle specie indigena da parte della specie esotica, prescindendo dal meccanismo di introduzione iniziale, può risultare completamente indipendente dall azione

143 dell uomo, come nel caso di Crassostrea gigas, o ancora riconducibile all azione antropica, nei casi esaminati particolarmente attraverso la pesca con attrezzature meccaniche e forse l inquinamento nel caso di Tapes philippinarum. Per questa specie alloctona è infatti accertata la maggior capacità rispetto alle specie indigene di sopportare locali situazioni di disturbo. In questo caso l elevata valenza ecologica della specie alloctona, in particolare la velocità di accrescimento e l efficacia riproduttiva, può aumentare l effetto di spiazzamento sulla specie locale esaltando le capacità competitive di quella esotica, particolarmente in presenza di una forte situazione di disturbo quale un elevato sforzo di pesca. Nel corso della ricerca è stato inoltre possibile accertare la presenza in laguna di Venezia di tre nuove specie esotiche mai segnalate prima per quest area, i Molluschi Bivalvi Musculista senhousia e Anadara demiri di origine orientale e il Crostaceo Decapode Rhitropanopeus harrisii di provenienza Nord Atlantica. I dati relativi a quest ultima specie sono stati inoltre elaborati insieme a quelli della specie autoctona Carcinus aestuarii e a quella esotica Dyspanopeus sayi che costituivano oggetto dello studio Pubblicazioni prodotte Mizzan L., Segnalazioni 18 - Anadara demirii. Boll. Mus. Civ. Stor. Nat. Venezia, 53: Mizzan L., Segnalazioni 19 - Musculista senhousia. Boll. Mus. Civ. Stor. Nat. Venezia, 53: 266 Mizzan L., Segnalazioni 20 - Corbicula fluminea. Boll. Mus. Civ. Stor. Nat. Venezia, 53: Mizzan L., Segnalazioni 41 - Gyge branchialis. Boll. Mus. Civ. Stor. Nat. Venezia, 53: Mizzan L., Segnalazioni 42 - Palaemon serratus. Boll. Mus. Civ. Stor. Nat. Venezia, 53: Mizzan L., Segnalazioni 43 - Galathea squamifera. Boll. Mus. Civ. Stor. Nat. Venezia, 53: 274 Mizzan L., Trabucco R., First results of a research project on the diffusion of allocthonous marine species (zoobenthos) in the Lagoon of Venice. Mollusks: affinities and differences with the Mediterranean situation. In: ISTITUTO VENETO DI SCIENZE, LETTERE ED ARTI & CORILA (Eds.), Scientific research and safeguarding of Venice, Corila Research Program 2001 Results, La Garangola, Padova: Tagliapietra G. (Relatori Bressan M. e Mizzan L.), 2002/2003. Tesi di laurea in Scienze Naturali, Università di Padova: Nuovi dati sulla presenza e distribuzione di specie alloctone del macrozoobenthos della laguna di Venezia Bibliografia di riferimento AA.VV., Piano per la gestione delle risorse alieutiche delle laguna della provincia di Venezia. Provincia di Venezia, Assessorato alla Caccia, Pesca e Polizia Provinciale. 102 pp. Cesari P., I Molluschi della Laguna di Venezia. Arsenale Editrice, Venezia, 189 pp. Cesari P., Pellizzato M., Molluschi pervenuti in Laguna di Venezia per apporti volontari o casuali. Acclimazione di Saccostrea commercialis (Iredale & Roughely, 1933) e di Tapes philippinarum (Adams & Reeve, 1850). Boll. Malacologico, Milano, 21 (10-21), pp Froglia C., Speranza S., First record of Dyspanopeus sayi (Smith, 1869) in the Mediterranean Sea (Crustacea: Decapoda: Xanthidae). Quad. Ist. Ric. Pesca Marittima, 5(2), Ancona, pp Giordani Soika A., Notizie e considerazioni preliminari sulla fauna sottobasale delle praterie di Zostera della Laguna di Venezia. Atti Soc. Nat. Mat. Modena, 80: p. 15. Giordani Soika A., Perin G., L inquinamento della Laguna di Venezia: studio delle modifiche chimiche e del popolamento sottobasale dei sedimenti lagunari negli ultimi vent anni. Boll. Mus. Civ. Venezia, XXVI (I), pp

