EREDITA EPIGENETICA ED IMPRINTING GENOMICO

Transcript

1 Talassemia β + causata da una mutazione di una G con una A in posizione 110 nel primo introne Questo porta alla creazione di un sito accettare di splicing anomalo, poiché la nuova sequenza contiene un AG. Come mostrato nella parte inferiore del diagramma, questo sistema di splicing è utilizzato all incirca il 90% delle volte. Soltanto il 10% del messaggero viene tagliato appropriatamente e dà origine a catene β-globiniche normali. Y = C o T; N = qualsiasi nucleotide. L AG invariabile nella sequenza accettare di consenso è stato sottolineato. Le linee verticali indicano la localizzazione dello splicing. Vantaggio dell eterozigote per l anemia falciforme: vedi pag. 20. EREDITA EPIGENETICA ED IMPRINTING GENOMICO L eredità epigenetica è causata da modificazioni del DNA o dei cromosomi che hanno luogo durante l ovogenesi, la spermatogenesi o i primi stadi di sviluppo embrionale. La modificazione di un gene o di un cromosoma ne altera l espressione. COMPENSAZIONE DELLA DOSE Per compensazione delle dosi s intende il fenomeno per cui il livello di espressione di geni localizzati sui cromosomi sessuali è paragonabile in entrambi i sessi, anche se maschi e femmine hanno un corredo diverso di cromosomi sessuali. Processo di inattivazione del cromosoma X Il processo di attivazione è attivo e inizia dal centro di inattivazione dell X (Xic), che contiene il gene XIST. Nel cromosoma X attivo il gene XIST resta inattivo. Il gene XIST viene quindi trascritto a partire dal cromosoma X inattivo. 1. Inizio: ha luogo durante lo sviluppo embrionale. Viene contato il numero di centri di inattivazione dell X (Xic), e uno dei cromosomi rimane attivo, mentre l altro viene individuato come bersaglio per l inattivazione. Si pensa che l individuazione dei cromosomi da inattivare sia dovuta a fattori bloccanti. 2. Diffusione: ha luogo durante lo sviluppo embrionale. Comincia nello Xic e progredisce verso entrambe le estremità finché non è stato inattivato l intero cromosoma X. 3. Mantenimento: ha luogo dallo stadio embrionale a tutta la vita adulta. Il cromosoma X inattivato viene mantenuto come tale (corpo di Barr) durante le successive divisioni cellulari. L mrna del gene XIST va a legarsi a diverse regioni del cromosoma X costituendo un nucleo di inattivazione: l mrna blocca l attività di tutti i geni del cromosoma X. In seguito vengono reclutati gli istoni H3 e H4, che vengono ipoacetilati provocando una condensazione del cromosoma. Posizione del gene XIST all interno della regione Xic del cromosoma X. 31

2 IMPRINTING GENOMICO Nell imprinting genomico, l espressione di un gene dipende dal sesso del genitore da cui è stato ereditato. Igf-2 è un gene che codifica un fattore di crescita (Insuline-like Growth Factor) murino che, se mutato (Igf-2m), determina il nanismo. Per questo carattere, gli incroci reciproci danno risultati diversi. eterozigote normale (è espresso solo l allele Igf-2) eterozigote nano (è espresso solo l allele Igf-2m) In questo caso, viene dunque espresso esclusivamente l allele ereditato dal padre. E evidente che gli alleli materni vengono in qualche modo marcati durante l ovogenesi in modo da impedire la loro espressione. Igf-2R è un gene che codifica il recettore per l Insuline-like Growth Factor murino che, se mutato (Igf-2Rm), determina il nanismo. Anche per questo carattere, gli incroci reciproci danno caratteri diversi. eterozigote nano (è espresso solo l allele Igf-2Rm) eterozigote normale (è espresso solo l alle Igf-2R) In questo caso viene dunque espresso esclusivamente l allele ereditato dalla madre. E evidente che gli alleli paterni vengono in qualche modo marcati durante la spermatogenesi in modo da impedire la loro espressione. Imprinting genomico materno e gametogenesi Gli alleli vengono marcati durante l ovogenesi la metilazione determina inattivazione del cromosoma La marcatura viene mantenuta durante tutto lo sviluppo La marcatura viene successivamente cancellata in entrambi i sessi La marcatura viene poi ripristinata solo negli ovociti Igf-2/Igf-2m* nelle cellule somatiche Igf-2/Igf-2m* nelle cellule somatiche ovogenesi spermatogenesi Igf-2* Igf-2* Igf-2m* Igf-2m* Igf-2 Igf-2 Igf-2m Igf-2m 32

3 Gene Allele espresso Funzione WT1 Materno Sopprime la proliferazione incontrollata di cellule del tumore di Wilms (nefroblastoma) INS Paterno Sintesi dell insulina, ormone che interviene nel metabolismo e nella proliferazione cellulare Igf-2 Paterno Fattore di crescita insulino-simile II Igf-2R Materno Recettore per Igf-2 H19 Materno Sconosciuta Snrpn Paterno Fattore di splicing Gabrb Materno Recettore per il GABA (neurotrasmettitore) IMPRINTING GENOMICO: SINDROME DI ANGELMAN (AS) E DI PRADER-WILLI (PW) Entrambe le sindromi sono causate da una delezione nel cromosoma

4 Sindrome di Angelman Sindrome di Prader-Willi Delezione del segmento 15q11 q13 del cromosoma 15 materno. Il gene per la ubiquitina ligasi (UBE3A) si trova nella regione cromosomica AS. Codifica un enzima chiave del sistema di degradazione delle proteine cellulari. La AS si manifesta in seguito a mutazioni di UBE3A che alterano il processo di degradazione delle proteine nello sviluppo cerebrale. Descrizione: anomalia del cromosoma 15 con microcefalia, grave ritardo mentale e alterazioni motorie, epilessia, atassia o anomalia anche completa della deambulazione, ipotonia muscolare, anomalie nell EEG e facies caratteristica, con ipertrofia della lingua e della mandibola, depressione occipitale, sclere blu. I bambini appaiono allegri e ridono spesso, senza motivo. I loro movimenti sono irregolari, a scatti, come quelli di una marionetta. Eredità autosomica recessiva. Comunemente diagnostica tra i 3 ed i 7 anni, quando le caratteristiche diventano particolarmente evidenti. Dovuta all assenza del segmento del braccio lungo del cromosoma 15 paterno. Alcuni geni localizzati nella regione cromosomica PWS codificano la small ribonucleoprotein N (SNRNP), coinvolta nella maturazione degli mrna. Nel 70% dei casi, il difetto è dovuto a delezione. Nel 25% dei casi, il difetto è dovuto a disomia parentale: una disomia parentale si ha quando tutti e due i cromosomi paterni o materni finiscono rispettivamente nello stesso spermatocita od ovocita, mentre l altro spermatocita od ovocita non riceve alcun cromosoma 15. Se c è trisomia del 15, ci può essere nelle prime divisioni dello zigote la perdita di uno di questi cromosomi disomia parentale. Nel 5% dei casi, il difetto è dovuto a mutazioni che alterano il processo di imprinting. Caratteristiche: ipotonia centrale neonatale ed infantile, con scarsa capacità suttoria che migliora con l età; problemi di deglutizione e scarso accrescimento nell infanzia; necessità di alimentazione forzata; tra i 12 mesi e i 6 anni, guadagno eccessivo di peso che determina obesità; iperfagia; caratteristiche facciali tipiche: diametro bifrontale scarso, fessure palpebrali a mandorla, bocca rivolta all ingiù; ipogonadismo: ipoplasia dei genitali: piccole labbra e clitoride ridotti nelle femmine; scroto ipoplastico e criptorchidismo nei maschi; pubertà incompleta e ritardata; sterilità; ritardo nello sviluppo, ritardo mentale lieve o moderato, ritardo nell apprendimento. GENI E MOLECOLE DEL COMPLESSO MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITA GENI E MOLECOLE DEL SISTEMA IMMUNITARIO MOLECOLE MHC DELLA SUPERFICIE CELLULARE GENI MHC Si trovano sul braccio corto del cromosoma 6 Le molecole MHC sono molecole transmembranarie coinvolte nel riconoscimento dell antigene nel corso della risposta immunitaria. Le molecole di classe I sono espresse sulla superficie di tutte le cellule somatiche nucleate (non sui gameti), e sono importanti nella tolleranza o nel rigetto dei trapianti, per prevenire il quale vengono utilizzati farmaci immunosoppressori. Porta legata in maniera non covalente una β 2 microglobulina. Le molecole di classe II sono dimeri e sono espresse solo in alcune cellule del sistema immunitario: monociti cellule dendritiche linfociti T Queste molecole conferiscono a ciascuno un individualità genetica e immunologica. La probabilità di trovare 2 persone compatibili è 1/20 miliardi. Ogni cellula somatica esprime 7 tipi diversi di molecole di classe I. I geni MHC sono altamente polimorfici nelle popolazioni umane: per ciascun locus esistono numerosi alleli; ad oggi: per il locus A: 123 definiti serologicamente e 282 come DNA per il locus B: 272 definiti serologicamente e 540 come DNA per il locus C: 8 definiti serologicamente e 136 come DNA per i loci E, F e G: 23 definiti a livello di DNA 34