144 Mizzan L., Notes on presence and diffusion of Dyspanopeus sayi (Smith, 1869) (Crustacea, Decapoda, Xanthidae) in the Venetian lagoon. Boll. Mus. civ St. nat. Venezia, 44 (1993), pp Mizzan L., Le specie alloctone del macrozoobenthos della Laguna di Venezia: il punto della situazione. Boll. Mus. civ. St. Nat. Venezia, 49 (1998), pp Mizzan L., Trabucco R., First results of a research project on the diffusion of allocthonous marine species (zoobenthos) in the Lagoon of Venice. Mollusks: affinities and differences with the Mediterranean situation. In: Istituto Veneto di Scienze, Lettere ed Arti & CORILA (Eds.), Scientific research and safeguarding of Venice, Corila Research Program 2001 Results. La Garangola, Padova, pp Mizzan L., Zanella L., First record of Rhithropanopeus harrisii (Gould, 1841) (Crustacea, Decapoda, Xanthidae) in the Italian waters. Boll. Mus. civ. St. Nat. Venezia, 46 (1995), pp Occhipinti Ambrogi A., The zonation of Bryozoans along salinità gradients in the Venice Lagoon (Northern Adriatic). In: Nielsen C. e G.P. Larwood (Eds.), Bryozoa: Ordovician to Recent. Olsen & Olsen, Fredensborg, pp Occhipinti Ambrogi A., Sconfietti M., Morri C. e Bianchi C.N., Ricerche sulla zonazione spazio-temporale dell epifauna sessile nel settore centrale della laguna veneta. Boll. Mus. civ. St. Nat. Venezia, 38 (1987), pp Pranovi F., Giovanardi O., The impact of hydraulic dredging for short-necked clams, Tapes spp., on an infaunal community in the Lagoon of Venice. Scientia Marina, 58, pp Sacchi C.F., Occhipinti Ambrogi A., Confinement et biocénoses paraliques. Vie et Milieu, 42 (2), pp Sacchi F., Occhipinti Ambrogi A., Sconfietti R., Les lagunes nord-adriatique: un environnément conservateur ouvert aux nouveautés. Bull. Soc. Zool. De France 114 (3), pp Sconfietti M. e Marino R., Patterns of zonation of sessile macrobenthos in a lagoon estuary (Northern Adriatic sea). In: Ros J.D. (Ed.), Topics in Marine Biology. Scient. Mar., 53 (2-3), pp Zariquey Alvarez R., Crustàceos decapodos ibéricos. Investigacion pesquera, tomo 32, Barcelona, 510 pp. 144

145 3.10 Argomento 9 (Biodiversità a livello di comunità macrobentoniche) Composizione unità operativa Elenco di ricercatori e tecnici Cognome nome Istituto di appartenenza Maggiore Francesca CNR-Istituto di Scienze Marine (ISMAR) Taroni Giancarlo CNR-Istituto di Scienze Marine (ISMAR) Elenco di studenti (tesi, PhD, ecc.) Cognome nome Istituto di appartenenza Sara Puppini CNR-Istituto di Scienze Marine (ISMAR) Erica keppel CNR-Istituto di Scienze Marine (ISMAR) Obiettivi Pearson & Barnett (1987), in un ampia revisione sui cambiamenti a lungo termine del benthos, mettono in luce come i processi a livello di popolazione e di comunità siano misure importanti dei cambiamenti climatici globali e delle perturbazioni locali. Le società umane incidono sui rapporti tra compartimenti abiotici e biotici dell ecosistema agendo sui cicli biogeochimici da una parte e sulla dinamica di popolazione e di comunità dall altra; perciò la biodiversità risulta un modo tangibile di valutare lo stato di un ecosistema (Barbault & Hochberg, 1992). Gli studi di biodiversità a livello di comunità analizzano come le aggregazioni di specie formino le comunità e interagiscano con l ambiente per formare gli ecosistemi. Ogni specie è identificata non solo dalla morfologia, ma anche dall autoecologia (adattamenti fisiologici, abitudini alimentari, ciclo biologico, relazioni interspecifiche) che definisce il suo ruolo ecologico o funzionale. La conoscenza della diversità funzionale della comunità fornisce informazioni sui principali processi ecologici che mantengono la sua struttura ed il suo funzionamento (Piraino & Fanelli, 1997). L obiettivo è quello di identificare aggregazioni di specie con lo stesso ruolo ecologico e ricostruire la distribuzione delle comunità di invertebrati bentonici mettendo in luce relazioni con i parametri ambientali. Il lavoro è stato articolato in due fasi 1) analisi di studi effettuati in laguna di Venezia sulla struttura di comunità macrozoobentoniche di fondo mobile; lo scopo è di avere una panoramica sulla distribuzione delle comunità macrozoobentoniche come base di conoscenza utile per nuove indagini sia in termini di biodiversità specifica che di caratterizzazione biologica. L attenzione è stata concentrata sul bacino di Lido. 2) Sulla base degli studi pregressi è stata scelta un area per nuovi campionamenti; l interesse è stato centrato sull estuario del Dese che rappresenta un habitat particolare della Laguna di Venezia in quanto possiede caratteristiche di vero estuario Attività preliminari Le attività preliminari allo svolgimento del programma di ricerca hanno previsto: 1) la raccolta di dati relativi a studi effettuati in laguna sulla struttura di comunità macrozoobentoniche di fondo mobile. I lavori analizzati sono tre: dati inediti di Giordani Soika concessi dal Museo Civico di Storia Naturale di Venezia relativi a campionamenti effettuati nel 1948 e nel 1968; la pubblicazione Le alghe della laguna di Venezia a cura dell Assessorato all Ecologia del Comune di Venezia, in cui vengono riportati dati relativi a campionamenti effettuati nel (Comune di Venezia-Assessorato all Ecologia, 1991); un rapporto tecnico del