5 La variabilità delle molecole MHC è quindi genetica, legata cioè alla presenza per ciascun locus di alleli che si esprimono in maniera codominante. A causa del linkage fra i 3 loci, le combinazioni alleliche tendono ad essere tramandate ai figli preferenzialmente nella disposizione parentale, cioè come aplotipo: successione di alleli raramente interessati da eventi di crossing-over. Naturalmente, occasionalmente possono verificarsi eventi di crossing-over che danno origine a gameti ricombinanti. I geni di classe I sono espressi sulla membrana plasmatica di tutte le cellule somatiche. Come tutte le molecole di membrana, anche le molecole di classe I sono sintetizzate nel RER. Nel viaggio verso la membrana plasmatica, nella tasca tra i domini α 1 e α 2, in cui c è un pavimento formato da foglietti β, vengono alloggiate tutte le molecole sintetizzate dalla cellula. Il solco delle molecole di classe I sporge verso l interno del RER: tutti i peptidi contenuti nel RER (perché sono stati prodotti lì o perché portati lì dai proteasomi) possono interagire con queste molecole. I peptidi viaggiano con le molecole di classe I vengono esposti sulla membrana. Se la cellula viene infettata da un virus, esprime sulla superficie anche i peptidi virali (esposizione dell antigene): la cellula viene riconosciuta dal sistema immunitario e uccisa dai linfociti T killer. Molti virus hanno come meccanismo di resistenza il fatto che inibiscono il trasporto delle molecole di classe I sulla membrana. Le molecole di classe II sono accoppiate al meccanismo di endocitosi e fagocitosi. La cellula segrega l antigene in un endosoma primario, che si fonde con un lisosoma a formare un endosoma secondario. L antigene viene degradato producendo dei peptidi, che vengono esposti sulla membrana in corrispondenza delle molecole di classe II. Questi peptidi reclutano i linfociti T helper, che attivano la risposta immunitaria nei confronti dell organismo responsabile dell infezione. I peptidi endogeni non arrivano sulle molecole di classe II perché le molecole HLA-DM bloccano il solco delle molecole di classe II stesse. 35

6 L interazione tra i peptidi e le molecole di classe I non riguarda tutti gli aminoacidi, ma soprattutto due residui, il 2 e il 9. Un virus sintetizza vari tipi di proteine (almeno 10), quindi ce ne sono quasi sempre una o più che hanno 2 aminoacidi in posizione tale da potersi collocare nel solco delle molecole di classe I. Si può quindi portare in superficie un repertorio piuttosto vasto di peptidi, permettendo una risposta immunitaria nei confronti di molti tipi di virus. Le molecole MHC di classe I espongono regioni degli antigeni estranei espressi attivamente dalle cellule somatiche e fanno sì che queste possano essere riconosciute ed eventualmente uccise dalle cellule killer del sistema immunitario. Le molecole MHC di classe II espongono regioni degli antigeni estranei catturati per endocitosi da cellule specializzate e fanno sì che queste possano interagire con le cellule del sistema immunitario per indurre la produzione di anticorpi specifici. GENI DELLE IMMUNOGLOBULINE Uno dei precursori negli studi sul sistema immunitario fu Jenner. Jenner osservò che il vaiolo vaccino assomigliava al vaiolo umano, ma non infettava l uomo e ne induceva invece un immunizzazione. Qualunque molecola iniettata induce una risposta. Il numero delle molecole contro le quali possiamo evocare una risposta anticorpale è di circa 1 miliardo, molte di più quindi dei geni. La variabilità è generata dal caso ed è clonotipica. La diversità dei recettori antigene-specifici viene generata nei linfociti B attraverso un meccanismo di riarrangiamento genico causale che produce una varietà praticamente infinita di recettori dotati di siti combinatori diversi (il repertorio immunologico). Questo repertorio è distribuito in maniera clonale: ogni linfocita esprime un solo tipo di recettore. Oltre ad alcune regioni costanti, l anticorpo ha delle regioni variabili. Nelle catene pesanti si hanno: geni V (variability): 300 geni D (diversity): 20 geni J (joining): 10 Nelle catene leggere: geni V: 300 geni J: 10 Le possibili combinazioni sono quindi: 300 x 20 x 10 x 300 x 10 = 180 milioni 36