146 Consorzio Venezia Nuova in cui vengono riportati dati relativi a campionamenti effettuati fra il 1991 ed il 1994 (Biotecnica 1994). 2) la pianificazione dei campionamenti, argomento illustrato nella relazione tecnicoscientifica del quarto semestre (dicembre 2002) presentata al CORILA (allegato WP4\1). 3) La pianificazione del lavoro che è stato organizzato seguendo un percorso sintetizzato nel diagramma seguente 146 Raccolta dati di struttura di comunità bentoniche di fondo mobile: 1) da dati di letteratura 2) da campionamenti Lista di specie aggiornata secondo la nomenclatura e la sistematica corrente Tabelle di contingenza Schede segnaletiche per ogni specie contenenti informazioni di sistematica e di autoecologia Strumenti statistici Classificazione delle comunità Attività in campo ed in laboratorio In Fig.1 sono evidenziate le stazioni campionate ed in Tab. 1 le coordinate geografiche. I campionamenti sono stati effettuati nei mesi di giugno, agosto ed ottobre 2002.

147 147 STAZIONI LOCALITÀ 1 S. Erasmo 2 Punta Vela 3 Scanello(PaludedellaCentrega) 4 Crevan (Palude di Burano) 5 Chiavichetta(Palude della Centrega) 6 Canale di Torcello (Palude della Rosa) 7 Buel del Lovo 8 Palude di Cona 9 Palude di Cona COORDINATE GEOGRAFICHE N E N E N E N E N E N E N E N E N E Tab. 1: coordinate geografiche delle stazioni di campionamento E stato utilizzato un box-corer modello Ekman; le misure della base sono 14,5x15 cm, l altezza 17 cm. Sono state effettuate 5 repliche per stazione (area di campionamento totale = 0,1 m²) I campioni prelevati sono stati setacciati con un getto d acqua su un setaccio di maglia 1 mm. Il materiale setacciato è stato posto in barattoli di plastica dove è stata aggiunta una quota sufficiente al suo ricoprimento di soluzione di idrato di cloralio all 1% per anestetizzare gli orgnanismi (200 cc). Dopo mezz ora è stata aggiunta formalina all 8 % tamponata con carbonato di calcio per ottenere una soluzione finale al 4%. In laboratorio si è proceduto allo smistamento, a occhio nudo e con l aiuto di un microscopio binoculare ed al conteggio degli organismi raccolti. Gli organismi animali sono stati dapprima ripartiti nei diversi phyla e poi s è proceduto alla determinazione fino al livello di specie, ove possibile, dei Molluschi e dei Policheti. L uso dell idrato di cloralio è risultato efficace per anestetizzare i policheti con la proboscide estroflessa, carattere essenziale nella determinazione di molte specie, mentre la maggioranza dei molluschi bivalvi è stata rinvenuta con le valve serrate. Poichè per una corretta determinazione dei molluschi bivalvi è necessaria l osservazione della struttura interna delle valve, per la loro apertura si è proceduto come segue: l animale è stato infisso con la parte anteriore in uno strato di plastilina, con un ago molto sottile si è esercitata una pressione sulla parte posteriore nel punto di unione delle valve; alcune valve si sono aperte mostrando l interno pieno di sedimento e questi bivalvi sono stati considerati morti; gli animali che resistevano alla pressione sono stati considerati vivi e sono stati immersi in acqua ossigenata a 120 volumi (MIZZAN, comunicazione personale) per un tempo variabile da uno a quattro giorni secondo la grandezza degli esemplari. Tale composto degrada le parti molli e soprattutto il legamento della cerniera, permettendo l apertura delle due valve senza sforzo e senza pericolo di lesionarle. Oltre che condurre ad una adeguata determinazione, questa

148 procedura.permette di valutare adeguatamente le abbondanze delle specie di molluschi bivalvi che, altrimenti sarebbero sopravalutate. Per la determinazione dei Molluschi si è fatto uso dello stereomicroscopio, mentre le famiglie dei Capitellidae e Spionidae (Policheti) hanno richiesto l uso del microscopio ottico. Le specie appartenenti a queste famiglie sono molto simili a deboli ingrandimenti, mentre, per la determinazione, è necessario conoscere posizione e struttura delle setole, caratteri evidenziabili solo a forti ingrandimenti Elaborazione Le tabelle di contingenza sono state sottoposte ad analisi delle corrispondenze e ad analisi dei cluster. L analisi delle corrispondenze (BENZECRI, 1973) consente di rappresentare le specie e le stazioni sul piano cartesiano in modo che le stazioni simili da un lato e le specie simili dall altro, appaiano geometricamente vicine. I risultati ottenuti dall analisi delle corrispondenze sono stati convalidati dall analisi dei cluster (metodo k c-means) (HARTIGAN, 1975), un metodo geometrico intuitivo, che permette di aggregare le specie e le stazioni in K cluster determinati a priori; il metodo è basato sulla minimizzazione della varianza all interno dello stesso gruppo, e sulla massimizzazione della varianza fra gruppi diversi. Per raggiungere tale condizione il processo viene iterato. Si ottengono così cluster di specie e cluster di stazioni caratterizzati da bassa variabilità interna e forte variabilità fra cluster. Nella presente relazione sono stati considerati i cluster di stazioni ed è stata calcolata l abbondanza percentuale delle specie presenti Risultati ottenuti La raccolta di dati di letteratura ha prodotto una lista di specie (WP4_allegato 2). Tale lista è stata revisionata per quanto concerne la nomenclatura secondo la checklist della fauna d Italia (Bedulli et al., 1995 a,1995b; Bodon et al. (1995); Castelli et al.,1995). I dati più antichi (inediti) risalgono al 1948 e sono relativi a campionamenti effettuati da Giordani Soika; il materiale proveniente da tali campionamenti e depositato presso il Museo Civico di Storia Naturale di Venezia è stato oggetto di revisione (WP4_allegato 3 e WP4_allegato 4) e la lista completa e aggiornata è parte dell allegato 2. In Fig. 2 sono riportate le stazioni di campionamento degli studi analizzati. I risultati dell analisi di questi dati sono riportati in Maggiore (2002), Maggiore e Taroni (2000, 2002), e possono essere sintetizzati in due punti: 1) le differenze nei metodi di campionamento (strumenti di campionamento e tecnica di sorting) fra i tre periodi analizzati (1948, 1968 anni 90) non permette di valutare variazioni di biodiversità in termini di ricchezza specifica; 2) il fattore idrodinamico (che influenza salinità, granulometria e grado di trofia) determina la distribuzione della macrofauna bentonica che si esprime attraverso una graduale sostituzione di specie (marine, miste e lagunari) allontanandosi dalle bocche di porto; questo aspetto è ancora più evidente nei dati degli anni 90 da cui risultano informazioni più precise sulle relazioni fra struttura di comunità e condizioni ambientali, infatti grazie ad un maggiore raffinamento metodologico, vengono segnalate le specie di più piccole dimensioni, molte delle quali indicatrici del grado di trofia. Relativamente ai campionamenti del 2002 in allegato WP4_allegato 5 viene fornita la lista di specie di Molluschi e Policheti rinvenute nelle nove stazioni di campionamento ed in allegato WP4_allegato 6 le tabelle di contingenza. 148

149 Fig.1 - Posizione delle stazioni di campionamento 149

150 150 Fig. 2 - distribuzione delle stazioni nel bacino di Lido. I numeri segnalano le stazioni di campionamento di Giordani Soika ( ); il simboli (*,, x, +, n) quelle del Per meglio interpretare la distribuzione dei Policheti e dei Molluschi, le specie rinvenute nell area di studio sono state raggruppate in base al ruolo ecologico. Grall & Glemarec (1997) hanno definito 5 gruppi ecologici omogenei da un punto di vista della tolleranza delle specie all arricchimento organico nei sedimenti e, secondariamente, sulla base delle categorie trofiche e del ciclo biologico. Borjia et al. (2000) hanno verificato la sequenza di questi gruppi ecologici in ambienti estuarini spagnoli. Vengono di seguito riportati i gruppi ecologici così come definiti da Grall & Glemarec (1997): GRUPPO Ι: specie molto sensibili all arricchimento organico del substrato e presenti in condizioni di assenza di inquinamento (stato iniziale); include carnivori specialisti e alcuni Policheti detritivori tubicoli; GRUPPO ΙΙ: specie indifferenti all arricchimento organico, sempre presenti con una bassa densità e con variazioni non significative nel tempo (da stato iniziale a lieve squilibrio); include filtratori, carnivori meno selettivi e necrofagi; GRUPPO ІІІ: specie tolleranti una presenza molto elevata di materia organica nel sedimento. Queste specie possono trovarsi in condizioni normali ma l abbondanza delle loro popolazioni viene aumentata dall arricchimento organico del substrato (situazioni lievemente squilibrate); sono detritivori superficiali come gli Spionidae tubicoli, che ingeriscono il film superficiale di materia organica depositata in superficie; GRUPPO ІV: specie opportuniste di secondo ordine (situazioni da leggero a pronunciato squilibrio). Sono specie di piccola taglia con un ciclo biologico breve, adattate alla vita in sedimenti ridotti, dove riescono a proliferare; generalmente limivori, come i Cirratulidae;