7 La molecola viene assemblata all interno della cellula e le regioni V H e V L contribuiscono a formare il sito combinatorio. Ciascun sito combinatorio è espresso sulla superficie delle cellule immunocompetenti sotto forma di recettori clonotipica: un determinato antigene favorirà la proliferazione e la differenziazione di pochi cloni. La variabilità dei recettori per l antigene sui linfociti T è anch essa clonotipica. La natura casuale del meccanismo di generazione della diversità implica che il repertorio immunologico debba contenere recettori in grado di riconoscere sia l universo degli antigeni esterni, sia quello degli antigeni interni. FUNZIONI DEI GENI MHC Le molecole MHC di classe I sono espresse su tutte le cellule somatiche nucleate. Ciascun soggetto esprime, in maniera codominante, due alleli per ciascun locus. Le molecole MHC di classe I hanno un ruolo determinante nella risposta immunitaria cellulo-mediata (infezioni da virus, rigetto dei trapianti) e nella determinazione del repertorio immunologico di ciascun individuo (Self Non self). Questo paradigma presuppone che i linfociti T subiscano un processo di delezione clonale attraverso il quale quelli potenzialmente autoreattivi vengono o eliminati fisicamente (apoptosi) o resi incapaci di funzionare (anergia). La definizione del repertorio avverrebbe solo nelle primissime fasi dello sviluppo dell individuo. Solo linfociti capaci di riconoscere il sé inteso come MHC con affinità intermedia completano il loro percorso maturativo nel timo e vengono immessi in circolo. Il riconoscimento dell antigene da parte del linfocita T genera un segnale che determina la proliferazione e l attivazione clonale. I linfociti autoreattivi sono stati deleti nel timo, quindi non si ha risposta contro gli antigeni propri. I linfociti maturi hanno recettori che riconoscono il diverso da sé, quindi vengono attivati. 37

8 GENETICA QUANTITATIVA La genetica quantitativa studia i caratteri quantitativi, che si prestano ad essere analizzati per mezzo di parametri numerici. Esempi: caratteri anatomici: statura, peso, grado di pigmentazione caratteri fisiologici: livello di attività metabolica, velocità, produzione di latte o di uova caratteri comportamentali: rituali di accoppiamento, richiami di corteggiamento, apprendimento malattie complesse: diabete, ipertensione, obesità, malattie cardiovascolari A differenza di quanto accade con i caratteri discontinui, i caratteri quantitativi presentano un continuum di variabilità fenotipica all interno di un gruppo di individui. Il valore medio Uno dei concetti più importanti in probabilità e statistica è quello del valore medio di una variabile casuale. Nel caso di una variabile casuale discreta X, i cui valori possibili sono x 1, x 2, x n, il valore medio (µ) di X è definito, quando le probabilità sono tutte uguali, da: La varianza µ = (x 1 + x x n ) / n che viene definito la media aritmetica di X. La varianza è una misura della dispersione dei valori della variabile casuale attorno alla media µ. Se i valori sono concentrati vicino alla media, la varianza è piccola, mentre la varianza è grande se i valori sono dispersi lontano dalla media. La varianza è la sommatoria dei quadrati degli scarti rispetto alla media, divisa per il numero di gradi di libertà (di norma n 1). Var (X) = σ 2 = Σ (x µ) 2 / (n 1) cioè Var (X) = σ 2 = [(x 1 µ) 2 + (x 2 µ) (x n µ) 2 ] / (n -1) La deviazione standard Esempio di due distribuzioni aventi la stessa media e diversa varianza La deviazione standard è la radice quadrata positiva della varianza: σ = Var (X) In una distribuzione normale: il 68,27% dei dati rientra nella zona µ + σ il 95,45% dei dati rientra nella zona µ + 2σ il 99,73% dei dati rientra nella zona µ + 3σ Il rapporto µ/σ è una misura della fluttuazione attorno alla media. Confronto tra più variabili A volte è necessario confrontare tra loro variabili differenti per verificare se esista una correlazione tra queste. Per farlo, occorre calcolare la covarianza, che descrive quanto variano le due variabili nell ambito di un gruppo. CoV(X) = Σ (x x) 2 (y y) 2 / (n 1) dove x e y indicano i valori medi di ciascuna delle due variabili 38