151 GRUPPO V: specie opportuniste di primo ordine (situazioni di pronunciato squilibrio). Sono detritivori che proliferano dai sedimenti ridotti alla superficie; due specie di Policheti con distribuzione universale sono tipici di questo gruppo, Capitella capitata e Malacoceros fuliginosus. In Tab. 2, per ognuna delle specie rinvenute, è stata riportata la famiglia di appartenenza con le caratteristiche del relativo ciclo vitale (Giangrande, 1997), utilizzando la terminologia proposta da Fauchald (1983) che riconosce tre tipi principali di diagrammi vitali: 1) specie annuali, corrispondono alle specie semelpare. La riproduzione si può manifestare in un unico evento riproduttivo nel corso della vita cui la morte dell individuo. Questo gruppo è caratterizzato da un grande sforzo riproduttivo, uova piccole e sviluppo planctotrofico; 2) specie perenni, che si riproducono più volte nella vita, compiono un basso sforzo riproduttivo, producono grandi uova e non hanno sviluppo planctotrofico; le grosse specie perenni si trovano principalmente nelle comunità di fondo mobile; le specie appartenenti a questo gruppo sono a strategia K e corrispondono alle specie iteropare con riproduzione annuale. 3) specie multiannuali, compiono due o più riproduzioni durante una singola stagione di crescita, compiono un maggior sforzo riproduttivo, producono uova moderatamente grandi e larve lecitotrofiche; vivono spesso in ambienti imprevedibili e sono le specie più evolute dal punto di vista dell ovogenesi: in Streblospio e Capitella l ovulazione può essere completata in una settimana, mentre nei Syllidae si compie in circa 30 giorni. Questa categoria è la più eterogenea ed in essa si trovano le specie a strategia r; le specie multiannuali corrispondono alle specie iteropare con riproduzione semicontinua. Sono, altresì, segnalate le specie indicatrici di inquinamento o arricchimento organico secondo Pearson & Rosenberg (1978) che elencano le specie numerandole da 1 a 9 lungo un gradiente decrescente di arricchimento organico nel sedimento. Si è proceduto altresì, all identificazione dei gruppi trofici secondo la classificazione e la nomenclatura di Fauchald & Jumars (1979). La categoria degli Switching Feeders (SF) in cui sono compresi Hediste diversicolor e alcuni Spionidae, è stata aggiunta sulla base di recenti studi che hanno evidenziato la capacità di alcune specie di modificare il comportamento alimentare a seconda delle risorse disponibili e delle condizioni idrodinamiche. Queste specie con adattamenti particolarmente vantaggiosi in condizioni di elevata variabilità di intensità di flusso e di materiale in sospensione possono costituire un gruppo distinto e molto utile di indicatori ecologici (Thagon et al., 1980). Le tabelle di contingenza (WP4_allegato 6) sono state sottoposte ad Analisi delle Corrispondenze e dei Cluster. I cluster di stazioni (aree colorate dei grafici) sono stati riportati sulla mappa delle aree di campionamento (fig. 4, 6,8); ognuno di essi può raggruppare più stazioni caratterizzate da una certa omogeneità dei popolamenti animali e rappresenta quindi una comunità. Per ogni cluster si è caratterizzato l habitat utilizzando dati sui parametri fisico-chimici forniti dal Ministero Delle Infrastrutture e dei Trasporti-Magistrato alle Acque tramite il suo concessionario Consorzio Venezia Nuova (1999, 2001). PRIMAVERA La Fig. 3 illustra i risultati dell Analisi delle Corrispondenze e dei Cluster (nubi colorate). Le stazioni e le specie sono distribuite in una nube parabolica; quando il modello di ordinamento assume questa struttura, nota come effetto Guttmann (cfr. Benzecri, 1973), il sistema analizzato è sottoposto ad un fenomeno unidimensionale materializzato sul primo asse (X); il secondo asse è funzione parabolica del primo ed introduce un effetto intensità aggiungendo poca informazione rispetto al primo. Tale modello si riscontra esaminando le variazioni del popolamento associate a gradienti ambientali. I primi due assi esprimono il 48% della varianza totale (asse X=25,5% e asse Y=21,0%). L asse X contrappone il cluster 1 (st 1 e 3, più prossime alla bocca di porto) al cluster 4 (st. 7,8, 9, le stazioni più interne) con i cluster 2 (st 2) e 3 (st. 4,5,6) in posizione intermedia. L applicazione della cluster analysis ha permesso di identificare più chiaramente 4 cluster di stazioni (fig.4); in 151

152 Tab. 2 sono state riportata l abbondanza media percentuale delle specie più abbondanti all interno di ciascun cluster. - CLUSTER 1 (indaco): comprende le stazioni St. 1-3 con sedimenti a granulometria da sabbia fangosa a fango, N. latericeus è la specie percentualmente più abbondante, seguita da S. shrubsolii; le specie che la caratterizzano sono principalmente specie marine tipiche di fondi sabbio fangosi e fango-sabbiosi (Gambi & Giangrande, 1986; Gravina & Somaschini, 1990; Cinar et Al., 1998) come N. latericeus, P. lyra, S. scutata. L 85% delle specie appartiene al gruppo ecologico III, il 2,8% al gruppo V, l 1,3 % al IV. - CLUSTER 2 (ocra): contiene la St. 2; il sedimento è sabbio-fangoso; è caratterizzata dalla forte abbondanza percentuale di S. shrubsolii, specie paralica tipica di sedimenti sabbio-fangosi ricchi di sostanza organica (Pearson & Rosenberg, 1978; Sardà & Martin, 1993; Lardicci et al., 1995). L 89,2% delle specie appartiene al gruppo III, il 6,7 al gruppo I e l 1,8% al gruppo II. - CLUSTER 3 (celeste): accorpa le stazioni. 4, 5 e 6; il sedimento è fangoso con percentuali variabili di sabbia, le specie che caratterizzano la comunità sono specie legate ai sedimenti sabbiofangosi o fangosi, principalmente talassoidi come N. hombergi, H. filiformis, M. sanguinea e paraliche come S. shrubsolii e H. diversicolor (Barnes, 1994; Holte, 1998; Platell et al., 1996; Rasmussen,1969; Scaps, 2002). A questa comunità appartiene il mollusco bivalve Hemilepton nitidum specie di cui non si hanno informazioni sul ruolo ecologico e che viene rinvenuto per la prima volta in quest area della laguna. Il 44,9 % delle specie appartiene al gruppo ecologico III, il 33,,0 % al gruppo II, il resto è ripartito fra i gruppi IV e V. - CLUSTER 4(verde): include le stazioni 7, 8 e 9 con sedimenti fangosi fini, le specie che caratterizzano la comunità sono paraliche come H. diversicolor e S. shrubsolii. Il 92,2% delle specie appartiene al gruppo ecologico III. ESTATE La Fig. 5 illustra i risultati dell Analisi delle Corrispondenze e dei Cluster (nubi colorate). I primi due assi esprimono il 50,3% della varianza totale (asse X=27,9% e asse Y=22,4%). Anche in questa stagione le stazioni e le specie sono distribuite in una nube parabolica, sebbene la posizione della st. 1 appiattisca la parabola sull asse X; dal polo negativo al quello positivo si osserva la successione delle stazioni 3, 2, 4 seguite da quelle più interne (5,6,7,8 e 9) con la St. 3 disgiunta dalle altre che sembrano invece disporsi lungo un continuum. L applicazione della cluster analysis ha permesso di identificare più chiaramente 5 cluster di stazioni (fig. 6); in Tab. 4 sono state riportate l abbondanza percentuale delle specie più abbondanti all interno di ciascun cluster. - CLUSTER 1 (giallo) contiene la St. 1; il sedimento è sabbio-fangoso; la comunità è scarsamente strutturata, composta essenzialmente di tre specie. - CLUSTER 2(celeste): contiene la stazione St. 2; il sedimento è sabbio-fangoso, le specie che caratterizzano la comunità sono legate a fondi fangosi, sono marine come M. mecznikovianus, C. capitata, N. latericeus (Lardicci, 1989; Pearson & Rosenberg, 1978) e paraliche come S. shrubsolii. Il 77,3% delle specie appartiene al gruppo ecologico III, l 8,7 al gruppo IV; il 7,8 al gruppo V, l 1% al gruppo II. - CLUSTER 3 (indaco): vi si trova solo la stazione St. 3; il sedimento è fangoso, le specie che la caratterizzano sono marine legate a fondi fangosi come A. multibranchiis, C. clypeata, C. soyeri, N latericeus (Gambi & Giangrande, 1986). Il 38,5% delle specie appartiene al gruppo ecologico III, il 23,7 % al gruppo I. L A. multibranchiis percentualmente dominante in questo cluster non è stata attribuita a nessun gruppo ecologico per mancanza di informazioni sul suo ruolo ecologico. - CLUSTER 4 (rosso): contiene la stazione. 4; il sedimento è fangoso, la comunità: è caratterizzata essenzialmente da S. shrubsolii e da Capitella capitata prima specie nel grado di opportunismo (Grassle & Grassle, 1974; Pearson & Rosenberg, 1978). Il 52,2% delle specie appartiene al gruppo III, il 35,4 al gruppo V ed il 2,3 al gruppo IV. - CLUSTER 5 (arancione): comprende le stazioni St. 5, 6, 7, 8 e 9; la tessitura dei sedimenti va dalla sabbia fangosa al fango fine, la comunità: è caratterizzata da una netta dominanza di specie paraliche (S. shrubsolii e H. diversicolor); il 98,5% delle specie appartiene al gruppo III.. 152