9 Partendo dalla covarianza, è possibile stabilire quanto siano associate tra loro le due variabili, calcolando il coefficiente di correlazione: r(x,y) = CoV (x,y) / σ(x) * σ(y) Il coefficiente di correlazione varia tra -1 (correlazione inversa) e +1 (correlazione positiva). Valori che si avvicinino più allo 0 indicano assenza di correlazione. Tuttavia, il coefficiente di correlazione va rapportato al numero di gradi di libertà: infatti, la significatività del coefficiente di correlazione è in diretto rapporto con le dimensioni del campione e con il gradi di libertà (GL). Per la verifica della significatività dei coefficienti di correlazione GL = n 2 GL 5% 1% 1 0, ,95 0,99 3 0,878 0, ,811 0, ,754 0, ,707 0, ,666 0, ,632 0, ,602 0, ,576 0, ,553 0, ,532 0, ,514 0, ,497 0, ,482 0,606 In questa tabella sono riportati i valori limite di significatività (al 5% e all 1%) per quanto riguarda il coefficiente di correlazione a diversi gradi di libertà. Se i valori ottenuti sono inferiori a quelli riportati in tabella, è probabile che la correlazione osservata sia dovuta al caso. Se i valori osservati sono superiori, la correlazione è probabilmente (al 95% o al 99%) vera. Un certo allele può aumentare il rischio per una malattia. Per stabilire se esista una correlazione occorre confrontare la frequenza dell allele nei sani e nei malati. Rischio relativo = malati che presentano l allele sani che presentano l allele malati totali / sani totali Rischio assoluto = 1 1 rischio relativo EREDITA POLIGENICA Il termine eredità poligenico designa la trasmissione di caratteri che sono determinati da due o più geni. Il colore del tegumento del frumento è un esempio di carattere poligenico determinato da 3 geni diversi con effetto additivo. Ciascun gene ha un allele per il colore rosso e uno per il colore bianco. Il risultato di un incrocio fra due triibridi sarà una gamma di fenotipi che vanno dal rosso molto intenso fino al bianco. Effetto dell ambiente su caratteri quantitativi Nel caso di un carattere dovuto ad un singolo gene, l effetto dell ambiente, pur facendosi sentire, non è tale da mascherare sostanzialmente il contributo genetico. L effetto dell ambiente può essere rilevante nel caso in cui il carattere quantitativo sia controllato da più geni con effetto additivo. 39

10 Nel caso di caratteri poligenico quantitativi, dunque, la variabilità è caratterizzata da una componente genetica e da una componente ambientale. varianza totale = varianza genetica + varianza ambientale V T = V G + V A Esistono ceppi di animali singenici, cioè geneticamente uniformi, ottenuti mediante incroci fratello-sorella per numerose generazioni. In questi ceppi, la varianza genetica può essere considerata nulla. Per quanto riguarda alcuni caratteri quantitativi, è possibile in questi casi determinare la quota di varianza dovuta a fattori ambientali. Supponiamo ad esempio di aver determinato il peso corporeo in un gruppo di topi singenici ed in un gruppo di topi outbred (non singenici) allevati nelle stesse condizioni ambientali e di avere ottenuto i seguenti valori di varianza: V T = 225 g 2 per i topi singenici V T = 400 g 2 per i topi outbred V T = V A per i topi singenici perché V G è nulla V G = ( ) g 2 = 175 g 2 per i topi outbred perché V A è pari a quella dei topi singenici L ereditabilità è una misura della quota di variazione fenotipica dovuta a fattori genetici: H B 2 = V G /V T H B 2 : ereditabilità V G : varianza genetica V T : varianza totale LOD SCORE Ad ogni evento di fecondazione, la probabilità che lo zigote sia maschio oppure femmina è 1/2. p = probabilità che sia maschio. q = probabilità che sia femmina. La probabilità di ottenere questo risultato per puro caso esattamente in quest ordine (prima figlia femmina, 5 figli maschi e ultima figlia femmina) è p 5 q 2, cioè (1/2) 5 x (1/2) 2 = 0, La probabilità di trovare una famiglia di 7 figli con quella distribuzione di maschi e femmine è invece: 21p 5 x q 2 = 0,164. Triangolo di Tartaglia Supponiamo di avere un soggetto eterozigote per due loci indipendenti: Secondo la legge dell indipendenza, ci aspettiamo che questo soggetto produca 4 tipi di gameti nelle stesse proporzioni (probabilità = 0,25% ciascuno). Se incrociamo questo eterozigote con un omozigote doppio recessivo (reincrocio o test-cross), ci aspettiamo nei figli proporzioni che rispettino le proporzioni tra i gameti. Gameti prodotti dall eterozigote In quest albero genealogico troviamo valori che si discostano dal risultato atteso sulla base dell ipotesi dell indipendenza. Qual è la probabilità di ottenere questo risultato semplicemente per caso? Per convenzione, definiamo: AB e ab: combinazioni parentali; Ab e ab: combinazioni ricombinanti. 40