153 AUTUNNO La Fig. 7 illustra i risultati dell Analisi delle Corrispondenze e dei Cluster (nubi colorate). I primi due assi esprimono il 69,3% della varianza totale (asse X=49% e asse Y=20,3%). La stazione 1 si isola da tutte le altre che sono concentrate nell origine degli assi. Tale situazione si verifica in presenza di una sola comunità o di biotopi a caratteristiche fisico-chimiche indistinguibili (Fresi & Gambi, 1982). L applicazione della cluster analysis ha identificato 4 cluster di stazioni (fig. 8); in Tab. 5 sono state riportate l abbondanza percentuale delle specie più abbondanti all interno di ciascun cluster. I cluster sono caratterizzati dalla forte dominanza di S. shrubsolii, che determina alte percentuali del gruppo ecologicoiii. Il cluster 1 fa eccezione in quanto caratterizzato dalla dominanza di Capitella capitata prima specie nel grado di opportunismo. 153

154 Famiglie Cicli Specie Categorie Indicatrici Gruppo Vitali Trofiche arricchimento ecologico organico Buccinidae perenni Nassarius reticulatus C II? Cyclope neritea C I Cardiidae multiannuale Cerastoderma glaucum F III Solenidae? Solen marginatus F I Tellinidae Tellina tenuis SF I Semelidae multiannuale Abra alba D III Abra prismatica D III Abra segmentum D III Abra tenuis D III Veneridae perenni Chamelea gallina F I Tapes decussatus F I Tapes philippinarum F I Paphia aurea F I Maldanidae perenni Euclymene oerstedi LMT I Clymenura clypeata LSS I Phyllodocidae perenni Mysta picta CMI 7 II Phyllodoce maculata CMI II Glyceridae perenni Glycera tridactyla CMA II Glycera unicornis DMT II Glycera rouxii CMA II Nephtydae perenni Nephtys hombergi CMA 9 II Eunicidae perenni Marphysa sanguinea O II Marphysa belli O II Marphysa fallax O II Sabellidae perenni Desdemona ornata FST II 154

155 Famiglie Cicli Specie Categorie Indicatrici Gruppo Vitali Trofiche arricchimento ecologico organico Spionidae multiannuali Spio decoratus DMT III Streblospio shrubsolii SF 3 III Microspio mecznikovianus LMT III Paraonidae annuali Paradoneis lyra LMT III 155 Cossuridae????? Cossura soyeri LMT III Capitellidae multiannuali Heteromastus filiformis LMS 6 III Mediomastus capensis LMS III Mediomastus fragilis LMS III Notomastus latericeus LMS III Notomastus aberrans LMS III Pseudoleiocapitella fauveli LMS III Nereididae annuali Hediste diversicolor SF 4 III Neanthes succinea O III Neanthes caudata DMT 5 III Perinereis cultrifera Sternaspidae????? Sternaspis scutata LMS III Spionidae multiannuali Polydora ciliata DMT 2 IV Prionospio caspersi DMT IV Pseudopolydora antennata DMT IV Cirratulidae? Cirratulus cirratus DMT IV? Cirriformia tentaculata? 8 IV Terebellidae? Polycirrus ind. DSS IV Capitellidae multiannuali Capitella capitata LMS 1 V Retusa truncatula? NA

156 Famiglie Cicli Specie Categorie Indicatrici Gruppo Vitali Trofiche arricchimento ecologico organico Haminea ind. NA Hemilipton nitidum? NA Gastrana fragilis F NA Aphelochaeta multibranchiis DMT NA Micronephtys spaerocirrata CMA NA Phyllodoce madeirensis CMI NA Leiocapitella dollfusi LMS NA 156 Tab. 2 - caratteristiche dell'autoecologia dei Policheti rinvenuti lungo l'estuario del Dese: Giangrande (1997) per cicli vitali, Fauchald e Jumars (1979) per le categorie trofiche, Pearson e Rosenberg (1978) per le specie indicatrici di arricchimento organico (la numerazione va da quella più tollerante, C. capitata, a quelle via via meno tolleranti), Boria et al. (2000) per i gruppi ecologici. NA= Non Attribuito. C= carnivoro, F=filtratore, SF=switching feeder, D, detritivoro; per i policheti CMA (Carnivori, Mobili, Armati), CMI (Carnivori, Mobili, Inermi), DMT (Detritivori superficiali, discretamente Mobili, Tentacolati), DSS (Detritivori Superficiali, Sessili, tentacolati),lms (Limivori Scavatori, Mobili, inermi), LMT (Limivori scavatori, Mobili,, Tentacolati), LMT (Limivori scavatori, Mobili, Tentacolati), o (Onnivori)

157 Fig. 3 - Ordinamento delle stazioni e delle specie in primavera. Le aree colorate indicano i cluster di stazioni. 157

158 158 cluster 1 cluster 2 cluster 3 cluster 4 % % % 69 Nephthys 2 Hediste Notomastus latericeus 56,4 Streblospio shrubsolii,4 hombergii 2,9 diversicolor 62,8 9, Heteromastus 1 Streblospio Streblospio shrubsolii 7,8 Paradoneis lyra 1 filiformis 9,5 shrubsolii 17,5 8, Hemilepton 1 Paradoneis lyra 6 Pseudoleiocapitella fauveli 3 nitidum 2,7 Nereidae ind. 9,7 4, Streblospio 1 Polichaetae Mediomastus capensis 5 Chamelea gallina 1 shrubsolii 1,9 ind. 6,9 Aphelochaeta 2, Hediste 8, Abra multibranchiis 3,7 Paphia aurea 5 diversicolor 5 segmentum 1,6 1, 7, Cerastoderm Sternaspis scutata 3,7 Nephthys hombergii 6 Haminea ind. 6 a glaucum 0,3 0, 5, Capitellidae ind. 2,7 Hemilepton nitidum 8 Desdemona ornata 9 Abra tenuis 0,3 0, Phyllodoce 2, Tapes Capitella capitata 2,7 Cerastoderma glaucum 8 maculata 5 decussatus 0,3 0, 1, Polydora Heteromastus filiformis 2,7 Spionidae ind. 8 Paradoneis lyra 7 ciliata 0,3 0, 1, Nephthys Nassarius reticulatus 1,8 Capitella capitata 8 Cossura soyeri 7 hombergii 0,3 0, Marphysa 1, Hediste diversicolor 1,8 Notomastus latericeus 8 sanguinea 7 Pseudopolydora 0, Cerastoderma 0, antennata 0,9 Neanthes caudata 8 glaucum 8 Pseudoleiocapitella 0, fauveli 0,9 Abra tenuis 8 0, Abra segmentum 0,4 Polydora ciliata 8 0, Spio decoratus 0,4 Capitella capitata 8 Cirriformia tentaculata 0,4

159 159 Cossura soyeri 0,4 Notomastus ind. 0,4 Phyllodoce madeirensis 0,4 Glycera tridactyla 0,4 Neanthes caudata 0,4 Tab. 3 - primavera; abbondanza percentuale delle specie all'interno di ogni cluster

160 Fig. 4 - Clusters di stazioni in Primavera ottenuti con la cluster analysis 160

161 Fig. 5 - Ordinamento delle stazioni e delle specie in estate. Le aree colorate indicano I cluster di stazioni. 161

162 cluster 1 cluster 2 cluster 3 cluster 4 % % % % % Nassarius reticulatus 57 Microspio mecznikovianus 41,3 Aphelochaeta multibranchiis 36 Streblospio shrubsolii 39,6 84,7 Streblospio shrubsolii 28,6 Streblospio shrubsolii 12,6 Clymenura clypeata 22,6 Capitella capitata 35,4 11,6 Glycera rouxii 14,3 Capitella capitata 6,9 Streblospio shrubsolii 11,7 Haminoea ind. 8,3 0,8 Notomastus latericeus 4,7 Cossura soyeri 10,5 Microspio mecznikovianus 4,2 0,6 Polycirrus ind. 4,3 Paradoneis lyra 8,6 Paradoneis lyra 4,2 0,4 Hemilepton nitidum 3,9 Notomastus latericeus 4,9 Polydora ciliata 2,1 0,3 Cerastoderma glaucum 3,3 Heteromastus filiformis 1 Spio decoratus 2,1 0,3 Spio decoratus 3,3 Euclymene oerstedi 0,8 Capitellidae ind. 2,1 0,2 Neanthes caudata 3,3 Neanthes caudata 0,8 Hediste diversicolor 2,1 0,2 Pseudoleiocapitella fauveli 2,6 Hemilepton nitidum 0,4 0,1 Paradoneis lyra 2 Abra ind. 0,4 0,1 Tellina tenuis 1,6 Polycirrus ind. 0,4 0,1 Solen marginatus 1,2 Abra segmentum 0,2 0,1 Prionospio caspersi 1,2 Spionidae ind. 0,2 0,1 Pseudopolydora antennata 1,2 Microspio mecznikovianus 0,2 0,1 Chamelea gallina 1 Spio decoratus 0,2 0,1 Polydora ciliata 0,8 Mediomastus capensis 0,2 0,04 Aphelochaeta multibranchiis 0,8 Pseudoleiocapitella fauveli 0,2 0,04 Paphia aurea 0,6 Phyllodoce maculata 0,2 0,02 Spionidae ind. 0,6 Glycera unicornis 0,2 0,02 Notomastus aberrans 0,6 0,02 Heteromastus filiformis 0,4 0,02 Desdemona ornata 0,4 0,02 Retusa truncatula 0,2 0,02 Abra prismatica 0,2 0,02 Cirratulus cirratus 0,2 Capitellidae ind. 0,2 Mediomastus fragilis 0,2 Mysta picta 0,2 Micronephtys sphaerrocirrata 0,2 Nephthys hombergii 0,2 Marphysa sanguinea 0,2 Tab. 4 - abbondanza percentuale delle specie all interno di ciascun cluster in estate. 162

163 Fig. 6 - Clusters di stazioni in estate ottenuti con la cluster analysis 163

164 Fig. 7 - Ordinamento delle stazioni e delle specie in autunno. Le aree colorate indicano I cluster di stazioni. 164

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